引用本文： 代號, 陳波, 金偉, 劉敏. 熱休克蛋白 70 及膠質纖維酸性蛋白表達比值與大鼠腦震蕩傷后損傷時間關系的研究. 華西醫學, 2017, 32(12): 1890-1894. doi: 10.7507/1002-0179.201611100 復制
腦震蕩屬于腦損傷中比較常見的類型，但目前腦震蕩的法醫病理學診斷及損傷時間推斷仍為法醫病理學中的困難問題之一。研究發現腦震蕩后，許多指標的表達具有時序性的變化規律[1-2]，但這些研究大多僅觀察了腦震蕩傷后某一種指標的表達變化。由于單一指標的表達曲線大多呈先升高，達到峰值后逐漸降低的規律，其同一個表達值可能對應曲線上升段的某一時間點，也可能對應曲線下降段的某一時間點。因此，這種單一指標的表達規律難以用于腦震蕩的損傷時間推斷。胡玉蓮等[3]研究大鼠腦挫傷后 C-FOS、水通道蛋白-4 的表達比值變化以推斷損傷時間，結果顯示當二者的表達比值>1 時，推斷損傷時間≤24 h；當二者比值<1 時，損傷時間>24 h 的可能性大。該研究提示聯合應用多種在腦震蕩傷后不同時間先后表達的指標進行損傷時間的推斷具有進一步的研究價值。本實驗擬通過建立大鼠腦震蕩模型，對腦震蕩后不同時間的大鼠腦組織進行熱休克蛋白（heat shock protein，HSP）70 及膠質纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）免疫組織化學染色，檢測 HSP70 及 GFAP 在不同時相的表達情況，建立前述兩種指標在時間順序上的比值關系，以期為推斷腦震蕩的損傷時間積累研究資料，提供新的思路。現報告如下。
1 材料與方法
1.1 實驗動物
無特定病原體級 Sprague-Dawley 大鼠 60 只，由四川大學實驗動物中心提供，封閉群，雌雄各半，體質量 180～200 g，屏障系統飼養，溫度 24～26 ℃，相對濕度 60%～70%，逐日觀察健康狀況，大鼠的處理符合實驗動物倫理準則。
1.2 主要材料和儀器
主要試劑：兔抗大鼠 HSP70、GFAP 多克隆抗體（英國 BeacomBio 公司），即用型鏈霉親和素-生物素復合物（strept avidin-biotin complex，SABC）免疫組織化學試劑盒、即用型二氨基聯苯胺顯色試劑盒、蘇木素、0.01 mol/L 磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）（武漢博士德公司），4% 多聚甲醛（成都科龍化工試劑廠）。
主要儀器：10、100、1 000 μL 微量移液器（芬蘭 Biohit 公司），Leica RM2235石蠟切片機、Leica ASP300S組織脫水機、Leica 光學生物顯微鏡（德國 Leica 公司），WD750ASL23 微波爐（廣東格蘭仕公司），BS201S 電子天平（德國 Sartorius 公司），BCD-265WM 冰箱（韓國 Samsung 公司），Image Pro-Plus 6.0 顯微圖像分析軟件，自制自由落體式大鼠腦震蕩打擊裝置。
1.3 動物分組及實驗模型制作
根據處死時間的不同，實驗組大鼠分為 0.5、1、3、6、12、24、48、96、168、240、336 h 共 11 組，每組 5 只；另 5 只大鼠作對照組。
實驗模型參照改良 Marmarou 自由落體打擊致傷模型[4]。采用乙醚吸入方式麻醉大鼠，將大鼠俯臥位固定于緩沖墊上，從 50 cm 高處釋放 200 g 砝碼，打擊大鼠頭頂部雙耳連線的中點處。觀察并記錄大鼠打擊前后的意識狀態、呼吸、肢體運動狀態、角膜反射、痛刺激反射的變化情況，以及恢復時間和恢復狀態。實驗組大鼠被打擊后，經正常飼養，在規定的傷后時間予以灌注 4% 多聚甲醛溶液處死。解剖取出大鼠腦組織，于 4% 多聚甲醛溶液中固定 24 h 后對腦組織進行取材，常規石蠟包埋、切片。
1.4 腦震蕩的判斷標準
打擊之后出現以下表現可判斷為腦震蕩傷：① 短暫的意識障礙，30 min 內恢復；② 短暫的呼吸暫停或減弱，20 s 內恢復；③ 短暫的角膜反射、痛刺激反射消失，3 min 內恢復；④ 無遺留運動功能障礙；⑤ 肉眼及組織學觀察均無腦挫傷灶。
1.5 染色方法
采用常規方法進行蘇木素-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色。按照 SABC 試劑盒說明書進行免疫組織化學染色，一抗為兔抗鼠 HSP70 及 GFAP 多克隆抗體，一抗工作滴度均為 1∶400，陰性對照使用 PBS 代替 HSP70 及 GFAP 進行孵育。
1.6 圖像采集
HSP70 陽性表達為神經元和神經膠質細胞的細胞質內均勻分布的黃色至棕褐色細小顆粒；GFAP 陽性表達為星形膠質細胞細胞質和星狀突起內均勻分布的黃色至棕褐色細小顆粒。使用 Leica 光學顯微鏡閱片、采集圖像，在高倍（×400）條件下，每張切片隨機選取 10 個視野進行照相并儲存。采用圖像分析軟件對每個視野中陽性表達的陽性細胞數目、總細胞數目、陽性反應產物面積及積分光密度值進行檢測進行檢測，計算陽性細胞率和平均光密度值（average optical density，AOD），陽性細胞率=陽性細胞數目/總細胞數目，AOD=積分光密度值/陽性反應產物面積。
1.7 統計學方法
使用 SPSS 19.0 軟件進行統計分析。計量資料采用均數±標準差表示，組間比較行單因素方差分析和 t 檢驗。檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 大鼠的臨床表現
實驗組大鼠經砝碼打擊后的臨床表現均符合腦震蕩的判斷標準，包括短暫的意識障礙，意識在數秒鐘至 20 min 內恢復；呼吸頻率的減慢或暫停，均在 20 s 內恢復；角膜反射和痛刺激反射減弱或消失，并于 3 min 內恢復。55 只大鼠全部存活至預計時間點，且未遺留任何運動功能障礙。對照組大鼠無明顯改變。
2.2 大鼠腦組織肉眼及組織學檢查結果
實驗組所有大鼠均無腦挫傷改變，僅個別大鼠出現少許蛛網膜下腔出血。對照組大鼠無明顯改變。
2.3 HSP70 免疫組織化學染色結果
對照組腦組織內可見少量 HSP70 陽性表達，陽性細胞率為 13.57%、AOD 值為 0.073，染色主要位于神經細胞的細胞質內。實驗組于傷后 0.5 h 即發現 HSP70 陽性細胞數目和染色強度增加，陽性細胞率和 AOD 值開始升高，且明顯高于對照組（P<0.05）；傷后 12 h，陽性細胞率和 AOD 值達峰值，均值分別為 70.17%、0.384，之后陽性細胞數目減少，染色強度減弱，至傷后 336 h，陽性細胞率降至 28.61%，AOD 值降至 0.159，但二者仍高于對照組（P<0.05）。見表 1、圖 1。
表1
腦震蕩傷后不同時間 HSP70 陽性細胞率和 AOD 值（
）
圖1
腦組織 HSP70 免疫組織化學染色（×400）
a. 對照組僅有少量神經細胞見 HSP70 陽性表達，主要表達在細胞質內，染色強度較弱；b. 傷后 12 h 組，大部分神經細胞內均見 HSP70 強陽性表達，染色強度達到最強；c. 傷后 336 h 組，神經細胞內 HSP70 的表達減弱，但陽性染色的細胞數仍較對照組多，染色強度較對照組強
2.4 GFAP 免疫組化染色結果
對照組腦組織內可見少量 GFAP 陽性表達，陽性細胞率為 2.19%、AOD 值為 0.040，染色主要位于星形膠質細胞的細胞質和突起內。實驗組傷后 0.5、1、3 h，GFAP 陽性細胞率及 AOD 值與對照組比較差異無統計學意義（P>0.05）；傷后 6 h，GFAP 陽性細胞數目增加，染色增強，膠質細胞的突起增粗、變長；傷后 48 h，陽性細胞率和 AOD 值均達到最大值，分別為 38.96%、0.630，隨后陽性細胞數目減少，染色強度逐漸減弱，膠質細胞突起變得短而細，陽性細胞率和 AOD 值又呈下降趨勢，直至傷后 336 h，分別降至 18.07%、0.299，仍高于對照組（P<0.05）（圖 2、表 2）。
表2
腦震蕩傷后不同時間 GFAP 陽性細胞率和 AOD 值（
）
圖2
腦組織 GFAP 免疫組織化學染色（×400）
a. 對照組僅有個別星形膠質細胞內見 GFAP 陽性表達，染色強度較弱；b. 傷后 48 h 組，大部分星形膠質細胞內均見 GFAP 陽性表達，染色強度達最強；c. 傷后 336 h 組，星形膠質細胞內 GFAP 陽性表達減弱，但陽性細胞數仍較對照組多，染色強度較對照組強
2.5 HSP70 與 GFAP 陽性細胞率的比值
二者的比值關系呈上升-下降-波動的變化趨勢。傷后 0.5～3 h，HSP70 陽性細胞率快速升高，而 GFAP 陽性細胞率無明顯變化，二者的比值從 7.15 快速升高至 11.73；傷后 3～48 h，HSP70 陽性細胞率先升高后降低，GFAP 陽性細胞率逐漸升高，二者的比值逐漸下降至 1.53，其中 3～24 h 二者比值降低速率較快，而 24～48 h 二者比值降低的速率較慢；傷后 48～336 h，HSP70 與 GFAP 的陽性細胞率均逐漸降低，且降低的速率相似，二者的比值亦相對穩定，僅在 1.44～1.69 小幅波動（圖 3）。
圖3
腦震蕩后不同時間點 HSP70 與 GFAP 陽性細胞率的及其比值的柱形圖
3 討論
?
生物機體當受到熱力、酸堿、機械性創傷、感染、毒物、缺血缺氧等多種應激源作用時，均可誘導細胞合成 HSP70，以此維持機體生理功能，幫助細胞抵御各種損害。據一項 87 例挫傷人腦的研究報道，0.5～3 h 遠離挫傷部位的 HSP70 表達呈陽性，24 h 時陽性細胞數目最多，陽性反應最強，至 14 d 時陽性表達與對照組接近[5]；其研究結果提示腦損傷后早期 HSP70 即出現陽性表達，其達到峰值的時間較早。Zhang 等[6]采用鐵棒打擊大鼠頭頂部，于傷后 4 h 發現頂葉損傷區域 HSP70 表達最強，枕葉和小腦次之，腦干內僅有少量神經細胞呈 HSP70 陽性表達。當腦組織受到損傷或者外界刺激時，星形膠質細胞會呈現反應性的增生，行使神經纖維的修復、突觸重塑、神經元的再生等神經恢復功能，伴隨著星形膠質細胞的增生，GFAP 的表達也會上調[7]。有文獻報道腦損傷后 3 h 左右 GFAP 出現陽性表達，傷后 3～7 d 陽性表達達到峰值[8]。Stewart 等[9]報道，與正常新生兒比較，腦室旁白質損傷的患兒出生第 1 天即可檢測到血中 GFAP 濃度明顯升高，于出生后第 2 天達到高峰。根據前述既往研究，HSP70 和 GFAP 在腦損傷后均出現了一定的時序性表達規律，推測這兩種指標可在一定程度上推斷腦損傷的時間；腦損傷后 HSP70 比 GFAP 更早出現陽性表達，HSP70 陽性表達的峰值也比 GFAP 陽性表達的峰值較早出現，故二者的比值有可能隨著損傷時間的推移而出現規律性的變化。
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HSP 是細胞在熱應激、機械性損傷、微生物感染、重金屬中毒、缺血缺氧等因素的作用下，由 HSP 基因編碼并表達而合成的一類蛋白質。HSP70 根據其表達方式分為結構型 HSP70 和誘導型 HSP70 兩大類，結構型 HSP70 能在正常細胞中持續且穩定地表達，發揮細胞管家的作用，其表達減少、消失或過量都有可能激活細胞凋亡或死亡信號通路[10]。在病理狀態時，誘導型 HSP70 合成增多，能提高機體耐受性、抗細胞凋亡、參與免疫反應等[11]。曾麗容等[12]觀察急性顱腦損傷患者腦脊液中 HSP70 的動態變化，傷后 1 h 開始 HSP70 表達較對照組增高，第 3 天濃度達到峰值，傷后 7 d 表達量降低，重度、中度及輕度損傷組間差異均有統計學意義，提示其可作為反映腦損傷嚴重程度和轉歸的評價指標，該結果與本研究中 12 h 組 HSP70 的表達量達高峰不同，可能與不同研究檢測 HSP70 表達所提取的檢材不同有關。金偉等[13]對大鼠腦震蕩傷后腦外主要器官（心、肝、脾、肺、腎）中 HSP70 的表達情況進行研究，發現隨震蕩傷后時間的延長，HSP70 的表達亦增加，于傷后 12 h 達峰，之后下降。陳銳等[14]使用免疫組織化學方法檢測大鼠腦震蕩傷后腦組織內 HSP70 表達的變化，發現傷后 1 h 左右 HSP70 陽性表達顯著增強，傷后 12 h 陽性細胞數目最多，染色最強，傷后 1 d 開始陽性細胞數目逐漸減少，染色變淺。本研究顯示 HSP70 在傷后早期即出現表達增強，并在短時間內可達到陽性表達高峰，與既往研究反映出相似的表達變化規律。
研究人員從多發性硬化斑塊中分離提純出一種酸性蛋白，并將其命名為 GFAP。郝芳芳等[15]檢測蛛網膜下腔出血患者血清中 GFAP 蛋白表達水平，結果顯示傷后第 1 天 GFAP 有少量表達，第 2 天表達水平達到峰值，同時血清 GFAP 表達水平與傷者的預后呈負相關。一項動物實驗對大鼠爆炸相關創傷性腦損傷后不同時間血清 GFAP 蛋白水平進行檢測，結果顯示損傷組大鼠血清 GFAP 水平較對照組升高，于傷后 24 h 達到高峰，在傷后 6 d 仍可檢測到明顯高于對照組的 GFAP 水平[16]。Singh 等[17]研究發現大鼠輕型腦損傷后 3 d 和 5 d 大腦皮質內 GFAP 陽性表達的星形膠質細胞數目較對照組明顯增加。本研究中腦震蕩后早期 GFAP 陽性表達無明顯增強，GFAP 表達的高峰出現于 48 h，出現表達高峰的時間與前述的研究存在一定差異，考慮這種差異可能與致傷方式、打擊力量以及顱腦損傷的輕重不同有關。
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本研究結果顯示腦震蕩傷后 HSP70 與 GFAP 陽性細胞率的比值快速升高，至傷后 3 h 達最大值 11.73，隨后該比值又迅速降低，傷后 48 h 開始二者比值明顯降低且相對穩定，僅在一個較小范圍內波動。根據二者比值的變化規律，結合同一時段內 HSP70 與 GFAP 的陽性細胞率升降規律，顯示當 HSP70 與 GFAP 陽性細胞率的比值明顯升高，且 HSP70 陽性細胞率亦顯著升高，但 GFAP 陽性細胞率無明顯改變時，提示損傷時間在傷后 0.5～3 h；當二者比值較大，HSP70 與 GFAP 陽性細胞率均有明顯升高時，可推斷損傷時間在傷后 3～12 h；當二者比值減少，HSP70 與 GFAP 陽性細胞率仍高于正常值時，損傷時間大致在傷后 12 h 以后。
本研究發現，應用單一指標的陽性細胞率變化規律難以確定腦震蕩損傷時間的范圍，但在結合二者的比值關系進行分析后，盡管仍不能得出準確的損傷時間的時間點，但可在一定程度上推斷出損傷時間的大致范圍；說明此方法在腦震蕩傷損傷時間的推斷中具有一定可行性，有望進一步細化損傷時間范圍以提高其推斷的準確度。
腦震蕩屬于腦損傷中比較常見的類型，但目前腦震蕩的法醫病理學診斷及損傷時間推斷仍為法醫病理學中的困難問題之一。研究發現腦震蕩后，許多指標的表達具有時序性的變化規律[1-2]，但這些研究大多僅觀察了腦震蕩傷后某一種指標的表達變化。由于單一指標的表達曲線大多呈先升高，達到峰值后逐漸降低的規律，其同一個表達值可能對應曲線上升段的某一時間點，也可能對應曲線下降段的某一時間點。因此，這種單一指標的表達規律難以用于腦震蕩的損傷時間推斷。胡玉蓮等[3]研究大鼠腦挫傷后 C-FOS、水通道蛋白-4 的表達比值變化以推斷損傷時間，結果顯示當二者的表達比值>1 時，推斷損傷時間≤24 h；當二者比值<1 時，損傷時間>24 h 的可能性大。該研究提示聯合應用多種在腦震蕩傷后不同時間先后表達的指標進行損傷時間的推斷具有進一步的研究價值。本實驗擬通過建立大鼠腦震蕩模型，對腦震蕩后不同時間的大鼠腦組織進行熱休克蛋白（heat shock protein，HSP）70 及膠質纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）免疫組織化學染色，檢測 HSP70 及 GFAP 在不同時相的表達情況，建立前述兩種指標在時間順序上的比值關系，以期為推斷腦震蕩的損傷時間積累研究資料，提供新的思路。現報告如下。
1 材料與方法
1.1 實驗動物
無特定病原體級 Sprague-Dawley 大鼠 60 只，由四川大學實驗動物中心提供，封閉群，雌雄各半，體質量 180～200 g，屏障系統飼養，溫度 24～26 ℃，相對濕度 60%～70%，逐日觀察健康狀況，大鼠的處理符合實驗動物倫理準則。
1.2 主要材料和儀器
主要試劑：兔抗大鼠 HSP70、GFAP 多克隆抗體（英國 BeacomBio 公司），即用型鏈霉親和素-生物素復合物（strept avidin-biotin complex，SABC）免疫組織化學試劑盒、即用型二氨基聯苯胺顯色試劑盒、蘇木素、0.01 mol/L 磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）（武漢博士德公司），4% 多聚甲醛（成都科龍化工試劑廠）。
主要儀器：10、100、1 000 μL 微量移液器（芬蘭 Biohit 公司），Leica RM2235石蠟切片機、Leica ASP300S組織脫水機、Leica 光學生物顯微鏡（德國 Leica 公司），WD750ASL23 微波爐（廣東格蘭仕公司），BS201S 電子天平（德國 Sartorius 公司），BCD-265WM 冰箱（韓國 Samsung 公司），Image Pro-Plus 6.0 顯微圖像分析軟件，自制自由落體式大鼠腦震蕩打擊裝置。
1.3 動物分組及實驗模型制作
根據處死時間的不同，實驗組大鼠分為 0.5、1、3、6、12、24、48、96、168、240、336 h 共 11 組，每組 5 只；另 5 只大鼠作對照組。
實驗模型參照改良 Marmarou 自由落體打擊致傷模型[4]。采用乙醚吸入方式麻醉大鼠，將大鼠俯臥位固定于緩沖墊上，從 50 cm 高處釋放 200 g 砝碼，打擊大鼠頭頂部雙耳連線的中點處。觀察并記錄大鼠打擊前后的意識狀態、呼吸、肢體運動狀態、角膜反射、痛刺激反射的變化情況，以及恢復時間和恢復狀態。實驗組大鼠被打擊后，經正常飼養，在規定的傷后時間予以灌注 4% 多聚甲醛溶液處死。解剖取出大鼠腦組織，于 4% 多聚甲醛溶液中固定 24 h 后對腦組織進行取材，常規石蠟包埋、切片。
1.4 腦震蕩的判斷標準
打擊之后出現以下表現可判斷為腦震蕩傷：① 短暫的意識障礙，30 min 內恢復；② 短暫的呼吸暫停或減弱，20 s 內恢復；③ 短暫的角膜反射、痛刺激反射消失，3 min 內恢復；④ 無遺留運動功能障礙；⑤ 肉眼及組織學觀察均無腦挫傷灶。
1.5 染色方法
采用常規方法進行蘇木素-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色。按照 SABC 試劑盒說明書進行免疫組織化學染色，一抗為兔抗鼠 HSP70 及 GFAP 多克隆抗體，一抗工作滴度均為 1∶400，陰性對照使用 PBS 代替 HSP70 及 GFAP 進行孵育。
1.6 圖像采集
HSP70 陽性表達為神經元和神經膠質細胞的細胞質內均勻分布的黃色至棕褐色細小顆粒；GFAP 陽性表達為星形膠質細胞細胞質和星狀突起內均勻分布的黃色至棕褐色細小顆粒。使用 Leica 光學顯微鏡閱片、采集圖像，在高倍（×400）條件下，每張切片隨機選取 10 個視野進行照相并儲存。采用圖像分析軟件對每個視野中陽性表達的陽性細胞數目、總細胞數目、陽性反應產物面積及積分光密度值進行檢測進行檢測，計算陽性細胞率和平均光密度值（average optical density，AOD），陽性細胞率=陽性細胞數目/總細胞數目，AOD=積分光密度值/陽性反應產物面積。
1.7 統計學方法
使用 SPSS 19.0 軟件進行統計分析。計量資料采用均數±標準差表示，組間比較行單因素方差分析和 t 檢驗。檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 大鼠的臨床表現
實驗組大鼠經砝碼打擊后的臨床表現均符合腦震蕩的判斷標準，包括短暫的意識障礙，意識在數秒鐘至 20 min 內恢復；呼吸頻率的減慢或暫停，均在 20 s 內恢復；角膜反射和痛刺激反射減弱或消失，并于 3 min 內恢復。55 只大鼠全部存活至預計時間點，且未遺留任何運動功能障礙。對照組大鼠無明顯改變。
2.2 大鼠腦組織肉眼及組織學檢查結果
實驗組所有大鼠均無腦挫傷改變，僅個別大鼠出現少許蛛網膜下腔出血。對照組大鼠無明顯改變。
2.3 HSP70 免疫組織化學染色結果
對照組腦組織內可見少量 HSP70 陽性表達，陽性細胞率為 13.57%、AOD 值為 0.073，染色主要位于神經細胞的細胞質內。實驗組于傷后 0.5 h 即發現 HSP70 陽性細胞數目和染色強度增加，陽性細胞率和 AOD 值開始升高，且明顯高于對照組（P<0.05）；傷后 12 h，陽性細胞率和 AOD 值達峰值，均值分別為 70.17%、0.384，之后陽性細胞數目減少，染色強度減弱，至傷后 336 h，陽性細胞率降至 28.61%，AOD 值降至 0.159，但二者仍高于對照組（P<0.05）。見表 1、圖 1。
表1
腦震蕩傷后不同時間 HSP70 陽性細胞率和 AOD 值（
）
圖1
腦組織 HSP70 免疫組織化學染色（×400）
a. 對照組僅有少量神經細胞見 HSP70 陽性表達，主要表達在細胞質內，染色強度較弱；b. 傷后 12 h 組，大部分神經細胞內均見 HSP70 強陽性表達，染色強度達到最強；c. 傷后 336 h 組，神經細胞內 HSP70 的表達減弱，但陽性染色的細胞數仍較對照組多，染色強度較對照組強
2.4 GFAP 免疫組化染色結果
對照組腦組織內可見少量 GFAP 陽性表達，陽性細胞率為 2.19%、AOD 值為 0.040，染色主要位于星形膠質細胞的細胞質和突起內。實驗組傷后 0.5、1、3 h，GFAP 陽性細胞率及 AOD 值與對照組比較差異無統計學意義（P>0.05）；傷后 6 h，GFAP 陽性細胞數目增加，染色增強，膠質細胞的突起增粗、變長；傷后 48 h，陽性細胞率和 AOD 值均達到最大值，分別為 38.96%、0.630，隨后陽性細胞數目減少，染色強度逐漸減弱，膠質細胞突起變得短而細，陽性細胞率和 AOD 值又呈下降趨勢，直至傷后 336 h，分別降至 18.07%、0.299，仍高于對照組（P<0.05）（圖 2、表 2）。
表2
腦震蕩傷后不同時間 GFAP 陽性細胞率和 AOD 值（
）
圖2
腦組織 GFAP 免疫組織化學染色（×400）
a. 對照組僅有個別星形膠質細胞內見 GFAP 陽性表達，染色強度較弱；b. 傷后 48 h 組，大部分星形膠質細胞內均見 GFAP 陽性表達，染色強度達最強；c. 傷后 336 h 組，星形膠質細胞內 GFAP 陽性表達減弱，但陽性細胞數仍較對照組多，染色強度較對照組強
2.5 HSP70 與 GFAP 陽性細胞率的比值
二者的比值關系呈上升-下降-波動的變化趨勢。傷后 0.5～3 h，HSP70 陽性細胞率快速升高，而 GFAP 陽性細胞率無明顯變化，二者的比值從 7.15 快速升高至 11.73；傷后 3～48 h，HSP70 陽性細胞率先升高后降低，GFAP 陽性細胞率逐漸升高，二者的比值逐漸下降至 1.53，其中 3～24 h 二者比值降低速率較快，而 24～48 h 二者比值降低的速率較慢；傷后 48～336 h，HSP70 與 GFAP 的陽性細胞率均逐漸降低，且降低的速率相似，二者的比值亦相對穩定，僅在 1.44～1.69 小幅波動（圖 3）。
圖3
腦震蕩后不同時間點 HSP70 與 GFAP 陽性細胞率的及其比值的柱形圖
3 討論
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生物機體當受到熱力、酸堿、機械性創傷、感染、毒物、缺血缺氧等多種應激源作用時，均可誘導細胞合成 HSP70，以此維持機體生理功能，幫助細胞抵御各種損害。據一項 87 例挫傷人腦的研究報道，0.5～3 h 遠離挫傷部位的 HSP70 表達呈陽性，24 h 時陽性細胞數目最多，陽性反應最強，至 14 d 時陽性表達與對照組接近[5]；其研究結果提示腦損傷后早期 HSP70 即出現陽性表達，其達到峰值的時間較早。Zhang 等[6]采用鐵棒打擊大鼠頭頂部，于傷后 4 h 發現頂葉損傷區域 HSP70 表達最強，枕葉和小腦次之，腦干內僅有少量神經細胞呈 HSP70 陽性表達。當腦組織受到損傷或者外界刺激時，星形膠質細胞會呈現反應性的增生，行使神經纖維的修復、突觸重塑、神經元的再生等神經恢復功能，伴隨著星形膠質細胞的增生，GFAP 的表達也會上調[7]。有文獻報道腦損傷后 3 h 左右 GFAP 出現陽性表達，傷后 3～7 d 陽性表達達到峰值[8]。Stewart 等[9]報道，與正常新生兒比較，腦室旁白質損傷的患兒出生第 1 天即可檢測到血中 GFAP 濃度明顯升高，于出生后第 2 天達到高峰。根據前述既往研究，HSP70 和 GFAP 在腦損傷后均出現了一定的時序性表達規律，推測這兩種指標可在一定程度上推斷腦損傷的時間；腦損傷后 HSP70 比 GFAP 更早出現陽性表達，HSP70 陽性表達的峰值也比 GFAP 陽性表達的峰值較早出現，故二者的比值有可能隨著損傷時間的推移而出現規律性的變化。
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HSP 是細胞在熱應激、機械性損傷、微生物感染、重金屬中毒、缺血缺氧等因素的作用下，由 HSP 基因編碼并表達而合成的一類蛋白質。HSP70 根據其表達方式分為結構型 HSP70 和誘導型 HSP70 兩大類，結構型 HSP70 能在正常細胞中持續且穩定地表達，發揮細胞管家的作用，其表達減少、消失或過量都有可能激活細胞凋亡或死亡信號通路[10]。在病理狀態時，誘導型 HSP70 合成增多，能提高機體耐受性、抗細胞凋亡、參與免疫反應等[11]。曾麗容等[12]觀察急性顱腦損傷患者腦脊液中 HSP70 的動態變化，傷后 1 h 開始 HSP70 表達較對照組增高，第 3 天濃度達到峰值，傷后 7 d 表達量降低，重度、中度及輕度損傷組間差異均有統計學意義，提示其可作為反映腦損傷嚴重程度和轉歸的評價指標，該結果與本研究中 12 h 組 HSP70 的表達量達高峰不同，可能與不同研究檢測 HSP70 表達所提取的檢材不同有關。金偉等[13]對大鼠腦震蕩傷后腦外主要器官（心、肝、脾、肺、腎）中 HSP70 的表達情況進行研究，發現隨震蕩傷后時間的延長，HSP70 的表達亦增加，于傷后 12 h 達峰，之后下降。陳銳等[14]使用免疫組織化學方法檢測大鼠腦震蕩傷后腦組織內 HSP70 表達的變化，發現傷后 1 h 左右 HSP70 陽性表達顯著增強，傷后 12 h 陽性細胞數目最多，染色最強，傷后 1 d 開始陽性細胞數目逐漸減少，染色變淺。本研究顯示 HSP70 在傷后早期即出現表達增強，并在短時間內可達到陽性表達高峰，與既往研究反映出相似的表達變化規律。
研究人員從多發性硬化斑塊中分離提純出一種酸性蛋白，并將其命名為 GFAP。郝芳芳等[15]檢測蛛網膜下腔出血患者血清中 GFAP 蛋白表達水平，結果顯示傷后第 1 天 GFAP 有少量表達，第 2 天表達水平達到峰值，同時血清 GFAP 表達水平與傷者的預后呈負相關。一項動物實驗對大鼠爆炸相關創傷性腦損傷后不同時間血清 GFAP 蛋白水平進行檢測，結果顯示損傷組大鼠血清 GFAP 水平較對照組升高，于傷后 24 h 達到高峰，在傷后 6 d 仍可檢測到明顯高于對照組的 GFAP 水平[16]。Singh 等[17]研究發現大鼠輕型腦損傷后 3 d 和 5 d 大腦皮質內 GFAP 陽性表達的星形膠質細胞數目較對照組明顯增加。本研究中腦震蕩后早期 GFAP 陽性表達無明顯增強，GFAP 表達的高峰出現于 48 h，出現表達高峰的時間與前述的研究存在一定差異，考慮這種差異可能與致傷方式、打擊力量以及顱腦損傷的輕重不同有關。
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本研究結果顯示腦震蕩傷后 HSP70 與 GFAP 陽性細胞率的比值快速升高，至傷后 3 h 達最大值 11.73，隨后該比值又迅速降低，傷后 48 h 開始二者比值明顯降低且相對穩定，僅在一個較小范圍內波動。根據二者比值的變化規律，結合同一時段內 HSP70 與 GFAP 的陽性細胞率升降規律，顯示當 HSP70 與 GFAP 陽性細胞率的比值明顯升高，且 HSP70 陽性細胞率亦顯著升高，但 GFAP 陽性細胞率無明顯改變時，提示損傷時間在傷后 0.5～3 h；當二者比值較大，HSP70 與 GFAP 陽性細胞率均有明顯升高時，可推斷損傷時間在傷后 3～12 h；當二者比值減少，HSP70 與 GFAP 陽性細胞率仍高于正常值時，損傷時間大致在傷后 12 h 以后。
本研究發現，應用單一指標的陽性細胞率變化規律難以確定腦震蕩損傷時間的范圍，但在結合二者的比值關系進行分析后，盡管仍不能得出準確的損傷時間的時間點，但可在一定程度上推斷出損傷時間的大致范圍；說明此方法在腦震蕩傷損傷時間的推斷中具有一定可行性，有望進一步細化損傷時間范圍以提高其推斷的準確度。
