引用本文： 譚惠文, 潘華, 余葉蓉, 龍洋, 張祥迅. 糖脂毒性對肥胖大鼠酮體生成及骨骼肌線粒體結構的影響. 華西醫學, 2017, 32(12): 1841-1845. doi: 10.7507/1002-0179.201611042 復制
胰島素抵抗和胰島素分泌缺陷是發生2 型糖尿病的主要病理生理機制，胰島素敏感性下降是肥胖和糖尿病普遍存在的一種現象[1]。骨骼肌是葡萄糖攝取和利用的主要場所，也是胰島素作用的主要靶器官之一，與外周胰島素敏感性密切相關[2]。大量細胞研究發現，持續存在的高血糖及高游離脂肪酸（free fat acid，FFA）血癥可嚴重抑制 β 細胞的胰島素合成和分泌，即所謂的“糖毒性”與“脂毒性”學說[3-4]。隨著對胰島素抵抗和糖尿病認識的不斷深入，越來越多的研究者開始關注糖脂代謝紊亂對胰島素敏感性的影響[5]。臨床上觀察到一類具有自發性酮癥傾向的肥胖初診糖尿病患者表現為嚴重高血糖和高 FFA 血癥，其胰島素抵抗遠較單純性肥胖和無酮癥傾向的初發 2 型糖尿病患者嚴重，我們認為糖脂毒性可能通過改變胰島素的靶組織（肝臟和骨骼肌）的超微結構尤其是線粒體的結構和功能從而影響機體代謝和胰島素敏感性[6]。因此本研究通過外源性升高循環中葡萄糖和 FFA 水平，探討高糖和高 FFA 聯合作用對肥胖大鼠的酮體生成及骨骼肌超微結構和功能的影響。現報告如下。
1 材料與方法
1.1 肥胖/胰島素抵抗動物模型的建立
健康清潔級雄性 Wistar 大鼠 50 只，4 周齡，體質量 200 g 左右（由四川大學華西臨床醫學院動物中心提供），普通飼料適應性喂養 1 周，單籠喂養，正常晝夜交替，自由攝食及飲水，采用隨機數字表法分為 2 組：普通飼料（1 736.36 kJ/100 g）喂養的正常對照組（NC 組，n=10）及高脂高能量飼料（1 085.23 kJ/100 g）誘導肥胖組（OB 組，n=40）。每周監測各組大鼠進食量、飲水量及體質量變化；喂養 12 周后 OB 組和 NC 組各取 5 只行正常血糖-高胰島素鉗夾技術（euglycemic-hyperinsulinemic clamp technique，EHCT）評估兩組大鼠外周胰島素敏感性。
1.2 EHCT
根據文獻方法[7-8]，OB 組和 NC 組大鼠經頸靜脈按 12 mU/（kg·min）的速度輸注短效人胰島素和 20% 葡萄糖液。每 10 分鐘從頸動脈取血測定血糖值，根據血糖測定結果調節葡萄糖輸注速度，維持血糖水平在（5.0±0.28）mmol/L。計算穩態期葡萄糖輸注速率（glucose infusion rate，GIR）。EHCT 開始前及結束時分別采血 500 μL，分離血清后置–20℃ 冰箱保存，以備統一檢測胰島素水平。GIR 的計算方法：GIR[mg/（kg·min）]=穩定期葡萄糖的平均輸入速度（mL/h）×178/[60×體質量（kg）×微泵校正系數]。
1.3 小劑量葡萄糖/脂肪乳持續輸注
OB 組大鼠行頸動靜脈插管，休息 3 d 待動物體質量和飲食量恢復穩定時開始經頸靜脈輸液。OB 組大鼠采用隨機數字表法分為 4 個亞組（成功插管輸液共計 33 只，失敗 2 只）：對照組（OB-P，n=7）輸注生理鹽水；高糖組（OB-Glu，n=9）輸注 20% 葡萄糖，輸入速率 0.8～2.0 mL/h，維持循環中葡萄糖水平為 11 mmol/L 左右；高 FFA 組（OB-FFA，n=8）輸注 20% 英脫匹利特+肝素（英脫匹利特∶肝素=1 mL∶40 U），輸入速率 0.6～1.2 mL/h，維持循環中 FFA 水平高于基礎值的 2～3 倍。高糖高 FFA 組（OB-FFA+Glu，n=9）輸注輸注 20% 英脫匹利特+50% 葡萄糖，其中葡萄糖輸入速率 0.3～1.0 mL/h，維持循環中葡萄糖水平為 11 mmol/L 左右和 FFA 水平高于基礎值的 2～3 倍。靜脈輸液持續時間 48 h，輸注期間每 12 小時監測血 FFA、血糖水平。
1.4 透射電子顯微鏡觀察骨骼肌超微結構改變
NC 組和輸液后的 OB 組大鼠用 2.5% 戊巴比妥鈉腹腔內注射麻醉后，處死大鼠，剪取后肢股四頭肌剪為 1.0 cm×1.0 cm×0.5 cm 大小的組織塊，經 3% 戊二醛磷酸鹽緩沖液預固定 2 h，0.1 mmol/L 磷酸緩沖液漂洗，1% 鋨酸再固定，丙酮逐級脫水，Epon812 包埋，半薄切片光學定位，LVB-V 型切片機超薄切片，醋酸鈾及枸櫞酸鉛雙重染色，日立 H-600IV 型透射電鏡觀察，采圖并分析。
1.5 觀察指標和血標本檢測
① 體質量和體質量脂肪比，體質量脂肪比=（皮下脂肪質量+內臟脂肪質量）/體質量；② 血糖：葡萄糖氧化酶法測定；③ 血脂：三酰甘油（triglyceride，TG），總膽固醇（total cholesterol，TC）、高密度脂蛋白-膽固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）和低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）：采用酶法（德國羅氏公司）測定；④ 胰島素/C 肽：血清胰島素采用放射免疫法（胰島素試劑盒，北京北方生物研究所）測定，血清 C 肽采用放射免疫法（北京北方生物研究所）測定；⑤ 血 FFA、β-羥丁酸（β-hydroxybutyric acid，β-HBA）檢測采用比色法；⑥ 觀察 OB 組大鼠各亞組輸液后的 TG、TC、FFA 和 β-HBA 水平等生化指標和透射電鏡下的顯微結構變化，并分別與 OB-P 組比較。
1.6 統計學方法
采用 SPSS 11.5 軟件進行統計學分析。計量資料以均數±標準差表示，兩組間比較采用 t 檢驗或 t’ 檢驗，多組間均數比較采用單因素方差分析，多個樣本均數間兩兩比較采用 q 檢驗。檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 兩組大鼠體質量、體脂肪變化和外周胰島素敏感性比較
實驗開始時各組大鼠體質量無明顯差異，應用普通飼料和高脂飼料分組喂養后，各組大鼠體質量均隨時間而增加，但隨時間的延長，各組大鼠的體質量增幅出現明顯差異，進食量和飲水量組間未見明顯差異，各肥胖組的體質量和體脂比值高于正常對照組（P<0.05）。見表 1。
表1
兩組大鼠一般情況比較（
）
高脂高能量飼料喂養的 OB 組大鼠 EHCT 穩態期 GIR 明顯較普通飼料喂養的 NC 組大鼠低[（19.26±1.84）vs.（28.82±1.69）mg/ （kg·min），t=–15.230，P<0.001]，提示高脂誘導的肥胖/胰島素抵抗模型已經成功建立。
2.2 OB 組大鼠靜脈輸液后 FFA 和酮體水平變化
輸液結束后，OB-Glu 組的 TC 與 FFA，OB-FFA 組和 OB-FFA+Glu 組的 TG、TC、FFA 和 β-HBA 水平均高于 OB-P 組，差異均有統計學意義（P<0.05）。見表 2。
表2
OB 組組內各亞組大鼠輸液后的 TG、TC、FFA 和 β-HBA 水平比較（
）
2.3 各組大鼠靜脈輸液后骨骼肌超微結構的改變
NC 組大鼠骨骼肌細胞中線粒體結構完整，線粒體嵴清晰，無腫脹，肌纖維排列整齊，無萎縮，骨骼肌毛細血管內皮細胞未見腫脹，基底膜完整。OB 組大鼠組骨骼肌細胞核染色質濃聚致密化，形成形狀不一、大小不等的團塊邊集于核膜處；細胞質內線粒體腫脹，嵴排列紊亂、斷裂，線粒體旁可見大小不等的脂滴。以糖脂聯合輸注的 OB-FFA+Glu 組最為明顯，細胞質中呈大片脂滴，細胞器被擠壓變形，線粒體基質明顯腫脹、嵴斷裂，呈明顯空泡化。見圖 1。
圖1
各組大鼠骨骼肌細胞超微結構透射電子顯微鏡像
a. NC 組骨骼肌超微結構（×10 000）；b. OB 組大鼠骨骼肌超微結構 （×12 000）；c. OB-P 組大鼠超微結構：骨骼肌細胞線粒體有輕度腫脹，嵴結構排列紊亂，毛細血管內皮細胞無腫脹，基底膜尚完整（×8 000）；d. OB-Glu 組大鼠超微結構：骨骼肌細胞線粒體數量減少空泡化明顯（×20 000）；e. OB-FFA 組大鼠超微結構：細胞線粒體腫脹變形，嵴排列紊亂（×10 000）；f. OB-FFA+Glu 組大鼠超微結構：骨骼肌細胞脂滴含量增加，可見大量空泡形成（×10 000）
3 討論
高脂飼料喂養 4 周以上的肥胖大鼠是一種公認的胰島素抵抗動物模型[9]。本研究采用高脂高能量飼料喂養 12 周的肥胖大鼠為研究對象，通過 EHCT 評價外周組織胰島素敏感性，結果顯示高脂飼料成功誘導出肥胖大鼠模型。我們發現 OB 組大鼠循環中的TG和 FFA 水平明顯升高，體脂比值增加明顯，尤其是內臟脂肪含量遠高于 NC 組。既往研究顯示，內臟脂肪含量增加是胰島素抵抗的重要環節[10]。經過高脂高能量飼料喂養的 OB 組大鼠穩態期 GIR 值明顯降低，提示高脂飲食成功誘導胰島素抵抗。在采用 EHCT 金標準技術確定胰島素抵抗動物模型構建成功后，通過外源性升高肥胖大鼠血糖和（或）血 FFA 水平，研究糖脂毒性對肥胖大鼠酮體生成和骨骼肌超微結構的影響。
我們前期研究表明，外源性輸注脂肪乳和葡萄糖可升高循環中的 FFA 濃度和血糖水平[11]。葡萄糖和 FFA 是體內骨骼肌最主要的代謝底物，本研究采用脂肪乳和葡萄糖單獨輸注以及聯合輸注，通過持續外源性葡萄糖和（或）脂肪乳靜脈輸注模擬酮癥傾向糖尿病患者急性期的高血糖和高 FFA 血癥狀態，研究糖脂聯合毒性對肥胖大鼠酮體生成的影響。并以生理鹽水作為參照，評估外源性升高肥胖大鼠血糖和（或）血 FFA 水平對于肥胖大鼠酮體生成的影響，結果顯示脂肪乳的輸注可導致體內 β-HBA 水平不同程度增加，以糖脂聯合輸注組尤為明顯，遠甚于單獨的葡萄糖或脂肪乳輸注組，表明糖毒性和脂毒性的聯合作用使得機體代謝紊亂，酮體生成增加。
本研究顯示持續小劑量外源性輸注葡萄糖和脂肪乳不但使得循環中血糖和 FFA 水平升高導致酮癥傾向，還對外周組織尤其是胰島素敏感的靶組織——骨骼肌產生影響。本研究中電子顯微鏡下可觀察到肥胖組大鼠在葡萄糖和（或）脂肪乳負荷后骨骼肌細胞線粒體明顯腫脹，線粒體嵴斷裂，線粒體呈空泡樣改變。研究表明骨骼肌是葡萄糖代謝的重要場所，但是值得注意的是靜息狀態下骨骼肌主要的能量來源是循環中非酯化的 FFA，骨骼肌的胰島素敏感性降低是機體胰島素抵抗的重要組成部分[12]。Randle 葡萄糖脂肪酸循環學說提示，在骨骼肌的基礎代謝中葡萄糖和 FFA 的氧化是互相競爭的，循環中的高 FFA 使肌肉 FFA 氧化增加，使葡萄糖非氧化利用減少，同時 FFA 可以抑制胰島素 IRS/IP-3 信號通路，導致外周葡萄糖轉運和利用障礙，最終形成外周胰島素抵抗[10-15]。本研究中提示糖脂負荷過重使得骨骼肌細胞異位脂質沉積，導致線粒體結構受損，細胞的代謝效能下降，而產生糖和 FFA 的氧化障礙。由此可見，肥胖大鼠模型研究提示糖脂毒性帶來骨骼肌等胰島素靶器官或組織受損[16-17]。結合我們的糖脂毒性對胰島素分泌的影響的初步研究結果表明：肥胖糖尿病患者酮癥傾向的可能機制是在胰島素嚴重抵抗的背景下，脂聯合作用帶來的胰島素的絕對缺乏，導致酮體生成過多和外周組織對酮體的氧化利用障礙，最終導致酮體的堆積而產生酮癥傾向[18-19]。
綜上，骨骼肌是葡萄糖代謝的重要組織，骨骼肌胰島素敏感性降低是機體胰島素抵抗的主要原因，本研究在胰島素抵抗背景下通過外源性升高循環中葡萄糖和 FFA 水平，結果肥胖大鼠體內酮體等產物生成增加。高葡萄糖和高 FFA 作用下骨骼肌線粒體的受損提示線粒體是糖脂毒性可能的作用靶點，由于胰島素信號通路的復雜性，胰島素抵抗的具體病理生理機制有待進一步進行深入研究。
胰島素抵抗和胰島素分泌缺陷是發生2 型糖尿病的主要病理生理機制，胰島素敏感性下降是肥胖和糖尿病普遍存在的一種現象[1]。骨骼肌是葡萄糖攝取和利用的主要場所，也是胰島素作用的主要靶器官之一，與外周胰島素敏感性密切相關[2]。大量細胞研究發現，持續存在的高血糖及高游離脂肪酸（free fat acid，FFA）血癥可嚴重抑制 β 細胞的胰島素合成和分泌，即所謂的“糖毒性”與“脂毒性”學說[3-4]。隨著對胰島素抵抗和糖尿病認識的不斷深入，越來越多的研究者開始關注糖脂代謝紊亂對胰島素敏感性的影響[5]。臨床上觀察到一類具有自發性酮癥傾向的肥胖初診糖尿病患者表現為嚴重高血糖和高 FFA 血癥，其胰島素抵抗遠較單純性肥胖和無酮癥傾向的初發 2 型糖尿病患者嚴重，我們認為糖脂毒性可能通過改變胰島素的靶組織（肝臟和骨骼肌）的超微結構尤其是線粒體的結構和功能從而影響機體代謝和胰島素敏感性[6]。因此本研究通過外源性升高循環中葡萄糖和 FFA 水平，探討高糖和高 FFA 聯合作用對肥胖大鼠的酮體生成及骨骼肌超微結構和功能的影響。現報告如下。
1 材料與方法
1.1 肥胖/胰島素抵抗動物模型的建立
健康清潔級雄性 Wistar 大鼠 50 只，4 周齡，體質量 200 g 左右（由四川大學華西臨床醫學院動物中心提供），普通飼料適應性喂養 1 周，單籠喂養，正常晝夜交替，自由攝食及飲水，采用隨機數字表法分為 2 組：普通飼料（1 736.36 kJ/100 g）喂養的正常對照組（NC 組，n=10）及高脂高能量飼料（1 085.23 kJ/100 g）誘導肥胖組（OB 組，n=40）。每周監測各組大鼠進食量、飲水量及體質量變化；喂養 12 周后 OB 組和 NC 組各取 5 只行正常血糖-高胰島素鉗夾技術（euglycemic-hyperinsulinemic clamp technique，EHCT）評估兩組大鼠外周胰島素敏感性。
1.2 EHCT
根據文獻方法[7-8]，OB 組和 NC 組大鼠經頸靜脈按 12 mU/（kg·min）的速度輸注短效人胰島素和 20% 葡萄糖液。每 10 分鐘從頸動脈取血測定血糖值，根據血糖測定結果調節葡萄糖輸注速度，維持血糖水平在（5.0±0.28）mmol/L。計算穩態期葡萄糖輸注速率（glucose infusion rate，GIR）。EHCT 開始前及結束時分別采血 500 μL，分離血清后置–20℃ 冰箱保存，以備統一檢測胰島素水平。GIR 的計算方法：GIR[mg/（kg·min）]=穩定期葡萄糖的平均輸入速度（mL/h）×178/[60×體質量（kg）×微泵校正系數]。
1.3 小劑量葡萄糖/脂肪乳持續輸注
OB 組大鼠行頸動靜脈插管，休息 3 d 待動物體質量和飲食量恢復穩定時開始經頸靜脈輸液。OB 組大鼠采用隨機數字表法分為 4 個亞組（成功插管輸液共計 33 只，失敗 2 只）：對照組（OB-P，n=7）輸注生理鹽水；高糖組（OB-Glu，n=9）輸注 20% 葡萄糖，輸入速率 0.8～2.0 mL/h，維持循環中葡萄糖水平為 11 mmol/L 左右；高 FFA 組（OB-FFA，n=8）輸注 20% 英脫匹利特+肝素（英脫匹利特∶肝素=1 mL∶40 U），輸入速率 0.6～1.2 mL/h，維持循環中 FFA 水平高于基礎值的 2～3 倍。高糖高 FFA 組（OB-FFA+Glu，n=9）輸注輸注 20% 英脫匹利特+50% 葡萄糖，其中葡萄糖輸入速率 0.3～1.0 mL/h，維持循環中葡萄糖水平為 11 mmol/L 左右和 FFA 水平高于基礎值的 2～3 倍。靜脈輸液持續時間 48 h，輸注期間每 12 小時監測血 FFA、血糖水平。
1.4 透射電子顯微鏡觀察骨骼肌超微結構改變
NC 組和輸液后的 OB 組大鼠用 2.5% 戊巴比妥鈉腹腔內注射麻醉后，處死大鼠，剪取后肢股四頭肌剪為 1.0 cm×1.0 cm×0.5 cm 大小的組織塊，經 3% 戊二醛磷酸鹽緩沖液預固定 2 h，0.1 mmol/L 磷酸緩沖液漂洗，1% 鋨酸再固定，丙酮逐級脫水，Epon812 包埋，半薄切片光學定位，LVB-V 型切片機超薄切片，醋酸鈾及枸櫞酸鉛雙重染色，日立 H-600IV 型透射電鏡觀察，采圖并分析。
1.5 觀察指標和血標本檢測
① 體質量和體質量脂肪比，體質量脂肪比=（皮下脂肪質量+內臟脂肪質量）/體質量；② 血糖：葡萄糖氧化酶法測定；③ 血脂：三酰甘油（triglyceride，TG），總膽固醇（total cholesterol，TC）、高密度脂蛋白-膽固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）和低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）：采用酶法（德國羅氏公司）測定；④ 胰島素/C 肽：血清胰島素采用放射免疫法（胰島素試劑盒，北京北方生物研究所）測定，血清 C 肽采用放射免疫法（北京北方生物研究所）測定；⑤ 血 FFA、β-羥丁酸（β-hydroxybutyric acid，β-HBA）檢測采用比色法；⑥ 觀察 OB 組大鼠各亞組輸液后的 TG、TC、FFA 和 β-HBA 水平等生化指標和透射電鏡下的顯微結構變化，并分別與 OB-P 組比較。
1.6 統計學方法
采用 SPSS 11.5 軟件進行統計學分析。計量資料以均數±標準差表示，兩組間比較采用 t 檢驗或 t’ 檢驗，多組間均數比較采用單因素方差分析，多個樣本均數間兩兩比較采用 q 檢驗。檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 兩組大鼠體質量、體脂肪變化和外周胰島素敏感性比較
實驗開始時各組大鼠體質量無明顯差異，應用普通飼料和高脂飼料分組喂養后，各組大鼠體質量均隨時間而增加，但隨時間的延長，各組大鼠的體質量增幅出現明顯差異，進食量和飲水量組間未見明顯差異，各肥胖組的體質量和體脂比值高于正常對照組（P<0.05）。見表 1。
表1
兩組大鼠一般情況比較（
）
高脂高能量飼料喂養的 OB 組大鼠 EHCT 穩態期 GIR 明顯較普通飼料喂養的 NC 組大鼠低[（19.26±1.84）vs.（28.82±1.69）mg/ （kg·min），t=–15.230，P<0.001]，提示高脂誘導的肥胖/胰島素抵抗模型已經成功建立。
2.2 OB 組大鼠靜脈輸液后 FFA 和酮體水平變化
輸液結束后，OB-Glu 組的 TC 與 FFA，OB-FFA 組和 OB-FFA+Glu 組的 TG、TC、FFA 和 β-HBA 水平均高于 OB-P 組，差異均有統計學意義（P<0.05）。見表 2。
表2
OB 組組內各亞組大鼠輸液后的 TG、TC、FFA 和 β-HBA 水平比較（
）
2.3 各組大鼠靜脈輸液后骨骼肌超微結構的改變
NC 組大鼠骨骼肌細胞中線粒體結構完整，線粒體嵴清晰，無腫脹，肌纖維排列整齊，無萎縮，骨骼肌毛細血管內皮細胞未見腫脹，基底膜完整。OB 組大鼠組骨骼肌細胞核染色質濃聚致密化，形成形狀不一、大小不等的團塊邊集于核膜處；細胞質內線粒體腫脹，嵴排列紊亂、斷裂，線粒體旁可見大小不等的脂滴。以糖脂聯合輸注的 OB-FFA+Glu 組最為明顯，細胞質中呈大片脂滴，細胞器被擠壓變形，線粒體基質明顯腫脹、嵴斷裂，呈明顯空泡化。見圖 1。
圖1
各組大鼠骨骼肌細胞超微結構透射電子顯微鏡像
a. NC 組骨骼肌超微結構（×10 000）；b. OB 組大鼠骨骼肌超微結構 （×12 000）；c. OB-P 組大鼠超微結構：骨骼肌細胞線粒體有輕度腫脹，嵴結構排列紊亂，毛細血管內皮細胞無腫脹，基底膜尚完整（×8 000）；d. OB-Glu 組大鼠超微結構：骨骼肌細胞線粒體數量減少空泡化明顯（×20 000）；e. OB-FFA 組大鼠超微結構：細胞線粒體腫脹變形，嵴排列紊亂（×10 000）；f. OB-FFA+Glu 組大鼠超微結構：骨骼肌細胞脂滴含量增加，可見大量空泡形成（×10 000）
3 討論
高脂飼料喂養 4 周以上的肥胖大鼠是一種公認的胰島素抵抗動物模型[9]。本研究采用高脂高能量飼料喂養 12 周的肥胖大鼠為研究對象，通過 EHCT 評價外周組織胰島素敏感性，結果顯示高脂飼料成功誘導出肥胖大鼠模型。我們發現 OB 組大鼠循環中的TG和 FFA 水平明顯升高，體脂比值增加明顯，尤其是內臟脂肪含量遠高于 NC 組。既往研究顯示，內臟脂肪含量增加是胰島素抵抗的重要環節[10]。經過高脂高能量飼料喂養的 OB 組大鼠穩態期 GIR 值明顯降低，提示高脂飲食成功誘導胰島素抵抗。在采用 EHCT 金標準技術確定胰島素抵抗動物模型構建成功后，通過外源性升高肥胖大鼠血糖和（或）血 FFA 水平，研究糖脂毒性對肥胖大鼠酮體生成和骨骼肌超微結構的影響。
我們前期研究表明，外源性輸注脂肪乳和葡萄糖可升高循環中的 FFA 濃度和血糖水平[11]。葡萄糖和 FFA 是體內骨骼肌最主要的代謝底物，本研究采用脂肪乳和葡萄糖單獨輸注以及聯合輸注，通過持續外源性葡萄糖和（或）脂肪乳靜脈輸注模擬酮癥傾向糖尿病患者急性期的高血糖和高 FFA 血癥狀態，研究糖脂聯合毒性對肥胖大鼠酮體生成的影響。并以生理鹽水作為參照，評估外源性升高肥胖大鼠血糖和（或）血 FFA 水平對于肥胖大鼠酮體生成的影響，結果顯示脂肪乳的輸注可導致體內 β-HBA 水平不同程度增加，以糖脂聯合輸注組尤為明顯，遠甚于單獨的葡萄糖或脂肪乳輸注組，表明糖毒性和脂毒性的聯合作用使得機體代謝紊亂，酮體生成增加。
本研究顯示持續小劑量外源性輸注葡萄糖和脂肪乳不但使得循環中血糖和 FFA 水平升高導致酮癥傾向，還對外周組織尤其是胰島素敏感的靶組織——骨骼肌產生影響。本研究中電子顯微鏡下可觀察到肥胖組大鼠在葡萄糖和（或）脂肪乳負荷后骨骼肌細胞線粒體明顯腫脹，線粒體嵴斷裂，線粒體呈空泡樣改變。研究表明骨骼肌是葡萄糖代謝的重要場所，但是值得注意的是靜息狀態下骨骼肌主要的能量來源是循環中非酯化的 FFA，骨骼肌的胰島素敏感性降低是機體胰島素抵抗的重要組成部分[12]。Randle 葡萄糖脂肪酸循環學說提示，在骨骼肌的基礎代謝中葡萄糖和 FFA 的氧化是互相競爭的，循環中的高 FFA 使肌肉 FFA 氧化增加，使葡萄糖非氧化利用減少，同時 FFA 可以抑制胰島素 IRS/IP-3 信號通路，導致外周葡萄糖轉運和利用障礙，最終形成外周胰島素抵抗[10-15]。本研究中提示糖脂負荷過重使得骨骼肌細胞異位脂質沉積，導致線粒體結構受損，細胞的代謝效能下降，而產生糖和 FFA 的氧化障礙。由此可見，肥胖大鼠模型研究提示糖脂毒性帶來骨骼肌等胰島素靶器官或組織受損[16-17]。結合我們的糖脂毒性對胰島素分泌的影響的初步研究結果表明：肥胖糖尿病患者酮癥傾向的可能機制是在胰島素嚴重抵抗的背景下，脂聯合作用帶來的胰島素的絕對缺乏，導致酮體生成過多和外周組織對酮體的氧化利用障礙，最終導致酮體的堆積而產生酮癥傾向[18-19]。
綜上，骨骼肌是葡萄糖代謝的重要組織，骨骼肌胰島素敏感性降低是機體胰島素抵抗的主要原因，本研究在胰島素抵抗背景下通過外源性升高循環中葡萄糖和 FFA 水平，結果肥胖大鼠體內酮體等產物生成增加。高葡萄糖和高 FFA 作用下骨骼肌線粒體的受損提示線粒體是糖脂毒性可能的作用靶點，由于胰島素信號通路的復雜性，胰島素抵抗的具體病理生理機制有待進一步進行深入研究。
