引用本文： 林文韜, 劉曉雪, 劉勇, 陳俊杰, 岑瑛. HaCaT 條件培養基聯合全反式維甲酸誘導人脂肪干細胞向表皮細胞分化的初步研究. 華西醫學, 2018, 33(3): 325-331. doi: 10.7507/1002-0179.201611154 復制
皮膚是人體最大的器官，大面積深度燒傷、急性創傷等可能造成大面積皮膚缺損。組織工程皮膚是修復大面積皮膚缺損有效方法之一。種子細胞為組織工程皮膚重要組成要素。以往研究較多的是角質形成細胞及成纖維細胞[1]。隨著干細胞研究的不斷深入，自體干細胞或許能成為組織工程領域理想的種子細胞。
間充質干細胞為近年來研究的熱點。脂肪來源間充質干細胞可以通過微創的方法從人體獲得，可以是體內多余的脂肪組織，對供體損傷小，來源豐富，體外容易培養，等量組織中干細胞含量要遠遠高于骨髓間充質干細胞；脂肪干細胞具有良好的自我增殖和多系分化潛能，能夠向脂肪細胞、成骨細胞、肝細胞、內皮細胞等組織細胞分化[2-4]。2005 年，Brzoska 等[5]研究發現，全反式維甲酸（all-trans-retinoic acid，ATRA）可誘導脂肪干細胞分化為表皮細胞，表明脂肪干細胞有向表皮方向分化的能力。Long 等[6]用 ATRA 聯合生長因子同樣誘導脂肪干細胞向表皮細胞分化。我國學者也利用人永生化角質形成細胞 HaCaT 與干細胞共培養的方式，成功誘導干細胞向表皮細胞表型分化[7-9]。誘導后表皮細胞角蛋白的表達率不同文獻報道差異較大，為 9%～80%[5, 7, 10]。本研究用 ATRA 及生長因子結合 HaCaT 細胞條件培養基作為誘導條件，探討提高脂肪干細胞向表皮誘導分化的方法。現報告如下。
1 材料與方法
1.1 標本
脂肪取自四川大學華西醫院美容整形/燒傷外科腹部取皮手術后多余的皮下脂肪組織或水動力抽脂機腹部抽吸的多余脂肪組織，研究經醫院倫理委員會審批通過，患者簽署相關知情同意書。
1.2 主要試劑與儀器
1.2.1 主要試劑
Dulbecco Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12（DMEM/F12）培養基（美國 Gibco 公司），Ⅰ型膠原酶（美國 Gibco 公司），胎牛血清（美國 Gibco 公司），山羊血清（杭州四季青公司），磷酸鹽緩沖液（北京中杉金橋公司），3-異丁基-1-甲基黃嘌呤（3-isobutyl-1-methyxanthine，IBMX）（美國 Sigma 公司），地塞米松（美國 Sigma 公司），胰酶（美國 Sigma 公司），PerCP-eFluor? 710 標記抗人 CD34 抗體（美國 eBioscience 公司），異硫氰酸熒光素標記抗人 CD45 抗體（美國 BD biosciences 公司），PE-Cyanine7 標記抗人 CD73 抗體（美國 eBioscience 公司），（Thy-1）別藻藍蛋白標記抗人 CD90 抗體（美國 BD biosciences 公司），藻紅蛋白標記抗人 CD105 抗體（美國 eBioscience 公司），藻紅蛋白標記鼠抗人細胞角蛋白（cytokeratin，CK）14、15、16、19 抗體（美國 BD Pharmingen 公司），ATRA（美國 Sigma 公司），表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）（美國 PeproTech 公司），角質細胞生長因子（keratinocyte growth factor，KGF）（美國 PeproTech 公司），異硫氰酸熒光素標記山羊抗兔免疫球蛋白 G（immunoglobulin G，IgG）（北京中杉金橋公司），Alexa Fluor594 標記山羊抗鼠 IgG（美國 Life Technology 公司），Ⅳ型膠原（美國 Sigma 公司），CK14 抗體（美國 Proteintech 公司），HaCaT 細胞（美國 ATCC 公司）。
1.2.2 主要儀器
顯微鏡（日本 Nikon 公司），全自動熒光顯微鏡（德國 Zeiss 公司），倒置相差顯微鏡（日本 Olympus 公司），二氧化碳培養箱（日本 Sanyo 公司），電子天平（德國 Christ 公司），熒光酶標儀（德國 Leica 公司），流式細胞儀（美國 Beckman Coulter 公司）
1.3 方法
1.3.1 脂肪干細胞的分離培養
取新鮮脂肪組織，低溫 3 h 內轉移至實驗室超凈工作臺。用磷酸緩沖鹽溶液沖洗脂肪組織 3 次。用眼科剪修去脂肪組織中混有的筋膜及血管組織，并修剪為直徑約 5 mm 的脂肪粒。將該脂肪粒轉移至安瓶中修剪為 1 mm3左右大小的碎片。分別取 10 mL 脂肪碎片及 10 mL 0.1% 的Ⅰ型膠原酶置入 50 mL 離心管，充分搖勻，并置于 37℃ 水浴鍋振蕩消化 40～60 min 至漿糊狀。15 mL 磷酸緩沖鹽溶液加入離心管中稀釋消化液，搖勻，并置于離心機中 1 200 r/min，離心 1 min。吸出上層脂肪組織，保留下層液體組織，于離心機中 1 200 r/min，繼續離心 5 min。吸凈上清液，保留沉淀。用 5 mL 含 10% 胎牛血清的 DMEM/F12 重懸，200 目篩網過濾，過濾后液體接種于 25 cm2培養瓶。實驗使用第 3～5 代內細胞。
1.3.2 脂肪干細胞的鑒定
鑒定細胞為生長狀態良好的第 3 代脂肪干細胞。制成 3×105/50 μL 單細胞懸液，分別加入熒光標記的抗體 CD34、CD45、CD73、CD90、CD105，混勻，避光孵育，離心，重懸，流式細胞儀檢測。
成脂誘導以 8 000/cm2的密度接種。成脂誘導培養基配制：10% 胎牛血清，DMEM/F12，0.5 mmol/L IBMX，1 μmol/L 地塞米松，10 μmol/L 胰島素，200 μmol/L 吲哚美辛。誘導 2 周后。油紅 O 染色。鏡下觀察脂滴的形成。
成骨誘導以 4 000/cm2的密度接種。成骨誘導培養基配制：10% 胎牛血清，DMEM/F12，0.1 μmol/L 地塞米松，50 μmol/L 抗壞血酸，10 mmol/L β-甘油磷酸鈉。誘導 4 周后。茜素紅染色，鏡下觀察鈣結節的形成。
1.3.3 表皮細胞誘導培養基的配制
① 表皮細胞誘導培養基 A 配制：DMEM/F12，2% 胎牛血清，5 μmol/L ATRA，20 ng/mL EGF，10 ng/mL KGF，0.1 μmol/L 地塞米松。② 表皮細胞誘導培養基 B 配制：取 60%～70% 融合狀態下的 HaCaT 細胞，更換新鮮 DMEM/F12 培養基，孵箱中培養 48 h 后吸出培養基，0.22 μm 過濾器過濾除菌制備成 HaCaT 條件培養基備用。將 HaCaT 條件培養基與普通培養基按 1∶1 比例配制為含 50% HaCaT 上清液的培養基，并將培養基配制為含 2% 胎牛血清、5 μmol/L ATRA、20 ng/mL EGF、10 ng/mL KGF、0.1 μmol/L 地塞米松的表皮誘導培養基 B。
1.3.4 誘導脂肪干細胞向表皮細胞方向分化
Transwell 小室為插入式的培養皿[11]，不同孔徑及不同膜處理的 Transwell 小室，常應用于共培養、細胞趨化、細胞遷移、細胞侵襲等多方面的研究。本實驗用六孔板 Transwell 小室構建氣液界面培養。取Ⅳ型膠原包被小室膜。脂肪干細胞以 6 000/cm2的密度接種于小室膜上。上室加入 1 mL 培養基，下室加入 2 mL 培養基。24 h 后吸凈上室培養基，下室更換條件培養基達上室膜平面，構建氣液界面誘導培養。見圖 1。
實驗分 3 組：誘導組 A 為表皮誘導培養基 A，誘導組 B 為表皮誘導培養基 B，未誘導組為 DMEM/F12 普通培養基。置于 37℃ 5% 二氧化碳孵箱中培養。每 3 天換液 1 次，連續誘導 12 d，共 6 例原代細胞。
圖1
Transwell 小室構建氣液界面培養皿
將 Transwell 小室放入六孔板中，小室內稱上室，孔板內稱下室。兩室以 3 μm 孔徑的聚碳酸酯膜相隔，上室聚碳酸酯膜面接種細胞，下室加入培養基至膜面，構成氣液界面培養
1.3.5 流式細胞術檢測誘導后細胞 CK14、15、16、19 廣譜細胞角蛋白（pan cytokeratin，Pan-CK）的表達
取各組培養 12 d 后細胞，消化、離心、重懸，4% 多聚甲醛固定 10 min，聚氧乙烯辛基苯基醚 Triton-X 100 破膜 10 min，制成 3×105/50 μL 單細胞懸液，加入帶熒光的 Pan-CK 抗體，室溫避光孵育 30 min，流式細胞儀檢測。
1.3.6 免疫熒光染色法檢測誘導后細胞 CK14 的表達
取各組培養 12 d 的細胞，胰酶乙二胺四乙酸消化后，以 2×104/cm2的密度接種于包被有Ⅳ型膠原的細胞爬片上，相應培養基繼續培養 2 d。取出爬片，按照免疫熒光染色的步驟：4% 多聚甲醛室溫 15 min 固定，Triton X-100 室溫 20 min 破膜，羊血清 20 min 封閉爬片，1∶50 的濃度稀釋鼠抗人 CK14 單克隆抗體，4℃ 過夜。1∶250 稀釋 Alexa Fluor59 標記山羊抗鼠 IgG，避光 37℃ 1 h，4，6-聯脒-2-苯基吲哚液染色，室溫避光 5 min。熒光顯微鏡觀察，每例細胞誘導 3 次，每次隨機選取 4 個視野，Image-pro plus 軟件計算每視野呈藍色熒光細胞核的數量，人工點數紅色熒光細胞的數量。計算每視野下紅色熒光陽性細胞占總細胞的平均比例。
1.4 統計學方法
采用 SPSS 19.0 軟件進行統計學數據分析。數據以均數±標準差表示，兩組比較采用 t 檢驗進行統計學分析，三組比較采用 Kruskal-Wallis 秩和檢驗，若三組差異有統計學意義，采用 Nemenyi 檢驗進行兩兩比較。檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 脂肪干細胞的分離培養與鑒定
新分離的脂肪干細胞鏡下可見呈圓球形，透亮，并混有較多小圓形紅細胞。48 h 后鏡下可見貼壁細胞增多，細胞呈短梭形。第 7 天左右細胞達到 90% 融合。傳代培養至第 10 代，細胞形態基本保持不變。第 3 代細胞如圖 2a 所示：成纖維細胞形態樣生長，長梭形，旋渦狀。脂肪干細胞成脂誘導培養基培養后，油紅 O 染色，可見細胞內大量大小不一的紅棕色脂滴形成（圖 2b）。成骨誘導培養基培養后，茜素紅染色，可見深棕色鈣結節形成（圖 2c）。
流式細胞術檢測細胞表面標志物，CD34、CD45 為造血干細胞及內皮細胞來源特征抗原，CD73、CD90、CD105 是間充質干細胞來源特征抗原，見表 1。本實驗原代培養的細胞符合間充質干細胞的表面特征性抗原的表達，內皮細胞及造血細胞污染小。
圖2
原代培養脂肪干細胞及成脂成骨誘導分化
a. 原代培養第 3 代細胞（×40），可見成纖維細胞形態樣生長，長梭形，旋渦狀；b. 成脂誘導分化后油紅 O 染色（×100），可見細胞內大量大小不一紅棕色脂滴形成；c. 成骨誘導分化后茜素紅染色（×100），可見深棕色不均質鈣結節形成
表1
脂肪干細胞表面標志物表達率（n=6，%，
）
2.2 成表皮細胞誘導后鏡下觀察
Transwell 小室膜光學顯微鏡下為非透明膜。誘導 12 d 后制備細胞爬片并繼續誘導培養 3 d，鏡下所見如圖 3 所示。
圖3
脂肪干細胞成表皮誘導后鏡下觀察
誘導組可見細胞形態小，形態由長梭形變為短梭形，部分細胞為圓形或類圓形，近似鋪路石樣改變；誘導組兩組細胞形態無明顯差異；未誘導組可見細胞仍保持條梭形，部分細胞開始出現老化的現象
2.3 流式細胞術檢測細胞表面標志物 Pan-CK 的表達
共 6 例原代培養脂肪干細胞完成了誘導，誘導組均有不同程度表皮細胞標記 Pan-CK 的表達。其中 1 例細胞流式檢測結果如圖 4。流式細胞結果顯示誘導組 B Pan-CK 表達率［（22.0±3.5）%］大于誘導組 A［（11.9±2.7）%］，兩組均大于未誘導組 C［（1.1±0.3）%］。三組兩兩比較，差異有統計學意義（P<0.01）。含 HaCaT 細胞條件培養基的誘導組 B 角蛋白 Pan-CK 表達率更高。
圖4
成表皮誘導后流式細胞儀檢測 Pan-CK 的表達直方圖
縱坐標為細胞數，橫坐標為熒光值；a. 誘導組 A，Pan-CK 表達率為 14.0%；b. 誘導組 B，Pan-CK 表達率為 20.7%；c. 未誘導組，Pan-CK 表達率為 0.8%
2.4 免疫熒光染色法檢測誘導后細胞 CK14 的表達
熒光顯微鏡下見脂肪干細胞成表皮誘導后，誘導組 A 及 B部分細胞具有標記 CK14 的紅色熒光表達（圖 5a、5b），未誘導組細胞 CK14 熒光染色為陰性（圖 5c）。誘導組 B CK14 熒光染色呈陽性細胞占總細胞比例［（19.5±7.0）%］高于誘導組 A［（10.8± 5.7）%］，差異有統計學意義（P<0.01）。
圖5
脂肪干細胞成表皮細胞誘導后 CK14 熒光染色
藍色為細胞核，紅色為 CK14 的表達；a. 誘導組 A；b. 誘導組 B；c. 未誘導組
3 討論
組織工程學技術的出現為人類組織與器官的修復重建帶來了新的希望。種子細胞為組織工程的三大要素之一。干細胞作為組織工程種子細胞的應用最具有前景。成體干細胞是成體不同組織的一群特殊的細胞，具有不同的分化能力，包括多能干細胞、寡能干細胞、定向干細胞等。間充質干細胞是其中的一大類，可以來源于骨髓、臍帶血、羊水、骨骼肌、脂肪組織等[12]。國際細胞治療學會制定了間充質干細胞最基本的標準：① 貼壁；② 多向分化的能力；③ 表達一些特殊的表面標志物：CD73，CD90，CD105；④ 不表達血管內皮來源及造血系統來源的表面標志物：CD11b 或 CD14，CD19 或 CD79，CD34，CD45 和人類白細胞抗原[13]。脂肪干細胞是來源于脂肪組織的間充質干細胞，與骨髓間充質干細胞相似，可以分化為中胚層細胞如脂肪細胞、成骨細胞、軟骨細胞等，其他胚層細胞如血管內皮細胞、神經纖維細胞、肌纖維細胞、肝細胞等[14-15]。由于取材的差異、分離培養方法的不盡相同以及培養傳代時間的長短等，CD34、CD106、CD146 表面標志物的表達在不同研究中存在一些差異[16-19]。本實驗從脂肪組織中分離培養的貼壁細胞在誘導培養基中實現了成脂和成骨的分化，表明了我們所獲細胞具有一定的多向分化能力。流式細胞術檢測結果顯示干細胞特征性表面標志物 CD73、CD90、CD105 表達率高，血管內皮來源及造血系統來源細胞特征性表面標志物 CD34、CD45 表達率低，與國際細胞治療學會制定的間充質干細胞的最基本標準相符。
2005 年，Brzoska 等[5]研究發現，ATRA 可誘導脂肪干細胞分化為表皮細胞，表明了脂肪干細胞具有跨胚層的成表皮分化的能力。在之后的研究中，也有學者利用 ATRA 聯合 EGF、KGF 等多種生長因子來提高脂肪干細胞的成表皮分化能力。Li 等[11]利用含 2.5 μmol/L ATRA、20 ng/mL EGF、10 ng/mL KGF、10 ng/mL HGF 的培養基行氣液界面誘導培養脂肪干細胞，CK 蛋白表達率相比未添加 KGF、HGF 組更高。類維甲酸通過與維甲酸核受體和維甲酸 X 核受體相結合在細胞的分化、增殖、凋亡中發揮著重要作用[20]。ATRA 是維生素 A 的活性代謝產物，能促進多種細胞的分化成熟[21]，在誘導干細胞向表皮細胞分化過程中發揮著重要作用。
氣液界面誘導模型讓細胞與空氣直接接觸可能具有促進干細胞上皮分化并形成復層結構的作用[22]，在 Long 等[6]的研究中，氣液界面的培養是干細胞上皮分化的一個必需條件。氣液界面培養結合 ATRA 及多種生長因子，模擬表皮細胞的自分泌旁分泌的生長微環境，誘導干細胞向表皮細胞方向分化[5-6, 12]。在本實驗中，誘導組 A 通過 ATRA 及多種生長因子結合氣液界面培養實現了脂肪干細胞誘導向表皮細胞方向的分化，鏡下可見細胞形態由長梭形變為短梭形，部分細胞為圓形或類圓形，近似鋪路石樣改變，免疫熒光法及流式細胞術檢測顯示細胞表達了 CK 類蛋白 Pan-CK 及 CK14。CK 類蛋白是上皮細胞特征性的蛋白，作為細胞骨架蛋白，在維持上皮細胞，尤其是角質形成細胞的機械穩定性、完整性方面發揮著重要作用。CK 蛋白家族成員較多，不同類型上皮組織表達 CK 蛋白類型也有差異。CK14 作為表皮基底層細胞的主要結構蛋白，主要表達于表皮未分化的基底細胞層，在基底層以上表達逐漸降低[23]。
由人腹部表皮衍化而成的 HaCaT 細胞株具有與正常人角質形成細胞相似的分化特征。HaCaT 可以分泌多種生長因子、細胞因子、趨化因子等[24-25]。HaCat 可能通過這些因子作用于干細胞，促進干細胞向表皮細胞表型的分化[7-9]。本實驗中，誘導組 B 為采用 50% HaCaT 的條件培養基聯合 ATRA 及多種生長因子共同作用下實現了脂肪干細胞向表皮細胞表型的分化，CK 蛋白表達率高于不含 HaCaT 條件培養基的誘導組 A。HaCaT 分泌的某些成分改變了培養基中的微環境，促進了脂肪干細胞向表皮細胞的分化，提高了 ATRA 及生長因子誘導脂肪干細胞向表皮細胞分化的能力。
綜上所述，添加 HaCaT 條件培養基提高了全反式維甲酸及 KGF、EGF 等生長因子對脂肪干細胞向表皮細胞誘導分化的作用，其中的具體分子機制還需要我們進一步探索研究。體外誘導脂肪干細胞向表皮細胞分化，為脂肪干細胞作為種子細胞構建組織工程皮膚提供了一個發展方向，為解決臨床上常見的大面積燒傷、嚴重創傷患者皮源緊缺等問題提供了一個新的探索途徑。
皮膚是人體最大的器官，大面積深度燒傷、急性創傷等可能造成大面積皮膚缺損。組織工程皮膚是修復大面積皮膚缺損有效方法之一。種子細胞為組織工程皮膚重要組成要素。以往研究較多的是角質形成細胞及成纖維細胞[1]。隨著干細胞研究的不斷深入，自體干細胞或許能成為組織工程領域理想的種子細胞。
間充質干細胞為近年來研究的熱點。脂肪來源間充質干細胞可以通過微創的方法從人體獲得，可以是體內多余的脂肪組織，對供體損傷小，來源豐富，體外容易培養，等量組織中干細胞含量要遠遠高于骨髓間充質干細胞；脂肪干細胞具有良好的自我增殖和多系分化潛能，能夠向脂肪細胞、成骨細胞、肝細胞、內皮細胞等組織細胞分化[2-4]。2005 年，Brzoska 等[5]研究發現，全反式維甲酸（all-trans-retinoic acid，ATRA）可誘導脂肪干細胞分化為表皮細胞，表明脂肪干細胞有向表皮方向分化的能力。Long 等[6]用 ATRA 聯合生長因子同樣誘導脂肪干細胞向表皮細胞分化。我國學者也利用人永生化角質形成細胞 HaCaT 與干細胞共培養的方式，成功誘導干細胞向表皮細胞表型分化[7-9]。誘導后表皮細胞角蛋白的表達率不同文獻報道差異較大，為 9%～80%[5, 7, 10]。本研究用 ATRA 及生長因子結合 HaCaT 細胞條件培養基作為誘導條件，探討提高脂肪干細胞向表皮誘導分化的方法。現報告如下。
1 材料與方法
1.1 標本
脂肪取自四川大學華西醫院美容整形/燒傷外科腹部取皮手術后多余的皮下脂肪組織或水動力抽脂機腹部抽吸的多余脂肪組織，研究經醫院倫理委員會審批通過，患者簽署相關知情同意書。
1.2 主要試劑與儀器
1.2.1 主要試劑
Dulbecco Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12（DMEM/F12）培養基（美國 Gibco 公司），Ⅰ型膠原酶（美國 Gibco 公司），胎牛血清（美國 Gibco 公司），山羊血清（杭州四季青公司），磷酸鹽緩沖液（北京中杉金橋公司），3-異丁基-1-甲基黃嘌呤（3-isobutyl-1-methyxanthine，IBMX）（美國 Sigma 公司），地塞米松（美國 Sigma 公司），胰酶（美國 Sigma 公司），PerCP-eFluor? 710 標記抗人 CD34 抗體（美國 eBioscience 公司），異硫氰酸熒光素標記抗人 CD45 抗體（美國 BD biosciences 公司），PE-Cyanine7 標記抗人 CD73 抗體（美國 eBioscience 公司），（Thy-1）別藻藍蛋白標記抗人 CD90 抗體（美國 BD biosciences 公司），藻紅蛋白標記抗人 CD105 抗體（美國 eBioscience 公司），藻紅蛋白標記鼠抗人細胞角蛋白（cytokeratin，CK）14、15、16、19 抗體（美國 BD Pharmingen 公司），ATRA（美國 Sigma 公司），表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）（美國 PeproTech 公司），角質細胞生長因子（keratinocyte growth factor，KGF）（美國 PeproTech 公司），異硫氰酸熒光素標記山羊抗兔免疫球蛋白 G（immunoglobulin G，IgG）（北京中杉金橋公司），Alexa Fluor594 標記山羊抗鼠 IgG（美國 Life Technology 公司），Ⅳ型膠原（美國 Sigma 公司），CK14 抗體（美國 Proteintech 公司），HaCaT 細胞（美國 ATCC 公司）。
1.2.2 主要儀器
顯微鏡（日本 Nikon 公司），全自動熒光顯微鏡（德國 Zeiss 公司），倒置相差顯微鏡（日本 Olympus 公司），二氧化碳培養箱（日本 Sanyo 公司），電子天平（德國 Christ 公司），熒光酶標儀（德國 Leica 公司），流式細胞儀（美國 Beckman Coulter 公司）
1.3 方法
1.3.1 脂肪干細胞的分離培養
取新鮮脂肪組織，低溫 3 h 內轉移至實驗室超凈工作臺。用磷酸緩沖鹽溶液沖洗脂肪組織 3 次。用眼科剪修去脂肪組織中混有的筋膜及血管組織，并修剪為直徑約 5 mm 的脂肪粒。將該脂肪粒轉移至安瓶中修剪為 1 mm3左右大小的碎片。分別取 10 mL 脂肪碎片及 10 mL 0.1% 的Ⅰ型膠原酶置入 50 mL 離心管，充分搖勻，并置于 37℃ 水浴鍋振蕩消化 40～60 min 至漿糊狀。15 mL 磷酸緩沖鹽溶液加入離心管中稀釋消化液，搖勻，并置于離心機中 1 200 r/min，離心 1 min。吸出上層脂肪組織，保留下層液體組織，于離心機中 1 200 r/min，繼續離心 5 min。吸凈上清液，保留沉淀。用 5 mL 含 10% 胎牛血清的 DMEM/F12 重懸，200 目篩網過濾，過濾后液體接種于 25 cm2培養瓶。實驗使用第 3～5 代內細胞。
1.3.2 脂肪干細胞的鑒定
鑒定細胞為生長狀態良好的第 3 代脂肪干細胞。制成 3×105/50 μL 單細胞懸液，分別加入熒光標記的抗體 CD34、CD45、CD73、CD90、CD105，混勻，避光孵育，離心，重懸，流式細胞儀檢測。
成脂誘導以 8 000/cm2的密度接種。成脂誘導培養基配制：10% 胎牛血清，DMEM/F12，0.5 mmol/L IBMX，1 μmol/L 地塞米松，10 μmol/L 胰島素，200 μmol/L 吲哚美辛。誘導 2 周后。油紅 O 染色。鏡下觀察脂滴的形成。
成骨誘導以 4 000/cm2的密度接種。成骨誘導培養基配制：10% 胎牛血清，DMEM/F12，0.1 μmol/L 地塞米松，50 μmol/L 抗壞血酸，10 mmol/L β-甘油磷酸鈉。誘導 4 周后。茜素紅染色，鏡下觀察鈣結節的形成。
1.3.3 表皮細胞誘導培養基的配制
① 表皮細胞誘導培養基 A 配制：DMEM/F12，2% 胎牛血清，5 μmol/L ATRA，20 ng/mL EGF，10 ng/mL KGF，0.1 μmol/L 地塞米松。② 表皮細胞誘導培養基 B 配制：取 60%～70% 融合狀態下的 HaCaT 細胞，更換新鮮 DMEM/F12 培養基，孵箱中培養 48 h 后吸出培養基，0.22 μm 過濾器過濾除菌制備成 HaCaT 條件培養基備用。將 HaCaT 條件培養基與普通培養基按 1∶1 比例配制為含 50% HaCaT 上清液的培養基，并將培養基配制為含 2% 胎牛血清、5 μmol/L ATRA、20 ng/mL EGF、10 ng/mL KGF、0.1 μmol/L 地塞米松的表皮誘導培養基 B。
1.3.4 誘導脂肪干細胞向表皮細胞方向分化
Transwell 小室為插入式的培養皿[11]，不同孔徑及不同膜處理的 Transwell 小室，常應用于共培養、細胞趨化、細胞遷移、細胞侵襲等多方面的研究。本實驗用六孔板 Transwell 小室構建氣液界面培養。取Ⅳ型膠原包被小室膜。脂肪干細胞以 6 000/cm2的密度接種于小室膜上。上室加入 1 mL 培養基，下室加入 2 mL 培養基。24 h 后吸凈上室培養基，下室更換條件培養基達上室膜平面，構建氣液界面誘導培養。見圖 1。
實驗分 3 組：誘導組 A 為表皮誘導培養基 A，誘導組 B 為表皮誘導培養基 B，未誘導組為 DMEM/F12 普通培養基。置于 37℃ 5% 二氧化碳孵箱中培養。每 3 天換液 1 次，連續誘導 12 d，共 6 例原代細胞。
圖1
Transwell 小室構建氣液界面培養皿
將 Transwell 小室放入六孔板中，小室內稱上室，孔板內稱下室。兩室以 3 μm 孔徑的聚碳酸酯膜相隔，上室聚碳酸酯膜面接種細胞，下室加入培養基至膜面，構成氣液界面培養
1.3.5 流式細胞術檢測誘導后細胞 CK14、15、16、19 廣譜細胞角蛋白（pan cytokeratin，Pan-CK）的表達
取各組培養 12 d 后細胞，消化、離心、重懸，4% 多聚甲醛固定 10 min，聚氧乙烯辛基苯基醚 Triton-X 100 破膜 10 min，制成 3×105/50 μL 單細胞懸液，加入帶熒光的 Pan-CK 抗體，室溫避光孵育 30 min，流式細胞儀檢測。
1.3.6 免疫熒光染色法檢測誘導后細胞 CK14 的表達
取各組培養 12 d 的細胞，胰酶乙二胺四乙酸消化后，以 2×104/cm2的密度接種于包被有Ⅳ型膠原的細胞爬片上，相應培養基繼續培養 2 d。取出爬片，按照免疫熒光染色的步驟：4% 多聚甲醛室溫 15 min 固定，Triton X-100 室溫 20 min 破膜，羊血清 20 min 封閉爬片，1∶50 的濃度稀釋鼠抗人 CK14 單克隆抗體，4℃ 過夜。1∶250 稀釋 Alexa Fluor59 標記山羊抗鼠 IgG，避光 37℃ 1 h，4，6-聯脒-2-苯基吲哚液染色，室溫避光 5 min。熒光顯微鏡觀察，每例細胞誘導 3 次，每次隨機選取 4 個視野，Image-pro plus 軟件計算每視野呈藍色熒光細胞核的數量，人工點數紅色熒光細胞的數量。計算每視野下紅色熒光陽性細胞占總細胞的平均比例。
1.4 統計學方法
采用 SPSS 19.0 軟件進行統計學數據分析。數據以均數±標準差表示，兩組比較采用 t 檢驗進行統計學分析，三組比較采用 Kruskal-Wallis 秩和檢驗，若三組差異有統計學意義，采用 Nemenyi 檢驗進行兩兩比較。檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 脂肪干細胞的分離培養與鑒定
新分離的脂肪干細胞鏡下可見呈圓球形，透亮，并混有較多小圓形紅細胞。48 h 后鏡下可見貼壁細胞增多，細胞呈短梭形。第 7 天左右細胞達到 90% 融合。傳代培養至第 10 代，細胞形態基本保持不變。第 3 代細胞如圖 2a 所示：成纖維細胞形態樣生長，長梭形，旋渦狀。脂肪干細胞成脂誘導培養基培養后，油紅 O 染色，可見細胞內大量大小不一的紅棕色脂滴形成（圖 2b）。成骨誘導培養基培養后，茜素紅染色，可見深棕色鈣結節形成（圖 2c）。
流式細胞術檢測細胞表面標志物，CD34、CD45 為造血干細胞及內皮細胞來源特征抗原，CD73、CD90、CD105 是間充質干細胞來源特征抗原，見表 1。本實驗原代培養的細胞符合間充質干細胞的表面特征性抗原的表達，內皮細胞及造血細胞污染小。
圖2
原代培養脂肪干細胞及成脂成骨誘導分化
a. 原代培養第 3 代細胞（×40），可見成纖維細胞形態樣生長，長梭形，旋渦狀；b. 成脂誘導分化后油紅 O 染色（×100），可見細胞內大量大小不一紅棕色脂滴形成；c. 成骨誘導分化后茜素紅染色（×100），可見深棕色不均質鈣結節形成
表1
脂肪干細胞表面標志物表達率（n=6，%，
）
2.2 成表皮細胞誘導后鏡下觀察
Transwell 小室膜光學顯微鏡下為非透明膜。誘導 12 d 后制備細胞爬片并繼續誘導培養 3 d，鏡下所見如圖 3 所示。
圖3
脂肪干細胞成表皮誘導后鏡下觀察
誘導組可見細胞形態小，形態由長梭形變為短梭形，部分細胞為圓形或類圓形，近似鋪路石樣改變；誘導組兩組細胞形態無明顯差異；未誘導組可見細胞仍保持條梭形，部分細胞開始出現老化的現象
2.3 流式細胞術檢測細胞表面標志物 Pan-CK 的表達
共 6 例原代培養脂肪干細胞完成了誘導，誘導組均有不同程度表皮細胞標記 Pan-CK 的表達。其中 1 例細胞流式檢測結果如圖 4。流式細胞結果顯示誘導組 B Pan-CK 表達率［（22.0±3.5）%］大于誘導組 A［（11.9±2.7）%］，兩組均大于未誘導組 C［（1.1±0.3）%］。三組兩兩比較，差異有統計學意義（P<0.01）。含 HaCaT 細胞條件培養基的誘導組 B 角蛋白 Pan-CK 表達率更高。
圖4
成表皮誘導后流式細胞儀檢測 Pan-CK 的表達直方圖
縱坐標為細胞數，橫坐標為熒光值；a. 誘導組 A，Pan-CK 表達率為 14.0%；b. 誘導組 B，Pan-CK 表達率為 20.7%；c. 未誘導組，Pan-CK 表達率為 0.8%
2.4 免疫熒光染色法檢測誘導后細胞 CK14 的表達
熒光顯微鏡下見脂肪干細胞成表皮誘導后，誘導組 A 及 B部分細胞具有標記 CK14 的紅色熒光表達（圖 5a、5b），未誘導組細胞 CK14 熒光染色為陰性（圖 5c）。誘導組 B CK14 熒光染色呈陽性細胞占總細胞比例［（19.5±7.0）%］高于誘導組 A［（10.8± 5.7）%］，差異有統計學意義（P<0.01）。
圖5
脂肪干細胞成表皮細胞誘導后 CK14 熒光染色
藍色為細胞核，紅色為 CK14 的表達；a. 誘導組 A；b. 誘導組 B；c. 未誘導組
3 討論
組織工程學技術的出現為人類組織與器官的修復重建帶來了新的希望。種子細胞為組織工程的三大要素之一。干細胞作為組織工程種子細胞的應用最具有前景。成體干細胞是成體不同組織的一群特殊的細胞，具有不同的分化能力，包括多能干細胞、寡能干細胞、定向干細胞等。間充質干細胞是其中的一大類，可以來源于骨髓、臍帶血、羊水、骨骼肌、脂肪組織等[12]。國際細胞治療學會制定了間充質干細胞最基本的標準：① 貼壁；② 多向分化的能力；③ 表達一些特殊的表面標志物：CD73，CD90，CD105；④ 不表達血管內皮來源及造血系統來源的表面標志物：CD11b 或 CD14，CD19 或 CD79，CD34，CD45 和人類白細胞抗原[13]。脂肪干細胞是來源于脂肪組織的間充質干細胞，與骨髓間充質干細胞相似，可以分化為中胚層細胞如脂肪細胞、成骨細胞、軟骨細胞等，其他胚層細胞如血管內皮細胞、神經纖維細胞、肌纖維細胞、肝細胞等[14-15]。由于取材的差異、分離培養方法的不盡相同以及培養傳代時間的長短等，CD34、CD106、CD146 表面標志物的表達在不同研究中存在一些差異[16-19]。本實驗從脂肪組織中分離培養的貼壁細胞在誘導培養基中實現了成脂和成骨的分化，表明了我們所獲細胞具有一定的多向分化能力。流式細胞術檢測結果顯示干細胞特征性表面標志物 CD73、CD90、CD105 表達率高，血管內皮來源及造血系統來源細胞特征性表面標志物 CD34、CD45 表達率低，與國際細胞治療學會制定的間充質干細胞的最基本標準相符。
2005 年，Brzoska 等[5]研究發現，ATRA 可誘導脂肪干細胞分化為表皮細胞，表明了脂肪干細胞具有跨胚層的成表皮分化的能力。在之后的研究中，也有學者利用 ATRA 聯合 EGF、KGF 等多種生長因子來提高脂肪干細胞的成表皮分化能力。Li 等[11]利用含 2.5 μmol/L ATRA、20 ng/mL EGF、10 ng/mL KGF、10 ng/mL HGF 的培養基行氣液界面誘導培養脂肪干細胞，CK 蛋白表達率相比未添加 KGF、HGF 組更高。類維甲酸通過與維甲酸核受體和維甲酸 X 核受體相結合在細胞的分化、增殖、凋亡中發揮著重要作用[20]。ATRA 是維生素 A 的活性代謝產物，能促進多種細胞的分化成熟[21]，在誘導干細胞向表皮細胞分化過程中發揮著重要作用。
氣液界面誘導模型讓細胞與空氣直接接觸可能具有促進干細胞上皮分化并形成復層結構的作用[22]，在 Long 等[6]的研究中，氣液界面的培養是干細胞上皮分化的一個必需條件。氣液界面培養結合 ATRA 及多種生長因子，模擬表皮細胞的自分泌旁分泌的生長微環境，誘導干細胞向表皮細胞方向分化[5-6, 12]。在本實驗中，誘導組 A 通過 ATRA 及多種生長因子結合氣液界面培養實現了脂肪干細胞誘導向表皮細胞方向的分化，鏡下可見細胞形態由長梭形變為短梭形，部分細胞為圓形或類圓形，近似鋪路石樣改變，免疫熒光法及流式細胞術檢測顯示細胞表達了 CK 類蛋白 Pan-CK 及 CK14。CK 類蛋白是上皮細胞特征性的蛋白，作為細胞骨架蛋白，在維持上皮細胞，尤其是角質形成細胞的機械穩定性、完整性方面發揮著重要作用。CK 蛋白家族成員較多，不同類型上皮組織表達 CK 蛋白類型也有差異。CK14 作為表皮基底層細胞的主要結構蛋白，主要表達于表皮未分化的基底細胞層，在基底層以上表達逐漸降低[23]。
由人腹部表皮衍化而成的 HaCaT 細胞株具有與正常人角質形成細胞相似的分化特征。HaCaT 可以分泌多種生長因子、細胞因子、趨化因子等[24-25]。HaCat 可能通過這些因子作用于干細胞，促進干細胞向表皮細胞表型的分化[7-9]。本實驗中，誘導組 B 為采用 50% HaCaT 的條件培養基聯合 ATRA 及多種生長因子共同作用下實現了脂肪干細胞向表皮細胞表型的分化，CK 蛋白表達率高于不含 HaCaT 條件培養基的誘導組 A。HaCaT 分泌的某些成分改變了培養基中的微環境，促進了脂肪干細胞向表皮細胞的分化，提高了 ATRA 及生長因子誘導脂肪干細胞向表皮細胞分化的能力。
綜上所述，添加 HaCaT 條件培養基提高了全反式維甲酸及 KGF、EGF 等生長因子對脂肪干細胞向表皮細胞誘導分化的作用，其中的具體分子機制還需要我們進一步探索研究。體外誘導脂肪干細胞向表皮細胞分化，為脂肪干細胞作為種子細胞構建組織工程皮膚提供了一個發展方向，為解決臨床上常見的大面積燒傷、嚴重創傷患者皮源緊缺等問題提供了一個新的探索途徑。
