引用本文： 楊菁玉, 王曉輝, 黃亮, 俞汝佳, 宗志勇. 復發的炎癥性腸病患者中艱難梭菌的臨床實驗室檢測. 華西醫學, 2017, 32(3): 324-328. doi: 10.7507/1002-0179.201701036 復制
艱難梭菌是革蘭陽性（ G+） 厭氧芽孢桿菌，分為產毒的艱難梭菌和不產毒的艱難梭菌 2 種類型，能通過接觸傳播在人群中尤其是疾病宿主集中的醫院內廣泛播散。它幾乎無侵襲性，但產毒株可分泌毒素 A、B 和二元毒素（binary toxin，CDT）致病。由于細菌毒株生物學特性和宿主的免疫狀態不同，產毒的艱難梭菌感染（Clostridium difficile infection，CDI）對宿主造成的影響可以是無癥狀攜帶、輕度腹瀉、致死性腸炎，后者會顯著延長住院時間，增加醫療花費，甚至威脅患者生命[1]。
艱難梭菌的芽孢在醫院環境中可存活 5 個月以上，不易被常用的物理和化學消毒法殺滅，故一旦感染暴發會造成持續感染。要做好艱難梭菌醫院感染防控，早期識別和隔離感染者是關鍵。與其他人群相比，炎癥性腸病（inflammatory bowel disease，IBD）患者中 CDI 的發病率較高，復發率可以高達 1/3[2-3]。因此，美國胃腸病協會《CDI 的診治與預防指南》強烈建議對復發的 IBD 患者進行艱難梭菌的檢測[4]。
目前用于艱難梭菌實驗室檢測的方法較多，主要分為厭氧培養、核酸檢測和酶免疫測定（enzyme immunoassay，EIA）檢測 3 種方式[4-5]。由于厭氧培養耗時耗力，對臨床實驗室的人力資源和設備物資要求較高，核酸檢測和 EIA 檢測的應用越來越受到重視。本研究探索了核酸糞便直接檢測和 EIA 糞便直接檢測在識別復發的 IBD 患者合并 CDI 中的臨床應用，旨在幫助早期識別和隔離 CDI 患者，為醫院感染防控提供更好的技術支持。現報告如下。
1 資料與方法
1.1 研究對象
本研究標本來源為四川大學華西醫院 2014 年 11 月—2015 年 4 月入院復發的 IBD 患者。以 2010 年英國胃腸病學會《成人 IBD 診治指南》為參照，納入標準：① 年齡>16 歲；② 既往消化專科醫生診斷為 IBD；③ 影像學資料、消化內鏡及組織學檢查結果符合 IBD 診斷；④ 此次入院有腹痛、腹瀉、血便等 IBD 復發的癥狀，消化專科醫生認為符合 IBD 疾病的臨床表現。排除標準：① 上消化道疾病；② 合并其他已知病原體感染的疾病（如細菌性痢疾、結核病、真菌性腸炎等）；③ 此次入院為癥狀首次發作。收集患者入院 48 h 內自然解出的 1 份大便，在 30 min 內送到實驗室進行下列艱難梭菌檢測。
1.2 研究方法
1.2.1 糞便厭氧培養和鑒定 所有糞便樣本經過乙醇處理后均接種至少 3 個含 10% 的羊血艱難梭菌 CCFA 培養平板（英國 Oxoid 公司），37℃ 厭氧培養 72 h。對所有生長出的菌落進行革蘭染色，挑取顯微鏡下菌落形態符合艱難梭菌的菌落在腦心浸出液肉湯中增菌。使用細菌基因組 DNA 提取試劑盒（美國 Omega 公司）提取細菌DNA，參照既往發表的聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）引物和反應條件，擴增艱難梭菌的看家基因tpi、A 毒素基因tcdA 和 B 毒素基因tcdB[6]。看家基因tpi 陽性的菌株，使用艱難梭菌快速檢測試劑盒（美國 Alere TECHLAB 公司，型號 C.DIFF QUIK CHEK COMPLETE）進行 EIA 檢測的毒素確認。其中，tpi 和tcdB 均擴增陽性，且 EIA 毒素檢測陽性的細菌認定為產毒的艱難梭菌；僅tpi 擴增陽性，且 EIA 毒素檢測陰性的細菌認定為非產毒的艱難梭菌。tcdA 和tcdB 均陽性的菌株，參照既往發表的 PCR 引物和反應條件，擴增 CDT 基因cdtA 和cdtB[7]。
1.2.2 核酸糞便直接檢測 所有糞便樣本均使用糞便 DNA 提取試劑盒（美國 Omega 公司）提取 DNA 供直接檢測。參照既往發表的 PCR 引物和反應條件，擴增艱難梭菌的看家基因tpi、A 毒素基因tcdA 和 B 毒素基因tcdB[6]。其中，tpi 和tcdB 均擴增陽性的糞便樣本認定為含產毒艱難梭菌的樣本；僅tpi 擴增陽性的糞便樣本認定為含非產毒艱難梭菌的樣本。
1.2.3 EIA 糞便直接檢測 所有糞便樣本均使用艱難梭菌快速檢測試劑盒（美國 Alere TECHLAB 公司，型號 C.DIFF QUIK CHEK COMPLETE）進行 EIA 直接檢測。該試劑能檢測的谷氨酸脫氫酶（glutamate dehydrogenase，GDH）抗原下限為 0.80 ng/mL，A 毒素下限為 0.63 ng/mL，B 毒素下限為 0.16 ng/mL。根據產品說明書操作，在測試管中依次加入稀釋劑、結合劑，待其充分混勻后加入檢測板的樣品窗，室溫下靜置 15 min。在反應窗中加入緩沖液，待其完全吸收后加入底物，室溫等待 10 min 后判讀結果。根據反應窗顯色帶判讀結果為下列 3 種類型：GDH 抗原陽性且毒素陽性的含產毒艱難梭菌的樣本、僅 GDH 抗原陽性的含非產毒艱難梭菌的樣本、GDH 抗原和毒素均陰性的不含艱難梭菌的樣本。
1.2.4 PCR 擴增產物純化、測序和比對 PCR 產物送華大基因用 ABI 3730xl DNA Analyzer（美國應用生物系統公司）雙向測序。測序結果經 BLAST（）比對分析。PCR 測序引物即擴增引物。
1.3 統計學方法
使用 Stata 12.0 軟件進行數據分析。以糞便厭氧培養和鑒定為參照，對 EIA 糞便直接檢測和核酸糞便直接檢測這 2 種檢測方式，通過 Κappa 一致性檢驗進行比較。Κappa=1，表示 2 種方法完全一致；0.81<Κappa<1.00，表示 2 種方法非常一致；0.61<Κappa<0.80，表示兩種方法基本一致；Κappa<0.60，表示 2 種方法一致性差。同時檢驗 Κappa 系數，P<0.05 表明結論可靠。
2 結果
2.1 樣本基本資料
剔除重復送檢的樣本，本項目共納入 48 份復發的 IBD 患者的非重復大便樣本。其中男 32 份，女 16 份；年齡 14～68 歲，平均（40.46±17.85）歲。
2.2 方法比較
以糞便厭氧培養和鑒定的方法為基礎，核酸糞便直接檢測的結果與其完全一致（Κappa=1.00，P<0.05)。共檢出了 11 份有艱難梭菌的樣本，其中有 2 份樣本檢出了產毒的艱難梭菌。另外 37 份糞便未檢出艱難梭菌。產毒艱難梭菌的樣本占全體樣本的 4.2%。與糞便培養和鑒定的方法相比，EIA 糞便直接檢測的結果在抗原檢測方面相似，在毒素檢測方面有差異。EIA 糞便直接檢測共檢出了 13 份有艱難梭菌的樣本，其中有 2 份樣本是另外兩種方法未檢測出的，考慮為假陽性。在未檢出艱難梭菌的樣本和檢出艱難梭菌的樣本中，EIA 糞便直接檢測結果與糞便厭氧培養和鑒定結果的一致性很高（Κappa=0.89，P<0.05)。在抗原檢測方面，EIA 糞便直接檢測和糞便厭氧培養和鑒定結果相似。EIA 糞便直接檢測未檢出毒素陽性的樣本，即是未含產毒艱難梭菌的樣本。但有 2 份樣本，EIA 糞便直接檢測的結果顯示抗原檢測陽性，毒素檢測陰性；而核酸檢測和厭氧培養鑒定這兩種方法檢測出的結果都是陽性。因此這 2 份樣本的毒素檢測結果考慮為假陰性。由于樣本量小，在產毒艱難梭菌樣本的檢測及毒素檢測方面，未做統計學分析。見圖 1。
圖1
糞便樣本艱難梭菌檢測結果比較 * Κappa 檢驗顯示與厭氧培養和鑒定法相比，檢驗結果一致。未檢出艱難梭菌樣本組：該糞便樣本 EIA 糞便直接檢測 GDH 抗原和毒素檢測均陰性，tpi 核酸糞便直接檢測陰性，糞便厭氧培養未培養到艱難梭菌；檢出艱難梭菌樣本組：該糞便樣本 EIA 糞便直接檢測抗原檢測陽性，tpi 核酸糞便直接檢測陽性，糞便厭氧培養到了包括產毒株和非產毒株在內的艱難梭菌；檢出產毒的艱難梭菌樣本組：該糞便樣本 EIA 糞便直接檢測毒素檢測陽性，tpi 和tcdB 核酸糞便直接檢測陽性，糞便厭氧培養到了產毒的艱難梭菌
2.3 產毒艱難梭菌及其感染患者情況
2 份樣本厭氧培養分離到的艱難梭菌，純菌經 EIA 試劑盒檢測 GDH 檢測線和毒素檢測線均陽性，顯示均為產毒的艱難梭菌。PCR 擴增證實 B 毒素基因陽性，A 毒素基因完整無缺失，均無 CDT 基因，毒素類型為 A+B+。這 2 份樣本來源于 2 個 IBD 合并 CDI 的患者，患者情況見表 1。其中患者 1 為反復 CDI 發作的患者，此次為第 3 次發作，曾使用利福昔明抗 CDI 感染治療無效。
表1
IBD 合并 CDI 患者的臨床情況
3 討論
近年來，CDI 的發病率和疾病嚴重程度在全球范圍內呈上升趨勢，北美、澳大利亞及歐洲的醫院均相繼出現了高毒力菌株以及地區播散性醫院內暴發流行[8]，已經對社會公共衛生安全構成了嚴重威脅。美國國家疾病控制中心發布的數據顯示，CDI 每年導致超過 250 000 人住院，至少 14 000 人死亡，美國為此每年遭受 10 億美元經濟損失。因此在耐藥細菌威脅等級中，艱難梭菌被列入最高的“緊急”級別[9]。美國的研究表明，CDI 在 IBD 患者中的發病率較普通人群高，發病率可增加至 6%[10]。其中，克隆恩病患者發生 CDI 的風險增加了 2 倍，潰瘍性結腸炎患者發生 CDI 的風險增加了 3 倍[10]。歐洲的一項研究發現，IBD 患者即便處于緩解期，也大約有 8.2% 的人攜帶產毒的艱難梭菌[11]。因此，對 IBD 患者進行積極的艱難梭菌實驗室檢測十分必要。早期識別艱難梭菌攜帶者和患者能為后續 CDI 的治療和醫院感染防控提供幫助。
與歐美國家不同的是，既往研究顯示我國目前尚不是艱難梭菌的高流行區，反復發生 CDI 的患者報道較少[12]，只是在一些重點病房或重點人群中 CDI 的發病率較高，如重癥監護病房、神經內科[13-15]。本研究結果顯示，有產毒 CDI 的患者在復發的 IBD 患者中占 4.2%，較國外的研究結果[10]略低。鑒于這個較低的發生率，在該類人群中無必要針對 CDI 使用預防性用藥，也無必要擴大 CDI 臨床診斷的可能性并盲目給予經驗性治療。在 IBD 患者中，僅憑臨床表現來鑒別 CDI 和 IBD 復發非常困難，鑒于 CDI 造成的不良后果和其可治可控性，臨床醫生和臨床實驗室對這類患者入院時就進行主動篩查是非常有意義的。
可用于艱難梭菌檢測的實驗室方法較多，主要分為厭氧培養、核酸檢測和 EIA 檢測 3 種方式[4-5]。厭氧培養是傳統的艱難梭菌檢測方法，但其需要專門的厭氧培養設備、耗材和技術人員，檢測報告周期長，耗時、耗力。培養分純的過程有時還需要反復多次傳代繼而再耗費數日。此外，在培養分純細菌后，還需要使用核酸檢測法、EIA 檢測法或者細胞毒實驗才能進一步確定分離到的菌株是不是產毒的艱難梭菌。為了提高陽性率，通常需要增加接種平板數量以增加接種樣本量，正如本研究所做的這樣。因而臨床實驗室需要使用快速、方便、敏感性和特異性都較高的方法以實現快速準確的檢測目標，但受資源的限制，目前開展此檢測的醫院較少，且各家醫院的檢驗方法和檢驗流程并不完全一樣。
核酸檢測和 EIA 檢測都可以直接應用于糞便，顯著縮短了檢測報告時間，是臨床實驗室用于替代培養方法的主要的 2 種選擇。本研究結果顯示在已經診斷 IBD 的患者中，核酸檢測與厭氧培養和鑒定的一致性強，可以作為替代培養的臨床檢測方法。但核酸檢測需要專門的設備和專門的技術人員，對于資源緊缺的基層醫院或者艱難梭菌非流行區的醫院來說略有不便。如若使用全自動 DNA 提取儀提取糞便 DNA 和使用 RT-PCR 方法進行核酸檢測，檢測速度更快，對資源的要求也更高。
本研究結果還顯示，與厭氧培養和鑒定相比，EIA 檢測在抗原檢測方面顯示出的一致性較好，雖然有仍有少量的假陽性，但是沒有發現假陰性。因此我們認為在復發的 IBD 患者中，EIA 的抗原檢測敏感性也很好，可以用于替代厭氧培養和鑒定的方法，尤其是識別有無 CDI 的患者。由于 EIA 檢測時間短，可在 30 min 以內得到結果，不需要特殊的操作技能培訓和專門的技術人員，因此特別適合資源不足的醫院。本研究顯示 EIA 檢測在毒素檢測方面與厭氧培養和鑒定的方法相比，結果不完全相符，顯示出了假陰性。由于樣本量小，這部分比較不宜進行統計學評價。我們知道，患者感染艱難梭菌后，毒素的排泌量和機體對病原菌的清除有關，癥狀的輕重也和機體對毒素的免疫反應相關，可能存在毒素量少而炎癥反應重的情況[16]。同時，IBD 患者由于排便次數增加，其單次排便中的艱難梭菌毒素量可能會降低，也會造成 EIA 檢測的假陰性。因此我們建議，在復發的 IBD 患者中，可以使用 EIA 糞便直接檢測來替代厭氧培養進行快速檢測，但是對于臨床高度懷疑 CDI 而 EIA 抗原檢測陽性但毒素檢測陰性的樣本，則應聯合其他檢測方式，以免漏診。對于在專科病房如消化科設立的床旁 POC 檢測點，也可以推薦使用 EIA 糞便直接檢測。
本研究方法的不足之處在于樣本量不夠大，產毒艱難梭菌的檢出由于發病率較低而較少，因此對結果的解釋需要保持謹慎，并需進一步擴大樣本量來驗證該研究結果。
綜上所述，我院入院的 IBD 復發患者中產毒 CDI 較低，為 4.2%，建議在無實驗室結果支持下進行臨床診斷需謹慎。除了厭氧培養和鑒定以外，核酸糞便直接檢測和 EIA 糞便直接檢測都可以用于 IBD 患者合并 CDI 的篩查，前者較后者略好。臨床上高度懷疑 IBD 合并 CDI 的患者，若糞便的 EIA 抗原檢測陽性但毒素檢測陰性，建議加用核酸檢測等其他方法進行確認。
艱難梭菌是革蘭陽性（ G+） 厭氧芽孢桿菌，分為產毒的艱難梭菌和不產毒的艱難梭菌 2 種類型，能通過接觸傳播在人群中尤其是疾病宿主集中的醫院內廣泛播散。它幾乎無侵襲性，但產毒株可分泌毒素 A、B 和二元毒素（binary toxin，CDT）致病。由于細菌毒株生物學特性和宿主的免疫狀態不同，產毒的艱難梭菌感染（Clostridium difficile infection，CDI）對宿主造成的影響可以是無癥狀攜帶、輕度腹瀉、致死性腸炎，后者會顯著延長住院時間，增加醫療花費，甚至威脅患者生命[1]。
艱難梭菌的芽孢在醫院環境中可存活 5 個月以上，不易被常用的物理和化學消毒法殺滅，故一旦感染暴發會造成持續感染。要做好艱難梭菌醫院感染防控，早期識別和隔離感染者是關鍵。與其他人群相比，炎癥性腸病（inflammatory bowel disease，IBD）患者中 CDI 的發病率較高，復發率可以高達 1/3[2-3]。因此，美國胃腸病協會《CDI 的診治與預防指南》強烈建議對復發的 IBD 患者進行艱難梭菌的檢測[4]。
目前用于艱難梭菌實驗室檢測的方法較多，主要分為厭氧培養、核酸檢測和酶免疫測定（enzyme immunoassay，EIA）檢測 3 種方式[4-5]。由于厭氧培養耗時耗力，對臨床實驗室的人力資源和設備物資要求較高，核酸檢測和 EIA 檢測的應用越來越受到重視。本研究探索了核酸糞便直接檢測和 EIA 糞便直接檢測在識別復發的 IBD 患者合并 CDI 中的臨床應用，旨在幫助早期識別和隔離 CDI 患者，為醫院感染防控提供更好的技術支持。現報告如下。
1 資料與方法
1.1 研究對象
本研究標本來源為四川大學華西醫院 2014 年 11 月—2015 年 4 月入院復發的 IBD 患者。以 2010 年英國胃腸病學會《成人 IBD 診治指南》為參照，納入標準：① 年齡>16 歲；② 既往消化專科醫生診斷為 IBD；③ 影像學資料、消化內鏡及組織學檢查結果符合 IBD 診斷；④ 此次入院有腹痛、腹瀉、血便等 IBD 復發的癥狀，消化專科醫生認為符合 IBD 疾病的臨床表現。排除標準：① 上消化道疾病；② 合并其他已知病原體感染的疾病（如細菌性痢疾、結核病、真菌性腸炎等）；③ 此次入院為癥狀首次發作。收集患者入院 48 h 內自然解出的 1 份大便，在 30 min 內送到實驗室進行下列艱難梭菌檢測。
1.2 研究方法
1.2.1 糞便厭氧培養和鑒定 所有糞便樣本經過乙醇處理后均接種至少 3 個含 10% 的羊血艱難梭菌 CCFA 培養平板（英國 Oxoid 公司），37℃ 厭氧培養 72 h。對所有生長出的菌落進行革蘭染色，挑取顯微鏡下菌落形態符合艱難梭菌的菌落在腦心浸出液肉湯中增菌。使用細菌基因組 DNA 提取試劑盒（美國 Omega 公司）提取細菌DNA，參照既往發表的聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）引物和反應條件，擴增艱難梭菌的看家基因tpi、A 毒素基因tcdA 和 B 毒素基因tcdB[6]。看家基因tpi 陽性的菌株，使用艱難梭菌快速檢測試劑盒（美國 Alere TECHLAB 公司，型號 C.DIFF QUIK CHEK COMPLETE）進行 EIA 檢測的毒素確認。其中，tpi 和tcdB 均擴增陽性，且 EIA 毒素檢測陽性的細菌認定為產毒的艱難梭菌；僅tpi 擴增陽性，且 EIA 毒素檢測陰性的細菌認定為非產毒的艱難梭菌。tcdA 和tcdB 均陽性的菌株，參照既往發表的 PCR 引物和反應條件，擴增 CDT 基因cdtA 和cdtB[7]。
1.2.2 核酸糞便直接檢測 所有糞便樣本均使用糞便 DNA 提取試劑盒（美國 Omega 公司）提取 DNA 供直接檢測。參照既往發表的 PCR 引物和反應條件，擴增艱難梭菌的看家基因tpi、A 毒素基因tcdA 和 B 毒素基因tcdB[6]。其中，tpi 和tcdB 均擴增陽性的糞便樣本認定為含產毒艱難梭菌的樣本；僅tpi 擴增陽性的糞便樣本認定為含非產毒艱難梭菌的樣本。
1.2.3 EIA 糞便直接檢測 所有糞便樣本均使用艱難梭菌快速檢測試劑盒（美國 Alere TECHLAB 公司，型號 C.DIFF QUIK CHEK COMPLETE）進行 EIA 直接檢測。該試劑能檢測的谷氨酸脫氫酶（glutamate dehydrogenase，GDH）抗原下限為 0.80 ng/mL，A 毒素下限為 0.63 ng/mL，B 毒素下限為 0.16 ng/mL。根據產品說明書操作，在測試管中依次加入稀釋劑、結合劑，待其充分混勻后加入檢測板的樣品窗，室溫下靜置 15 min。在反應窗中加入緩沖液，待其完全吸收后加入底物，室溫等待 10 min 后判讀結果。根據反應窗顯色帶判讀結果為下列 3 種類型：GDH 抗原陽性且毒素陽性的含產毒艱難梭菌的樣本、僅 GDH 抗原陽性的含非產毒艱難梭菌的樣本、GDH 抗原和毒素均陰性的不含艱難梭菌的樣本。
1.2.4 PCR 擴增產物純化、測序和比對 PCR 產物送華大基因用 ABI 3730xl DNA Analyzer（美國應用生物系統公司）雙向測序。測序結果經 BLAST（）比對分析。PCR 測序引物即擴增引物。
1.3 統計學方法
使用 Stata 12.0 軟件進行數據分析。以糞便厭氧培養和鑒定為參照，對 EIA 糞便直接檢測和核酸糞便直接檢測這 2 種檢測方式，通過 Κappa 一致性檢驗進行比較。Κappa=1，表示 2 種方法完全一致；0.81<Κappa<1.00，表示 2 種方法非常一致；0.61<Κappa<0.80，表示兩種方法基本一致；Κappa<0.60，表示 2 種方法一致性差。同時檢驗 Κappa 系數，P<0.05 表明結論可靠。
2 結果
2.1 樣本基本資料
剔除重復送檢的樣本，本項目共納入 48 份復發的 IBD 患者的非重復大便樣本。其中男 32 份，女 16 份；年齡 14～68 歲，平均（40.46±17.85）歲。
2.2 方法比較
以糞便厭氧培養和鑒定的方法為基礎，核酸糞便直接檢測的結果與其完全一致（Κappa=1.00，P<0.05)。共檢出了 11 份有艱難梭菌的樣本，其中有 2 份樣本檢出了產毒的艱難梭菌。另外 37 份糞便未檢出艱難梭菌。產毒艱難梭菌的樣本占全體樣本的 4.2%。與糞便培養和鑒定的方法相比，EIA 糞便直接檢測的結果在抗原檢測方面相似，在毒素檢測方面有差異。EIA 糞便直接檢測共檢出了 13 份有艱難梭菌的樣本，其中有 2 份樣本是另外兩種方法未檢測出的，考慮為假陽性。在未檢出艱難梭菌的樣本和檢出艱難梭菌的樣本中，EIA 糞便直接檢測結果與糞便厭氧培養和鑒定結果的一致性很高（Κappa=0.89，P<0.05)。在抗原檢測方面，EIA 糞便直接檢測和糞便厭氧培養和鑒定結果相似。EIA 糞便直接檢測未檢出毒素陽性的樣本，即是未含產毒艱難梭菌的樣本。但有 2 份樣本，EIA 糞便直接檢測的結果顯示抗原檢測陽性，毒素檢測陰性；而核酸檢測和厭氧培養鑒定這兩種方法檢測出的結果都是陽性。因此這 2 份樣本的毒素檢測結果考慮為假陰性。由于樣本量小，在產毒艱難梭菌樣本的檢測及毒素檢測方面，未做統計學分析。見圖 1。
圖1
糞便樣本艱難梭菌檢測結果比較 * Κappa 檢驗顯示與厭氧培養和鑒定法相比，檢驗結果一致。未檢出艱難梭菌樣本組：該糞便樣本 EIA 糞便直接檢測 GDH 抗原和毒素檢測均陰性，tpi 核酸糞便直接檢測陰性，糞便厭氧培養未培養到艱難梭菌；檢出艱難梭菌樣本組：該糞便樣本 EIA 糞便直接檢測抗原檢測陽性，tpi 核酸糞便直接檢測陽性，糞便厭氧培養到了包括產毒株和非產毒株在內的艱難梭菌；檢出產毒的艱難梭菌樣本組：該糞便樣本 EIA 糞便直接檢測毒素檢測陽性，tpi 和tcdB 核酸糞便直接檢測陽性，糞便厭氧培養到了產毒的艱難梭菌
2.3 產毒艱難梭菌及其感染患者情況
2 份樣本厭氧培養分離到的艱難梭菌，純菌經 EIA 試劑盒檢測 GDH 檢測線和毒素檢測線均陽性，顯示均為產毒的艱難梭菌。PCR 擴增證實 B 毒素基因陽性，A 毒素基因完整無缺失，均無 CDT 基因，毒素類型為 A+B+。這 2 份樣本來源于 2 個 IBD 合并 CDI 的患者，患者情況見表 1。其中患者 1 為反復 CDI 發作的患者，此次為第 3 次發作，曾使用利福昔明抗 CDI 感染治療無效。
表1
IBD 合并 CDI 患者的臨床情況
3 討論
近年來，CDI 的發病率和疾病嚴重程度在全球范圍內呈上升趨勢，北美、澳大利亞及歐洲的醫院均相繼出現了高毒力菌株以及地區播散性醫院內暴發流行[8]，已經對社會公共衛生安全構成了嚴重威脅。美國國家疾病控制中心發布的數據顯示，CDI 每年導致超過 250 000 人住院，至少 14 000 人死亡，美國為此每年遭受 10 億美元經濟損失。因此在耐藥細菌威脅等級中，艱難梭菌被列入最高的“緊急”級別[9]。美國的研究表明，CDI 在 IBD 患者中的發病率較普通人群高，發病率可增加至 6%[10]。其中，克隆恩病患者發生 CDI 的風險增加了 2 倍，潰瘍性結腸炎患者發生 CDI 的風險增加了 3 倍[10]。歐洲的一項研究發現，IBD 患者即便處于緩解期，也大約有 8.2% 的人攜帶產毒的艱難梭菌[11]。因此，對 IBD 患者進行積極的艱難梭菌實驗室檢測十分必要。早期識別艱難梭菌攜帶者和患者能為后續 CDI 的治療和醫院感染防控提供幫助。
與歐美國家不同的是，既往研究顯示我國目前尚不是艱難梭菌的高流行區，反復發生 CDI 的患者報道較少[12]，只是在一些重點病房或重點人群中 CDI 的發病率較高，如重癥監護病房、神經內科[13-15]。本研究結果顯示，有產毒 CDI 的患者在復發的 IBD 患者中占 4.2%，較國外的研究結果[10]略低。鑒于這個較低的發生率，在該類人群中無必要針對 CDI 使用預防性用藥，也無必要擴大 CDI 臨床診斷的可能性并盲目給予經驗性治療。在 IBD 患者中，僅憑臨床表現來鑒別 CDI 和 IBD 復發非常困難，鑒于 CDI 造成的不良后果和其可治可控性，臨床醫生和臨床實驗室對這類患者入院時就進行主動篩查是非常有意義的。
可用于艱難梭菌檢測的實驗室方法較多，主要分為厭氧培養、核酸檢測和 EIA 檢測 3 種方式[4-5]。厭氧培養是傳統的艱難梭菌檢測方法，但其需要專門的厭氧培養設備、耗材和技術人員，檢測報告周期長，耗時、耗力。培養分純的過程有時還需要反復多次傳代繼而再耗費數日。此外，在培養分純細菌后，還需要使用核酸檢測法、EIA 檢測法或者細胞毒實驗才能進一步確定分離到的菌株是不是產毒的艱難梭菌。為了提高陽性率，通常需要增加接種平板數量以增加接種樣本量，正如本研究所做的這樣。因而臨床實驗室需要使用快速、方便、敏感性和特異性都較高的方法以實現快速準確的檢測目標，但受資源的限制，目前開展此檢測的醫院較少，且各家醫院的檢驗方法和檢驗流程并不完全一樣。
核酸檢測和 EIA 檢測都可以直接應用于糞便，顯著縮短了檢測報告時間，是臨床實驗室用于替代培養方法的主要的 2 種選擇。本研究結果顯示在已經診斷 IBD 的患者中，核酸檢測與厭氧培養和鑒定的一致性強，可以作為替代培養的臨床檢測方法。但核酸檢測需要專門的設備和專門的技術人員，對于資源緊缺的基層醫院或者艱難梭菌非流行區的醫院來說略有不便。如若使用全自動 DNA 提取儀提取糞便 DNA 和使用 RT-PCR 方法進行核酸檢測，檢測速度更快，對資源的要求也更高。
本研究結果還顯示，與厭氧培養和鑒定相比，EIA 檢測在抗原檢測方面顯示出的一致性較好，雖然有仍有少量的假陽性，但是沒有發現假陰性。因此我們認為在復發的 IBD 患者中，EIA 的抗原檢測敏感性也很好，可以用于替代厭氧培養和鑒定的方法，尤其是識別有無 CDI 的患者。由于 EIA 檢測時間短，可在 30 min 以內得到結果，不需要特殊的操作技能培訓和專門的技術人員，因此特別適合資源不足的醫院。本研究顯示 EIA 檢測在毒素檢測方面與厭氧培養和鑒定的方法相比，結果不完全相符，顯示出了假陰性。由于樣本量小，這部分比較不宜進行統計學評價。我們知道，患者感染艱難梭菌后，毒素的排泌量和機體對病原菌的清除有關，癥狀的輕重也和機體對毒素的免疫反應相關，可能存在毒素量少而炎癥反應重的情況[16]。同時，IBD 患者由于排便次數增加，其單次排便中的艱難梭菌毒素量可能會降低，也會造成 EIA 檢測的假陰性。因此我們建議，在復發的 IBD 患者中，可以使用 EIA 糞便直接檢測來替代厭氧培養進行快速檢測，但是對于臨床高度懷疑 CDI 而 EIA 抗原檢測陽性但毒素檢測陰性的樣本，則應聯合其他檢測方式，以免漏診。對于在專科病房如消化科設立的床旁 POC 檢測點，也可以推薦使用 EIA 糞便直接檢測。
本研究方法的不足之處在于樣本量不夠大，產毒艱難梭菌的檢出由于發病率較低而較少，因此對結果的解釋需要保持謹慎，并需進一步擴大樣本量來驗證該研究結果。
綜上所述，我院入院的 IBD 復發患者中產毒 CDI 較低，為 4.2%，建議在無實驗室結果支持下進行臨床診斷需謹慎。除了厭氧培養和鑒定以外，核酸糞便直接檢測和 EIA 糞便直接檢測都可以用于 IBD 患者合并 CDI 的篩查，前者較后者略好。臨床上高度懷疑 IBD 合并 CDI 的患者，若糞便的 EIA 抗原檢測陽性但毒素檢測陰性，建議加用核酸檢測等其他方法進行確認。
