引用本文： 鄧力琿, 張曉鑫, 陳煒煒, 石娜, 馬蕓, 姜坤, 楊曉楠, 夏慶. 血漿微 RNA-216 早期預警重癥急性胰腺炎的臨床價值. 華西醫學, 2018, 33(5): 550-554. doi: 10.7507/1002-0179.201605050 復制
急性胰腺炎（acute pancreatitis，AP）目前尚無公認有效的特異性治療[1-2]，一旦出現重癥急性胰腺炎（severe acute pancreatitis，SAP），預后差[3-5]。盡早識別 SAP 以盡早采取積極的多學科綜合干預是進一步降低病死率的關鍵。但從臨床特征及時準確判斷病情的輕重程度相當困難[6]，目前預測 AP 病情嚴重性的臨床評分系統[7-9]、影像學評分[10-11]、單個生化指標[12-15]因其有效性不足、時效性欠佳或操作繁瑣而未得到一致認可[4, 6]。開發簡便、準確、可靠的生物標志物對及時篩選危重患者有重要意義。
微 RNA（microRNA，miRNA）是一類內源性非編碼小 RNA[16]，參與了細胞的許多重要生物學過程[17]。miRNA 在細胞外體液中穩定表達[18-19]，血循環中異常表達的 miRNA 可能在疾病的臨床診斷中有重要作用[20-22]。miRNA-216（miR-216）的表達具有胰腺組織特異性[23-26]，尤其在腺泡細胞中相對特異表達[27-28]。研究認為，血液中 miR-216 表達可作為 AP 的潛在標志物[27, 29-31]，但 miR-216 在判斷胰腺損傷嚴重程度中的價值還不明確。本研究檢測 AP 患者病程早期血漿 miR-216 的表達，探討其早期預測 SAP 的價值。現報告如下。
1 資料與方法
1.1 研究對象
納入 2014 年 9 月—11 月四川大學華西醫院中西醫結合科收治的 AP 患者（臨床研究注冊號：ChiCTR-DOD-15005864）。
AP 的診斷標準為符合以下 3 項中的至少 2 項：① 急性、突發、持續、劇烈的上腹部疼痛、常向背部放射等 AP 特征性的腹痛；② 血清淀粉酶和（或）脂肪酶活性升高大于等于正常上限值的 3 倍；③ 腹部影像學提示 AP 特征性的改變。
納入標準為同時符合以下 4 條者：① 年齡 18～70 歲；② 符合 AP 的診斷標準；③ 出現腹痛等典型癥狀起 48 h 之內收入我科；④ 患者知情同意，自愿參與研究，并簽署知情同意書。
排除標準為符合以下任何 1 項者：① 妊娠或哺乳期婦女；② 有腫瘤病史的患者；③ 處于疾病晚期的患者；④ 既往發生過急性胰腺炎；⑤ 患者正在進行其他臨床試驗。
1.2 儀器與試劑
真空采血管購自美國 BD 公司。血漿 miRNA 提取試劑盒 mirVanaTM PARISTM Kit、血漿 miRNA 反轉錄試劑盒、實時定量聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）試劑盒 Taqman microRNA Assays（has-microRNA-216a）購自美國 Applied Biosystems 公司。PCR 儀為 ABI 7500 型定量 PCR 儀（美國 Applied Biosystems 公司）。
1.3 檢測方法
1.3.1 受試者血液標本采集和預處理
所有患者于入院 24 h 內使用乙二胺四乙酸抗凝采血管采集外周靜脈血 4 mL，釆血后 2 h 內處理分離血漿：血標本 24℃ 600×g 離心 30 min，轉移上層血漿至 15 mL 離心管，然后 24℃ 1 500×g 離心 10 min，轉移血漿至凍存管中，–80℃ 凍存以備抽提 RNA。
1.3.2 血漿 miRNA 檢測
取 400 μL 血漿標本，按照 mirVanaTM PARIS Kit 說明書提取血清樣品 RNA（含 miRNA）。采用 TaqMan microRNA Reverse Transcription Kit 進行反轉錄，反轉錄條件為：16℃ 30 min，42℃ 30 min，85℃ 5 min，4℃ 5 min。取反轉產物 2 μL 作為模板，用 TaqMan Universal Master Mix Ⅱ試劑盒進行實時熒光定量 PCR 檢測，所有反應采用三復孔，反應條件為 50℃，2 min，95℃ 10 min，然后 95℃ 15 s，60℃ 1 min，40 個循環。每個標本各進行 3 次實時熒光定量 PCR，取擴增循環數（Ct 值）的平均值。
1.4 臨床數據收集
收集患者的人口學特征、體質量指數（body mass index，BMI）、基礎疾病情況、入院 24 h 內實驗室資料、影像學資料、治療情況、出院時情況。實驗室資料包括：血常規、血生化、C 反應蛋白、降鈣素原、白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）等。根據臨床資料評估相關評分系統，包括：Ranson 評分系統、全身炎癥反應綜合征（systemic inflammatory response syndrome，SIRS）評分、急性生理與慢性健康評分Ⅱ（Acute Physiology and Chronic Health Evaluation Ⅱ，APACHE-Ⅱ）評分系統、Glasgow 評分、AP 嚴重程度床旁指數（Bedside Index for Severity in Acute Pancreatitis，BISAP）評分系統和修正的 Marshall 評分（Modified Marshall Score，MMS）等。
1.5 統計學方法
連續型定量資料使用均數±標準差（正態分布）或中位數（最小值，最大值）（非正態分布）表示；定性資料使用百分比表示。正態分布的多組定量資料采用單因素方差分析，方差齊時多組間兩兩比較采用 LSD 法，方差不齊時多組間兩兩比較采用 Tamhane’s T2 法；非正態分布的定量資料采用獨立樣本 Kruskal-Wallis 秩和檢驗，并用 Kruskal-Wallis 單因素 ANOVA（k 樣本）進行兩兩比較；定性資料比較采用 Fisher 確切概率法。參照文獻[32]，Ct 值用 SDS 2.1 實時定量軟件進行分析。用 Medcalc 15.8 軟件 DeLong et al.法對受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線的曲線下面積（area under curve，AUC）進行對比統計分析。其余數據統計分析均使用 SPSS 22.0 軟件。檢驗水準雙側 α=0.05。
2 結果
2.1 臨床資料
據納入和排除標準，最后共納入患者 25 例，其中輕癥急性胰腺炎（mild acute pancreatitis，MAP）7 例，中度重癥急性胰腺炎（moderately severe acute pancreatitis，MSAP）10 例，SAP 8 例。MAP、MSAP 和 SAP 患者的年齡、性別構成比、BMI 等基本資料差異無統計學意義（P>0.05）。SAP 患者與 MAP 相比，血尿素氮、肌酐、IL-6、SIRS 評分、MMS 評分、BISAP 評分、APACHE-Ⅱ評分、Glasgow 評分差異有統計學意義（P<0.05）；SAP 患者與 MSAP 相比，血尿素氮、肌酐、IL-6、MMS 評分、BISAP 評分、APACHE-Ⅱ評分差異有統計學意義（P<0.05）；MSAP 與 MAP 相比，MMS 評分和 BISAP 評分差異有統計學意義（P<0.05）。MAP、MSAP 和 SAP 3 組患者在胰腺壞死率、感染率和重癥監護病房（intensive care unit，ICU）入住率方面的差異有統計學意義（P<0.05）。見表 1。
表1
不同程度 AP 患者入院 24 h 內的臨床特征
2.2 miR-216 檢測結果
所有 AP 患者血漿標本中均檢測到 miR-216，3 組間 miR-216 表達差異有統計學意義（F=5.823，P=0.009），SAP 患者血漿 miR-216 表達顯著高于 MAP（P=0.011）和 MSAP 組（P=0.005）；MAP 和 MSAP 患者相比，miR-216 的表達差異無統計學意義（P=0.946）。3 組間內參 miR-16 差異無統計學意義（P>0.05）。見圖 1、表 2。
表2
AP 患者血漿 miR-216 與內參 miR-16 的 Ct 值（
）
圖1
各組患者血漿 miR-216 表達水平
*與 MAP 組比較，
2.3 血漿 miR-216 診斷 SAP 的價值
血漿 miR-216 診斷 SAP 的 AUC 為 0.792（P<0.05），高于 APACHE-Ⅱ評分和 BISAP 評分的 AUC，小于 IL-6、血尿素氮、肌酐、MMS 評分、Glasgow 評分的 AUC，miR-216 與這些指標的 AUC 效能差異無統計學意義（P>0.05）。見表 3。
表3
miR-216 與生化指標及評分系統預測 SAP 的 ROC 曲線分析
3 討論
在 AP 患者發病早期（尤其在發病后的 24 h 內）預判 SAP 仍是臨床工作的難點和挑戰。有文獻報道患者血清和血漿的 miRNA 可以用于預測 AP 嚴重程度[33-37]，但 miR-216 在判斷胰腺損傷及其嚴重程度中的價值還不明確。本研究依據 2012 年亞特蘭大 AP 分級分類標準[3]納入 MAP、MSAP 和 SAP 患者，以探索血漿 miR-216 評估 SAP 的臨床價值。
動物實驗在嚙齒類動物血循環中檢測到了 miR-216，由于 miR-216 基因序列在人與嚙齒類動物之間的保守性[31]，因此理論上我們可以研究人血循環中的 miR-216。本研究的預實驗在健康志愿者中未檢測到 miR-216 表達，但是 3 組 AP 患者血漿中均檢測到 miR-216，其表達水平在 MAP 與 MSAP 組間差異無統計學意義，SAP 患者血漿 miR-216 表達顯著高于 MAP 和 MSAP，結果與 Blenkiron 等[32]的研究結果一致。
本研究探討了血漿 miR-216 診斷 SAP 的效能，分析顯示，血漿 miR-216 的 AUC 為 0.792，有統計學意義（P<0.05），提示miR-216 與 SAP 有密切的相關性。進一步將血漿 miR-216 診斷 SAP 的效能與臨床常用指標和評分系統的預測效能進行比較，發現 miR-216 與這些指標比較預測 SAP 的效能差異無統計學意義（P>0.05），但是miR-216 的 AUC 高于 APACHE-Ⅱ評分和 BISAP 評分的 AUC，值得進一步研究。目前預測 AP 病情嚴重性的臨床評分系統（APACHE-Ⅱ評分、BISAP 評分和 Glasgow 評分）和單個生化指標（血細胞比容、血尿素氮、鈣離子、C 反應蛋白、降鈣素原、IL-6 等），這些指標有一定的運用價值，但并不絕對準確。本研究納入 25 例 AP 患者的臨床資料結果顯示，僅有 MMS 評分在 3 組的兩兩比較中差異均有統計學意義，SAP 患者的血尿素氮、肌酐、APACHE-Ⅱ評分分別高于與 MAP、MSAP 患者，然而上述指標在 MAP 與 MSAP 患者之間差異均無統計學意義。究其原因，可能樣本量較小不能反映各組指標之間的差異，同時 2012 年修訂版亞特蘭大 AP 分類分級標準提出后也少有研究對這些指標進行重新驗證[38]。
綜上所述，本次小樣本臨床研究顯示，血漿 miR-216 預測 SAP 的效能不優于目前臨床上常用的評價指標體系，其價值需大樣本的臨床試驗進一步研究。
急性胰腺炎（acute pancreatitis，AP）目前尚無公認有效的特異性治療[1-2]，一旦出現重癥急性胰腺炎（severe acute pancreatitis，SAP），預后差[3-5]。盡早識別 SAP 以盡早采取積極的多學科綜合干預是進一步降低病死率的關鍵。但從臨床特征及時準確判斷病情的輕重程度相當困難[6]，目前預測 AP 病情嚴重性的臨床評分系統[7-9]、影像學評分[10-11]、單個生化指標[12-15]因其有效性不足、時效性欠佳或操作繁瑣而未得到一致認可[4, 6]。開發簡便、準確、可靠的生物標志物對及時篩選危重患者有重要意義。
微 RNA（microRNA，miRNA）是一類內源性非編碼小 RNA[16]，參與了細胞的許多重要生物學過程[17]。miRNA 在細胞外體液中穩定表達[18-19]，血循環中異常表達的 miRNA 可能在疾病的臨床診斷中有重要作用[20-22]。miRNA-216（miR-216）的表達具有胰腺組織特異性[23-26]，尤其在腺泡細胞中相對特異表達[27-28]。研究認為，血液中 miR-216 表達可作為 AP 的潛在標志物[27, 29-31]，但 miR-216 在判斷胰腺損傷嚴重程度中的價值還不明確。本研究檢測 AP 患者病程早期血漿 miR-216 的表達，探討其早期預測 SAP 的價值。現報告如下。
1 資料與方法
1.1 研究對象
納入 2014 年 9 月—11 月四川大學華西醫院中西醫結合科收治的 AP 患者（臨床研究注冊號：ChiCTR-DOD-15005864）。
AP 的診斷標準為符合以下 3 項中的至少 2 項：① 急性、突發、持續、劇烈的上腹部疼痛、常向背部放射等 AP 特征性的腹痛；② 血清淀粉酶和（或）脂肪酶活性升高大于等于正常上限值的 3 倍；③ 腹部影像學提示 AP 特征性的改變。
納入標準為同時符合以下 4 條者：① 年齡 18～70 歲；② 符合 AP 的診斷標準；③ 出現腹痛等典型癥狀起 48 h 之內收入我科；④ 患者知情同意，自愿參與研究，并簽署知情同意書。
排除標準為符合以下任何 1 項者：① 妊娠或哺乳期婦女；② 有腫瘤病史的患者；③ 處于疾病晚期的患者；④ 既往發生過急性胰腺炎；⑤ 患者正在進行其他臨床試驗。
1.2 儀器與試劑
真空采血管購自美國 BD 公司。血漿 miRNA 提取試劑盒 mirVanaTM PARISTM Kit、血漿 miRNA 反轉錄試劑盒、實時定量聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）試劑盒 Taqman microRNA Assays（has-microRNA-216a）購自美國 Applied Biosystems 公司。PCR 儀為 ABI 7500 型定量 PCR 儀（美國 Applied Biosystems 公司）。
1.3 檢測方法
1.3.1 受試者血液標本采集和預處理
所有患者于入院 24 h 內使用乙二胺四乙酸抗凝采血管采集外周靜脈血 4 mL，釆血后 2 h 內處理分離血漿：血標本 24℃ 600×g 離心 30 min，轉移上層血漿至 15 mL 離心管，然后 24℃ 1 500×g 離心 10 min，轉移血漿至凍存管中，–80℃ 凍存以備抽提 RNA。
1.3.2 血漿 miRNA 檢測
取 400 μL 血漿標本，按照 mirVanaTM PARIS Kit 說明書提取血清樣品 RNA（含 miRNA）。采用 TaqMan microRNA Reverse Transcription Kit 進行反轉錄，反轉錄條件為：16℃ 30 min，42℃ 30 min，85℃ 5 min，4℃ 5 min。取反轉產物 2 μL 作為模板，用 TaqMan Universal Master Mix Ⅱ試劑盒進行實時熒光定量 PCR 檢測，所有反應采用三復孔，反應條件為 50℃，2 min，95℃ 10 min，然后 95℃ 15 s，60℃ 1 min，40 個循環。每個標本各進行 3 次實時熒光定量 PCR，取擴增循環數（Ct 值）的平均值。
1.4 臨床數據收集
收集患者的人口學特征、體質量指數（body mass index，BMI）、基礎疾病情況、入院 24 h 內實驗室資料、影像學資料、治療情況、出院時情況。實驗室資料包括：血常規、血生化、C 反應蛋白、降鈣素原、白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）等。根據臨床資料評估相關評分系統，包括：Ranson 評分系統、全身炎癥反應綜合征（systemic inflammatory response syndrome，SIRS）評分、急性生理與慢性健康評分Ⅱ（Acute Physiology and Chronic Health Evaluation Ⅱ，APACHE-Ⅱ）評分系統、Glasgow 評分、AP 嚴重程度床旁指數（Bedside Index for Severity in Acute Pancreatitis，BISAP）評分系統和修正的 Marshall 評分（Modified Marshall Score，MMS）等。
1.5 統計學方法
連續型定量資料使用均數±標準差（正態分布）或中位數（最小值，最大值）（非正態分布）表示；定性資料使用百分比表示。正態分布的多組定量資料采用單因素方差分析，方差齊時多組間兩兩比較采用 LSD 法，方差不齊時多組間兩兩比較采用 Tamhane’s T2 法；非正態分布的定量資料采用獨立樣本 Kruskal-Wallis 秩和檢驗，并用 Kruskal-Wallis 單因素 ANOVA（k 樣本）進行兩兩比較；定性資料比較采用 Fisher 確切概率法。參照文獻[32]，Ct 值用 SDS 2.1 實時定量軟件進行分析。用 Medcalc 15.8 軟件 DeLong et al.法對受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線的曲線下面積（area under curve，AUC）進行對比統計分析。其余數據統計分析均使用 SPSS 22.0 軟件。檢驗水準雙側 α=0.05。
2 結果
2.1 臨床資料
據納入和排除標準，最后共納入患者 25 例，其中輕癥急性胰腺炎（mild acute pancreatitis，MAP）7 例，中度重癥急性胰腺炎（moderately severe acute pancreatitis，MSAP）10 例，SAP 8 例。MAP、MSAP 和 SAP 患者的年齡、性別構成比、BMI 等基本資料差異無統計學意義（P>0.05）。SAP 患者與 MAP 相比，血尿素氮、肌酐、IL-6、SIRS 評分、MMS 評分、BISAP 評分、APACHE-Ⅱ評分、Glasgow 評分差異有統計學意義（P<0.05）；SAP 患者與 MSAP 相比，血尿素氮、肌酐、IL-6、MMS 評分、BISAP 評分、APACHE-Ⅱ評分差異有統計學意義（P<0.05）；MSAP 與 MAP 相比，MMS 評分和 BISAP 評分差異有統計學意義（P<0.05）。MAP、MSAP 和 SAP 3 組患者在胰腺壞死率、感染率和重癥監護病房（intensive care unit，ICU）入住率方面的差異有統計學意義（P<0.05）。見表 1。
表1
不同程度 AP 患者入院 24 h 內的臨床特征
2.2 miR-216 檢測結果
所有 AP 患者血漿標本中均檢測到 miR-216，3 組間 miR-216 表達差異有統計學意義（F=5.823，P=0.009），SAP 患者血漿 miR-216 表達顯著高于 MAP（P=0.011）和 MSAP 組（P=0.005）；MAP 和 MSAP 患者相比，miR-216 的表達差異無統計學意義（P=0.946）。3 組間內參 miR-16 差異無統計學意義（P>0.05）。見圖 1、表 2。
表2
AP 患者血漿 miR-216 與內參 miR-16 的 Ct 值（
）
圖1
各組患者血漿 miR-216 表達水平
*與 MAP 組比較，
2.3 血漿 miR-216 診斷 SAP 的價值
血漿 miR-216 診斷 SAP 的 AUC 為 0.792（P<0.05），高于 APACHE-Ⅱ評分和 BISAP 評分的 AUC，小于 IL-6、血尿素氮、肌酐、MMS 評分、Glasgow 評分的 AUC，miR-216 與這些指標的 AUC 效能差異無統計學意義（P>0.05）。見表 3。
表3
miR-216 與生化指標及評分系統預測 SAP 的 ROC 曲線分析
3 討論
在 AP 患者發病早期（尤其在發病后的 24 h 內）預判 SAP 仍是臨床工作的難點和挑戰。有文獻報道患者血清和血漿的 miRNA 可以用于預測 AP 嚴重程度[33-37]，但 miR-216 在判斷胰腺損傷及其嚴重程度中的價值還不明確。本研究依據 2012 年亞特蘭大 AP 分級分類標準[3]納入 MAP、MSAP 和 SAP 患者，以探索血漿 miR-216 評估 SAP 的臨床價值。
動物實驗在嚙齒類動物血循環中檢測到了 miR-216，由于 miR-216 基因序列在人與嚙齒類動物之間的保守性[31]，因此理論上我們可以研究人血循環中的 miR-216。本研究的預實驗在健康志愿者中未檢測到 miR-216 表達，但是 3 組 AP 患者血漿中均檢測到 miR-216，其表達水平在 MAP 與 MSAP 組間差異無統計學意義，SAP 患者血漿 miR-216 表達顯著高于 MAP 和 MSAP，結果與 Blenkiron 等[32]的研究結果一致。
本研究探討了血漿 miR-216 診斷 SAP 的效能，分析顯示，血漿 miR-216 的 AUC 為 0.792，有統計學意義（P<0.05），提示miR-216 與 SAP 有密切的相關性。進一步將血漿 miR-216 診斷 SAP 的效能與臨床常用指標和評分系統的預測效能進行比較，發現 miR-216 與這些指標比較預測 SAP 的效能差異無統計學意義（P>0.05），但是miR-216 的 AUC 高于 APACHE-Ⅱ評分和 BISAP 評分的 AUC，值得進一步研究。目前預測 AP 病情嚴重性的臨床評分系統（APACHE-Ⅱ評分、BISAP 評分和 Glasgow 評分）和單個生化指標（血細胞比容、血尿素氮、鈣離子、C 反應蛋白、降鈣素原、IL-6 等），這些指標有一定的運用價值，但并不絕對準確。本研究納入 25 例 AP 患者的臨床資料結果顯示，僅有 MMS 評分在 3 組的兩兩比較中差異均有統計學意義，SAP 患者的血尿素氮、肌酐、APACHE-Ⅱ評分分別高于與 MAP、MSAP 患者，然而上述指標在 MAP 與 MSAP 患者之間差異均無統計學意義。究其原因，可能樣本量較小不能反映各組指標之間的差異，同時 2012 年修訂版亞特蘭大 AP 分類分級標準提出后也少有研究對這些指標進行重新驗證[38]。
綜上所述，本次小樣本臨床研究顯示，血漿 miR-216 預測 SAP 的效能不優于目前臨床上常用的評價指標體系，其價值需大樣本的臨床試驗進一步研究。
