引用本文： 龍海燕, 馮萍. 抗生素相關性腹瀉患者艱難梭菌和白色念珠菌檢測與臨床特征分析. 華西醫學, 2018, 33(5): 555-560. doi: 10.7507/1002-0179.201610067 復制
隨著人類科技進步，醫療技術快速發展，廣譜抗菌藥物廣泛使用以及糖皮質激素、化學治療（化療）藥物、侵入性操作、嚴重的慢性疾病等危險因素的影響，抗生素相關性腹瀉（antibiotic-associated diarrhea，AAD）在臨床中越來越受到重視。引起 AAD 的病原菌中 15%～25% 是艱難梭菌，其次為金黃色葡萄球菌、產腸毒素產氣莢膜梭菌、產酸克雷伯菌等，也有人提出念珠菌屬是 AAD 的病原體，但仍有爭論，而更大部分引起 ADD 的病原菌尚不明確[1-3]。因此 AAD 診斷及治療是臨床的一個難題，若處理不及時、不正確，患者病死率較高。艱難梭菌是厭氧革蘭陽性芽孢桿菌，是公認的 AAD 最重要的病原菌，可引起艱難梭菌相關性腹瀉。近年來艱難梭菌感染的發病率、嚴重程度、病死率呈上升趨勢[4-6]，甚至出現了暴發流行。亞洲雖然屬于低流行區，但是發病率也有上升趨勢[7-8]。白色念珠菌為感染最常見的念珠菌屬，正常情況下不致病，但當各種原因導致全身或局部免疫力下降時，機體可出現感染及相應臨床癥狀。本研究收集了 2014 年 9 月—2015 年 1 月四川大學華西醫院 AAD 患者大便標本，通過聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）法檢測并鑒定產毒艱難梭菌和白色念珠菌，收集患者相關資料并進行臨床特征分析，為 AAD 診治提供參考依據。現報告如下。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 標本來源
收集 2014 年 9 月—2015 年 1 月四川大學華西醫院 AAD 患者的大便標本。納入標準：① 1 個月內曾應用抗生素。② 腹瀉頻率>3 次/d，持續 2 d 以上，水樣便、血便、黏液膿血便或見斑塊條索狀偽膜，可合并下列情況：發熱（體溫≥38℃）；腹痛或腹部壓痛、反跳痛；周圍血白細胞計數升高。排除標準：① 未應用抗生素的腹瀉患者；② 診斷為急性胃腸炎、缺血性結腸炎、炎癥性腸病、類癌瘤、腸易激綜合征等有明確病因的腹瀉患者；③ 腹瀉前使用過瀉劑的患者；④ 已使用抗真菌藥、甲硝唑、萬古霉素、微生物制劑等治療的患者。
1.1.2 質控菌株
白色念珠菌 Candida albicans ATCC10231 購自美國標準培養物中心，為本實驗室提供和保藏。
1.1.3 試劑與儀器
糞便 DNA 提取試劑盒（美國 Omega 公司）；沙氏葡萄糖瓊脂（sabouraud dextrose agar，SDA）培養基（葡萄糖 20 g，蛋白胨 10 g，瓊脂 15 g，蒸餾水 1 000 mL，氯霉素 0.1 g。將瓊脂及其他成分加入蒸餾水中，攪拌溶解后調整 pH 值至 5.5～6.0，121℃ 高壓滅菌 15 min，冷卻后倒入無菌培養皿，置 4℃ 備用）；酵母基因組 DNA 提取試劑盒（北京天根生化科技有限公司）；溶壁酶（北京天根生化科技有限公司，RT410）；Premix TaqTM（TaKaRa 生物技術公司，RR902A）；DNA Maker［DL-2000（lk）］，100 bp DNA Ladder（TaKaRa 生物技術公司）；ATB Densimat 比濁儀（法國 BioMerix 公司）；ZSD-1160 全自動新型生化培養箱（上海智城分析儀器制造有限公司）；基因擴增儀、GELDOC1000 型凝膠成像系統、電泳儀（美國 Bio-Rad 公司）。
1.2 產毒艱難梭菌檢測
1.2.1 糞便 DNA 提取
使用美國 Omega 公司糞便 DNA 提取試劑盒對糞便標本的 DNA 進行提取。
1.2.2 PCR 法鑒定艱難梭菌
PCR 法檢測艱難梭菌種特異管家基因 tpi 和毒素基因 tcdA、tcdB[9]。相關引物見表 1：反應體系為 25 μL，12.5 μL Premix TaqTM RR902A，10.5 μL 超純水，0.5 μL 上游引物，0.5 μL 下游引物，1 μL 模板 DNA。Tpi 和 TcdB 反應條件：94℃ 預變性 5 min，94℃ 變性 50 s，54℃ 退火 40 s，72℃ 延伸 50 s，返回至第 2 步，共 35 個循環后，72℃ 最終延伸 3 min，最后 20℃ 1 min。TcdA 反應條件：95℃ 預變性 3 min，95℃ 變性 30 s，65℃ 退火 30 s，72℃ 延伸 30 s，返回至第 2 步，共 10 個循環后，95℃ 變性 30 s，55℃ 退火 30 s，72℃ 延伸 30 s，返回至第 6 步，共 30 個循環后，72℃ 延伸 30 s，72℃ 最終延伸 5 min，22℃ 保持 2 min。艱難梭菌相關 PCR 擴增產物采用 2% 瓊脂糖凝膠進行電泳，電壓 180 V，電泳時間 30 min。電泳結束后進行凝膠成像儀上紫外線投射下觀察結果并記錄。將 PCR 擴增產物送至北京華大生物工程技術服務有限公司進行測序。測序后得到的 DNA 序列進行基于網絡的 BLAST 比對鑒定（http://blast.ncbi. nlm.nih.gov/Blast）。
表1
產毒艱難梭菌特異管家基因 tpi 和毒力基因 tcdA、tcdB 引物序列
1.3 酵母菌檢測
1.3.1 酵母菌分純培養
采集的標本盡快接種至 SDA 上 37℃ 孵育 48 h。挑取光滑灰白奶酪樣菌落進行涂片、革蘭染色，置顯微鏡下觀察，篩選出革蘭染色陽性的卵圓形孢子者，并挑取相應菌落在 SDA 上進行分純 3 次獲得純化菌株，室溫保存于 SDA 培養基上。
1.3.2 PCR 法鑒定酵母菌
使用天根酵母菌基因組 DNA 提取試劑盒對純化的念珠菌基因組 DNA 進行提取，并于–20℃ 保存待用。使用真菌通用引物 ITS1 TCCGTAGGTGAACCTGCGG 和 ITS4 TCCTCCGCTATTGATATGC 進行 PCR，擴增 ITS 區。反應體系為 25 μL，12.5 μL Premix TaqTM RR902A，10.5 μL 超純水，0.5 μL ITS1，0.5 μL ITS4，1 μL 模板 DNA。94℃ 預變性 2 min，94℃ 變性 30 s，60℃ 退火 90 s，74℃ 延伸 1 min，74℃ 加長延伸 5 min，30 個循環數，保存于 4℃。擴增產物采用 2% 瓊脂糖凝膠進行電泳，電壓 180 V，電泳時間 30 min。電泳結束后進行凝膠成像儀上紫外線投射下觀察結果并記錄。將 PCR 擴增產物送至北京華大生物工程技術服務有限公司進行測序。測序后得到的 DNA 序列進行基于網絡的 BLAST 比對鑒定（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast）。
1.4 臨床資料收集和分析
通過醫院信息系統查看病歷和床旁詢問患者，收集患者年齡、性別、住院時間、臨床科室分布、抗生素使用史、基礎疾病、有創操作、免疫抑制劑使用情況、治療情況等臨床特征并進行分析。
2 結果
2.1 艱難梭菌檢出情況
納入 AAD 患者 126 例，檢出艱難梭菌 28 例，檢出率為 22.2%，毒力分型顯示 A+B+型 35.7%（10/28），A-B+型 35.7%（10/28），A-B-型 28.6%（8/28），見表 2。檢出產毒艱難梭菌（A+B+型、A-B+型） 20 例（15.9%），其中男 12 例，女 8 例；年齡 15～97 歲，平均（57.0±18.6）歲；重癥監護病房（intensive care unit，ICU）、傳染科、消化科各 4 例，感染科、呼吸科、血液科各 2 例，老年干部科和中西醫結合科各 1 例。
表2
AAD 患者中檢出的艱難梭菌及其毒素情況
2.2 酵母菌檢出情況
126 例 AAD 患者中檢出酵母菌者共 54 例（42.9%），其中白色念珠菌 26 例（20.6%），光滑念珠菌 11 例（8.7%），熱帶念珠菌 10 例（7.9%），近平滑念珠菌 3 例（2.4%），釀酒酵母 2 例（1.6%），畢赤酵母菌 1 例（0.8%），奧默柯達酵母菌 1 例（0.8%），見表 3。26 例白色念珠菌感染患者中，男 16 例，女 10 例；年齡 20～86 歲，平均（64.1±17.6）歲；中西醫結合科 7 例，血液科和呼吸科各 4 例，傳染科和 ICU 各 3 例，感染科和腎臟內科各 2 例，老年干部科 1 例。其中有 3 例患者同時檢測出了艱難梭菌和白色念珠菌，占所有 AAD 患者的 2.4%（3/126）。
表3
普通病房和 ICU 中 AAD 患者檢出酵母菌種類分布情況［例（%）］
2.3 產毒艱難梭菌感染和白色念珠菌感染臨床特征
2.3.1 相關危險因素
AAD 相關性產毒艱難梭菌感染和白色念珠菌感染患者常用抗菌藥物為青霉素類、碳青霉烯類、第 3 代頭孢菌素類、喹諾酮類，這 4 類抗菌藥物引起 AAD 的比例較高，導致產毒艱難梭菌和白色念珠菌感染的比例相似。AAD 相關性產毒艱難梭菌感染常見基礎疾病有慢性肝功能不全、慢性肺部疾病、腫瘤等，而 AAD 相關性白色念珠菌感染基礎疾病更多見于慢性肺部疾病、慢性心臟疾病等。腹腔穿刺、胃鏡檢查活檢、胃管留置、結腸鏡、腹部手術、呼吸機支持等有創操作兩種病原菌感染的患者中比例均高于 50%。慢性肝功能不全更易引起產毒艱難梭菌感染，慢性肺部疾病更易引起白色念珠菌感染，有創操作對兩種病原菌感染影響無明顯差異。見表 4。
表4
產毒艱難梭菌感染和白色念珠菌感染患者相關危險因素［例（%）］
2.3.2 產毒艱難梭菌感染治療及效果
20 例產毒艱難梭菌感染患者中，16 例使用了益生菌聯合蒙脫石散治療，其中 12 例好轉，3 例惡化自動出院，1 例死亡；2 例患者主治醫師經驗性使用了萬古霉素、益生菌和蒙脫石散治療，其中 1 例患者好轉出院，1 例惡化自動出院，后者有乙狀結腸穿孔、彌漫性腹膜炎等嚴重并發癥；1 例大便菌量輕度減少，只使用了止瀉劑即停止腹瀉；1 例菌群正常，未使用任何藥物即停止腹瀉。AAD 中產毒艱難梭菌感染總體好轉率為 75.0%，總體惡化及死亡率為 25.0%。見表 5。
表5
AAD 患者中產毒艱難梭菌感染治療及效果分析
2.3.3 白色念珠菌感染治療及預后
26 例白色念珠菌感染患者中，有 18 例使用益生菌聯合蒙脫石散治療，其中 14 例好轉出院，2 例惡化自動出院，2 例死亡。有 4 例使用益生菌、蒙脫石散、抗真菌藥物治療，其中 3 例因同時肺部真菌感染使用了全身抗真菌藥，分別是兩性霉素 B、氟康唑和米卡芬凈，1 例好轉，2 例死亡；有 1 例使用口服制霉菌素、蒙脫石散和益生菌好轉出院。有 4 例只使用了蒙脫石散（其中 1 例菌群正常，3 例菌量輕度減少），均好轉出院。AAD 中白色念珠菌感染者總體好轉率為 76.9%，總體惡化及死亡率為 23.1%。見表 6。
表6
AAD 中白色念珠菌感染治療及效果分析
3 討論
3.1 艱難梭菌在 AAD 中的重要性
本研究通過 PCR 法鑒定產毒艱難梭菌并同時總結患者臨床資料后發現，產毒艱難梭菌檢出率為 15.9%（20/126），感染者平均年齡（57.0±18.6）歲，以男性為主。而 Huang 等[9]對 2007 年—2008 年復旦大學附屬華山醫院的調查結果顯示艱難梭菌檢出率為 9.5%（56/587），感染者平均年齡（62.8±19.3）歲，男性為主；2012 年陳偉等[10]對湘雅醫院艱難梭菌感染調查發現其檢出率為 13.94%（63/452），感染者平均年齡（65.38±14.07）歲，以男性為主。我們的艱難梭菌檢出率略高于其他文獻報道，這可能是因為地區差異或檢測手段的不同導致。艱難梭菌感染者平均年齡在 60 歲左右，且男性較女性易感，應引起重視。
艱難梭菌致病性與其毒力有關，目前主要有 A、B 兩種毒素。艱難梭菌 A-B+型不僅可引起嚴重感染甚至死亡，甚至可引起暴發，且其臨床癥狀及結局與 A+B+型無明顯區別。本研究中我們檢測出的艱難梭菌中 A-B+型占 35.7%（10/28），國內關于艱難梭菌中 A-B+型占比的研究報道差異較大，為 16.8%～42.9%[8-10]。這些地區差異的原因需要進一步探討。
艱難梭菌相關性腹瀉的危險因素主要包括艱難梭菌暴露、廣譜抗菌藥物的使用、慢性肝病、器官移植、化療、長期使用激素、胃腸手術、侵入性操作等[11]。本研究中 60.0% 的產毒艱難梭菌相關性腹瀉的患者來自于 ICU、傳染科和消化科。ICU 患者多伴有嚴重的基礎疾病，使用廣譜抗菌藥物和大量侵入性操作；我院傳染科主要病種為失代償期肝硬化及重癥肝炎，常合并其他部位感染；消化科則涉及多種胃腸道的侵入性操作等。
大部分抗菌藥物與產毒艱難梭菌相關性腹瀉發生相關，特別是廣譜青霉素類、第 3 代頭孢菌素類、喹諾酮類、碳青霉烯類、克林霉素[12-14]。本研究中產毒艱難梭菌相關性腹瀉使用的抗菌藥物前 4 位分別是廣譜青霉素類、碳青霉烯類、第 3 代頭孢菌素類和喹諾酮類，這也和每個醫院用藥習慣有關，在檢出的 20 例產毒艱難梭菌感染患者中并未使用克林霉素者。
糾正腸道菌群失調是治療艱難梭菌相關性腹瀉的主要手段。2013 年一項隨機對照研究結果顯示，糞菌移植組的艱難梭菌感染患者經 10 周治療后，其治療成功率達 94%，且無復發，而萬古霉素單藥治療組和萬古霉素加腸道灌洗組的治療成功率僅分別為 31% 和 23%[15]。2013 年艱難梭菌的治療指南已經納入糞菌移植治療的方案[11]。本組資料 20 例產毒艱難梭菌相關性腹瀉患者中只有 2 例患者（10%）經驗性地使用了萬古霉素，17 例選擇益生菌或加止瀉劑治療，其中惡化或死亡率達 23.5%（4/17）。導致這種現象的原因可能是臨床工作者對艱難梭菌相關性腹瀉并沒有引起足夠的重視以及相應的診斷技術未常規開展，使得艱難梭菌相關性腹瀉診斷率很低，無法及時獲得病原學治療。
3.2 念珠菌在 AAD 中的重要性
本研究檢出酵母菌 54 例，白色念珠菌仍是主要菌群，檢出率為 20.6%（26/126），檢出者平均年齡（64.1±17.6）歲，以男性為主。而國內外其他研究有報道更高的檢出率，達 35.9%、39.3%[16-17]。
目前念珠菌感染的危險因素已經較為明確，包括糖尿病，廣譜抗菌藥物、糖皮質激素、化療藥物的使用，血液或實體腫瘤，消化道大手術，入住 ICU，各種侵入性操作等[18]。本研究中白色念珠菌感染主要分布在中西醫結合科、呼吸科和血液科。從科室分布看，正是廣譜抗菌藥物、化療藥物使用較多的科室，中西醫結合科因涉及多器官疾病，也經常使用廣譜抗菌藥物，且該科室常用中藥導瀉，在一定程度上也影響了腸道正常的防御屏障。本研究發現 ICU 病房和普通病房中念珠菌感染率仍很高，普通病房念珠菌感染以白色念珠菌為主，而 ICU 患者則以光滑念珠菌為主。本研究還檢出釀酒酵母菌 2 株、奧默柯達酵母 1 株和畢赤酵母菌 1 株。釀酒酵母菌常被用于制作面包和饅頭等食品及釀酒，也可在呼吸道、腸道和泌尿生殖道定植。國外有肝移植患者出現侵襲性釀酒酵母感染的報道[19]。而奧默柯達酵母菌感染致病的報道并不少見，Al-Sweih 等[20]報道了 1 例早產新生兒出現奧默柯達酵母菌敗血癥、使用兩性酶素 B 治愈的案例。而畢赤酵母菌常作為蛋白表達系統，用來做科學研究，其致病的報道較少。關于以上真菌致病的機制仍有待進一步探索。
總之，四川大學華西醫院 AAD 患者感染產毒艱難梭菌和白色念珠菌均比較嚴重。臨床發現不明原因腹瀉患者，特別是使用廣譜抗生素的老年患者，應加強對艱難梭菌及真菌檢測及腸道菌群監測，及時明確診斷，積極進行相關治療。
隨著人類科技進步，醫療技術快速發展，廣譜抗菌藥物廣泛使用以及糖皮質激素、化學治療（化療）藥物、侵入性操作、嚴重的慢性疾病等危險因素的影響，抗生素相關性腹瀉（antibiotic-associated diarrhea，AAD）在臨床中越來越受到重視。引起 AAD 的病原菌中 15%～25% 是艱難梭菌，其次為金黃色葡萄球菌、產腸毒素產氣莢膜梭菌、產酸克雷伯菌等，也有人提出念珠菌屬是 AAD 的病原體，但仍有爭論，而更大部分引起 ADD 的病原菌尚不明確[1-3]。因此 AAD 診斷及治療是臨床的一個難題，若處理不及時、不正確，患者病死率較高。艱難梭菌是厭氧革蘭陽性芽孢桿菌，是公認的 AAD 最重要的病原菌，可引起艱難梭菌相關性腹瀉。近年來艱難梭菌感染的發病率、嚴重程度、病死率呈上升趨勢[4-6]，甚至出現了暴發流行。亞洲雖然屬于低流行區，但是發病率也有上升趨勢[7-8]。白色念珠菌為感染最常見的念珠菌屬，正常情況下不致病，但當各種原因導致全身或局部免疫力下降時，機體可出現感染及相應臨床癥狀。本研究收集了 2014 年 9 月—2015 年 1 月四川大學華西醫院 AAD 患者大便標本，通過聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）法檢測并鑒定產毒艱難梭菌和白色念珠菌，收集患者相關資料并進行臨床特征分析，為 AAD 診治提供參考依據。現報告如下。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 標本來源
收集 2014 年 9 月—2015 年 1 月四川大學華西醫院 AAD 患者的大便標本。納入標準：① 1 個月內曾應用抗生素。② 腹瀉頻率>3 次/d，持續 2 d 以上，水樣便、血便、黏液膿血便或見斑塊條索狀偽膜，可合并下列情況：發熱（體溫≥38℃）；腹痛或腹部壓痛、反跳痛；周圍血白細胞計數升高。排除標準：① 未應用抗生素的腹瀉患者；② 診斷為急性胃腸炎、缺血性結腸炎、炎癥性腸病、類癌瘤、腸易激綜合征等有明確病因的腹瀉患者；③ 腹瀉前使用過瀉劑的患者；④ 已使用抗真菌藥、甲硝唑、萬古霉素、微生物制劑等治療的患者。
1.1.2 質控菌株
白色念珠菌 Candida albicans ATCC10231 購自美國標準培養物中心，為本實驗室提供和保藏。
1.1.3 試劑與儀器
糞便 DNA 提取試劑盒（美國 Omega 公司）；沙氏葡萄糖瓊脂（sabouraud dextrose agar，SDA）培養基（葡萄糖 20 g，蛋白胨 10 g，瓊脂 15 g，蒸餾水 1 000 mL，氯霉素 0.1 g。將瓊脂及其他成分加入蒸餾水中，攪拌溶解后調整 pH 值至 5.5～6.0，121℃ 高壓滅菌 15 min，冷卻后倒入無菌培養皿，置 4℃ 備用）；酵母基因組 DNA 提取試劑盒（北京天根生化科技有限公司）；溶壁酶（北京天根生化科技有限公司，RT410）；Premix TaqTM（TaKaRa 生物技術公司，RR902A）；DNA Maker［DL-2000（lk）］，100 bp DNA Ladder（TaKaRa 生物技術公司）；ATB Densimat 比濁儀（法國 BioMerix 公司）；ZSD-1160 全自動新型生化培養箱（上海智城分析儀器制造有限公司）；基因擴增儀、GELDOC1000 型凝膠成像系統、電泳儀（美國 Bio-Rad 公司）。
1.2 產毒艱難梭菌檢測
1.2.1 糞便 DNA 提取
使用美國 Omega 公司糞便 DNA 提取試劑盒對糞便標本的 DNA 進行提取。
1.2.2 PCR 法鑒定艱難梭菌
PCR 法檢測艱難梭菌種特異管家基因 tpi 和毒素基因 tcdA、tcdB[9]。相關引物見表 1：反應體系為 25 μL，12.5 μL Premix TaqTM RR902A，10.5 μL 超純水，0.5 μL 上游引物，0.5 μL 下游引物，1 μL 模板 DNA。Tpi 和 TcdB 反應條件：94℃ 預變性 5 min，94℃ 變性 50 s，54℃ 退火 40 s，72℃ 延伸 50 s，返回至第 2 步，共 35 個循環后，72℃ 最終延伸 3 min，最后 20℃ 1 min。TcdA 反應條件：95℃ 預變性 3 min，95℃ 變性 30 s，65℃ 退火 30 s，72℃ 延伸 30 s，返回至第 2 步，共 10 個循環后，95℃ 變性 30 s，55℃ 退火 30 s，72℃ 延伸 30 s，返回至第 6 步，共 30 個循環后，72℃ 延伸 30 s，72℃ 最終延伸 5 min，22℃ 保持 2 min。艱難梭菌相關 PCR 擴增產物采用 2% 瓊脂糖凝膠進行電泳，電壓 180 V，電泳時間 30 min。電泳結束后進行凝膠成像儀上紫外線投射下觀察結果并記錄。將 PCR 擴增產物送至北京華大生物工程技術服務有限公司進行測序。測序后得到的 DNA 序列進行基于網絡的 BLAST 比對鑒定（http://blast.ncbi. nlm.nih.gov/Blast）。
表1
產毒艱難梭菌特異管家基因 tpi 和毒力基因 tcdA、tcdB 引物序列
1.3 酵母菌檢測
1.3.1 酵母菌分純培養
采集的標本盡快接種至 SDA 上 37℃ 孵育 48 h。挑取光滑灰白奶酪樣菌落進行涂片、革蘭染色，置顯微鏡下觀察，篩選出革蘭染色陽性的卵圓形孢子者，并挑取相應菌落在 SDA 上進行分純 3 次獲得純化菌株，室溫保存于 SDA 培養基上。
1.3.2 PCR 法鑒定酵母菌
使用天根酵母菌基因組 DNA 提取試劑盒對純化的念珠菌基因組 DNA 進行提取，并于–20℃ 保存待用。使用真菌通用引物 ITS1 TCCGTAGGTGAACCTGCGG 和 ITS4 TCCTCCGCTATTGATATGC 進行 PCR，擴增 ITS 區。反應體系為 25 μL，12.5 μL Premix TaqTM RR902A，10.5 μL 超純水，0.5 μL ITS1，0.5 μL ITS4，1 μL 模板 DNA。94℃ 預變性 2 min，94℃ 變性 30 s，60℃ 退火 90 s，74℃ 延伸 1 min，74℃ 加長延伸 5 min，30 個循環數，保存于 4℃。擴增產物采用 2% 瓊脂糖凝膠進行電泳，電壓 180 V，電泳時間 30 min。電泳結束后進行凝膠成像儀上紫外線投射下觀察結果并記錄。將 PCR 擴增產物送至北京華大生物工程技術服務有限公司進行測序。測序后得到的 DNA 序列進行基于網絡的 BLAST 比對鑒定（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast）。
1.4 臨床資料收集和分析
通過醫院信息系統查看病歷和床旁詢問患者，收集患者年齡、性別、住院時間、臨床科室分布、抗生素使用史、基礎疾病、有創操作、免疫抑制劑使用情況、治療情況等臨床特征并進行分析。
2 結果
2.1 艱難梭菌檢出情況
納入 AAD 患者 126 例，檢出艱難梭菌 28 例，檢出率為 22.2%，毒力分型顯示 A+B+型 35.7%（10/28），A-B+型 35.7%（10/28），A-B-型 28.6%（8/28），見表 2。檢出產毒艱難梭菌（A+B+型、A-B+型） 20 例（15.9%），其中男 12 例，女 8 例；年齡 15～97 歲，平均（57.0±18.6）歲；重癥監護病房（intensive care unit，ICU）、傳染科、消化科各 4 例，感染科、呼吸科、血液科各 2 例，老年干部科和中西醫結合科各 1 例。
表2
AAD 患者中檢出的艱難梭菌及其毒素情況
2.2 酵母菌檢出情況
126 例 AAD 患者中檢出酵母菌者共 54 例（42.9%），其中白色念珠菌 26 例（20.6%），光滑念珠菌 11 例（8.7%），熱帶念珠菌 10 例（7.9%），近平滑念珠菌 3 例（2.4%），釀酒酵母 2 例（1.6%），畢赤酵母菌 1 例（0.8%），奧默柯達酵母菌 1 例（0.8%），見表 3。26 例白色念珠菌感染患者中，男 16 例，女 10 例；年齡 20～86 歲，平均（64.1±17.6）歲；中西醫結合科 7 例，血液科和呼吸科各 4 例，傳染科和 ICU 各 3 例，感染科和腎臟內科各 2 例，老年干部科 1 例。其中有 3 例患者同時檢測出了艱難梭菌和白色念珠菌，占所有 AAD 患者的 2.4%（3/126）。
表3
普通病房和 ICU 中 AAD 患者檢出酵母菌種類分布情況［例（%）］
2.3 產毒艱難梭菌感染和白色念珠菌感染臨床特征
2.3.1 相關危險因素
AAD 相關性產毒艱難梭菌感染和白色念珠菌感染患者常用抗菌藥物為青霉素類、碳青霉烯類、第 3 代頭孢菌素類、喹諾酮類，這 4 類抗菌藥物引起 AAD 的比例較高，導致產毒艱難梭菌和白色念珠菌感染的比例相似。AAD 相關性產毒艱難梭菌感染常見基礎疾病有慢性肝功能不全、慢性肺部疾病、腫瘤等，而 AAD 相關性白色念珠菌感染基礎疾病更多見于慢性肺部疾病、慢性心臟疾病等。腹腔穿刺、胃鏡檢查活檢、胃管留置、結腸鏡、腹部手術、呼吸機支持等有創操作兩種病原菌感染的患者中比例均高于 50%。慢性肝功能不全更易引起產毒艱難梭菌感染，慢性肺部疾病更易引起白色念珠菌感染，有創操作對兩種病原菌感染影響無明顯差異。見表 4。
表4
產毒艱難梭菌感染和白色念珠菌感染患者相關危險因素［例（%）］
2.3.2 產毒艱難梭菌感染治療及效果
20 例產毒艱難梭菌感染患者中，16 例使用了益生菌聯合蒙脫石散治療，其中 12 例好轉，3 例惡化自動出院，1 例死亡；2 例患者主治醫師經驗性使用了萬古霉素、益生菌和蒙脫石散治療，其中 1 例患者好轉出院，1 例惡化自動出院，后者有乙狀結腸穿孔、彌漫性腹膜炎等嚴重并發癥；1 例大便菌量輕度減少，只使用了止瀉劑即停止腹瀉；1 例菌群正常，未使用任何藥物即停止腹瀉。AAD 中產毒艱難梭菌感染總體好轉率為 75.0%，總體惡化及死亡率為 25.0%。見表 5。
表5
AAD 患者中產毒艱難梭菌感染治療及效果分析
2.3.3 白色念珠菌感染治療及預后
26 例白色念珠菌感染患者中，有 18 例使用益生菌聯合蒙脫石散治療，其中 14 例好轉出院，2 例惡化自動出院，2 例死亡。有 4 例使用益生菌、蒙脫石散、抗真菌藥物治療，其中 3 例因同時肺部真菌感染使用了全身抗真菌藥，分別是兩性霉素 B、氟康唑和米卡芬凈，1 例好轉，2 例死亡；有 1 例使用口服制霉菌素、蒙脫石散和益生菌好轉出院。有 4 例只使用了蒙脫石散（其中 1 例菌群正常，3 例菌量輕度減少），均好轉出院。AAD 中白色念珠菌感染者總體好轉率為 76.9%，總體惡化及死亡率為 23.1%。見表 6。
表6
AAD 中白色念珠菌感染治療及效果分析
3 討論
3.1 艱難梭菌在 AAD 中的重要性
本研究通過 PCR 法鑒定產毒艱難梭菌并同時總結患者臨床資料后發現，產毒艱難梭菌檢出率為 15.9%（20/126），感染者平均年齡（57.0±18.6）歲，以男性為主。而 Huang 等[9]對 2007 年—2008 年復旦大學附屬華山醫院的調查結果顯示艱難梭菌檢出率為 9.5%（56/587），感染者平均年齡（62.8±19.3）歲，男性為主；2012 年陳偉等[10]對湘雅醫院艱難梭菌感染調查發現其檢出率為 13.94%（63/452），感染者平均年齡（65.38±14.07）歲，以男性為主。我們的艱難梭菌檢出率略高于其他文獻報道，這可能是因為地區差異或檢測手段的不同導致。艱難梭菌感染者平均年齡在 60 歲左右，且男性較女性易感，應引起重視。
艱難梭菌致病性與其毒力有關，目前主要有 A、B 兩種毒素。艱難梭菌 A-B+型不僅可引起嚴重感染甚至死亡，甚至可引起暴發，且其臨床癥狀及結局與 A+B+型無明顯區別。本研究中我們檢測出的艱難梭菌中 A-B+型占 35.7%（10/28），國內關于艱難梭菌中 A-B+型占比的研究報道差異較大，為 16.8%～42.9%[8-10]。這些地區差異的原因需要進一步探討。
艱難梭菌相關性腹瀉的危險因素主要包括艱難梭菌暴露、廣譜抗菌藥物的使用、慢性肝病、器官移植、化療、長期使用激素、胃腸手術、侵入性操作等[11]。本研究中 60.0% 的產毒艱難梭菌相關性腹瀉的患者來自于 ICU、傳染科和消化科。ICU 患者多伴有嚴重的基礎疾病，使用廣譜抗菌藥物和大量侵入性操作；我院傳染科主要病種為失代償期肝硬化及重癥肝炎，常合并其他部位感染；消化科則涉及多種胃腸道的侵入性操作等。
大部分抗菌藥物與產毒艱難梭菌相關性腹瀉發生相關，特別是廣譜青霉素類、第 3 代頭孢菌素類、喹諾酮類、碳青霉烯類、克林霉素[12-14]。本研究中產毒艱難梭菌相關性腹瀉使用的抗菌藥物前 4 位分別是廣譜青霉素類、碳青霉烯類、第 3 代頭孢菌素類和喹諾酮類，這也和每個醫院用藥習慣有關，在檢出的 20 例產毒艱難梭菌感染患者中并未使用克林霉素者。
糾正腸道菌群失調是治療艱難梭菌相關性腹瀉的主要手段。2013 年一項隨機對照研究結果顯示，糞菌移植組的艱難梭菌感染患者經 10 周治療后，其治療成功率達 94%，且無復發，而萬古霉素單藥治療組和萬古霉素加腸道灌洗組的治療成功率僅分別為 31% 和 23%[15]。2013 年艱難梭菌的治療指南已經納入糞菌移植治療的方案[11]。本組資料 20 例產毒艱難梭菌相關性腹瀉患者中只有 2 例患者（10%）經驗性地使用了萬古霉素，17 例選擇益生菌或加止瀉劑治療，其中惡化或死亡率達 23.5%（4/17）。導致這種現象的原因可能是臨床工作者對艱難梭菌相關性腹瀉并沒有引起足夠的重視以及相應的診斷技術未常規開展，使得艱難梭菌相關性腹瀉診斷率很低，無法及時獲得病原學治療。
3.2 念珠菌在 AAD 中的重要性
本研究檢出酵母菌 54 例，白色念珠菌仍是主要菌群，檢出率為 20.6%（26/126），檢出者平均年齡（64.1±17.6）歲，以男性為主。而國內外其他研究有報道更高的檢出率，達 35.9%、39.3%[16-17]。
目前念珠菌感染的危險因素已經較為明確，包括糖尿病，廣譜抗菌藥物、糖皮質激素、化療藥物的使用，血液或實體腫瘤，消化道大手術，入住 ICU，各種侵入性操作等[18]。本研究中白色念珠菌感染主要分布在中西醫結合科、呼吸科和血液科。從科室分布看，正是廣譜抗菌藥物、化療藥物使用較多的科室，中西醫結合科因涉及多器官疾病，也經常使用廣譜抗菌藥物，且該科室常用中藥導瀉，在一定程度上也影響了腸道正常的防御屏障。本研究發現 ICU 病房和普通病房中念珠菌感染率仍很高，普通病房念珠菌感染以白色念珠菌為主，而 ICU 患者則以光滑念珠菌為主。本研究還檢出釀酒酵母菌 2 株、奧默柯達酵母 1 株和畢赤酵母菌 1 株。釀酒酵母菌常被用于制作面包和饅頭等食品及釀酒，也可在呼吸道、腸道和泌尿生殖道定植。國外有肝移植患者出現侵襲性釀酒酵母感染的報道[19]。而奧默柯達酵母菌感染致病的報道并不少見，Al-Sweih 等[20]報道了 1 例早產新生兒出現奧默柯達酵母菌敗血癥、使用兩性酶素 B 治愈的案例。而畢赤酵母菌常作為蛋白表達系統，用來做科學研究，其致病的報道較少。關于以上真菌致病的機制仍有待進一步探索。
總之，四川大學華西醫院 AAD 患者感染產毒艱難梭菌和白色念珠菌均比較嚴重。臨床發現不明原因腹瀉患者，特別是使用廣譜抗生素的老年患者，應加強對艱難梭菌及真菌檢測及腸道菌群監測，及時明確診斷，積極進行相關治療。
