引用本文： 馬靜, 宋毅, 費小凡. 鼻竅通顆粒中黃芪、黃芩的薄層鑒別研究. 華西醫學, 2017, 32(9): 1409-1413. doi: 10.7507/1002-0179.201608028 復制
鼻竅通顆粒是四川大學華西醫院驗方基礎上自制的中藥口服制劑，主要由黃芪、黃芩、蒼耳子和魚腥草等 19 味中藥組成，具有祛風除濕、通竅止痛的功效，用于鼻竇炎所引起的頭昏痛、流膿涕等不適癥狀，臨床上治療效果突出，副作用小。根據復方中藥制劑相關指導辦法，質量標準的指標成分建立一般首選君藥[1]。而本方原質量標準中僅有梔子和赤芍的薄層鑒別，質量可控性較差。黃芪為本方中的君藥，具有益氣固表、托毒排膿生肌的功效，主治體虛自汗、久瀉、脫肛、子宮脫垂、慢性腎炎、體虛浮腫、慢性潰瘍、瘡口久不愈合等癥[2]；黃芩為方中佐使藥，具有清熱燥濕、瀉火解毒、止血、安胎等功效，主治溫熱病、上呼吸道感染、肺熱咳嗽、濕熱黃膽、肺炎、癰腫癤瘡等癥[3]。為提高醫院制劑的原質量標準，本研究在原標準基礎上增加了黃芪和黃芩的薄層鑒別方法，并進行了系統方法學研究，以便更好地控制鼻竅通顆粒成品的質量，為保證其臨床用藥安全有效提供參考依據。黃芪中含有多種有效活性成分，其中黃芪甲苷等皂苷類成分具有抗炎鎮痛、抗血栓形成、抗衰老、增強免疫等藥理作用[4]；黃芩中含有黃酮類、多糖和萜類化合物等成分，黃芩素是其有效成分之一，具有多種藥理作用，目前臨床主要用于抗炎和抗菌的作用[5]。因此，本研究選擇黃芩素與黃芪甲苷作為鑒別黃芩與黃芪的指標成分。現報告如下。
1 材料與方法
1.1 儀器、試劑與藥材
1.1.1 儀器 AS3120 型超聲波處理器（天津奧特賽恩斯儀器有限公司）；HWS24 型電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科技儀器有限公司）；ZF-90 型多功能暗箱式紫外透射儀（上海寶山顧村電光儀器廠）；XP205DR 十萬分之一電子分析天平（瑞士梅特勒-托利多集團）；IRD-7080 型鼓風干燥箱（上海智誠分析儀器制造有限公司）；LP2102 電子天平（常熟市鴻泰儀器儀表技術有限公司）；D101 大孔吸附樹脂（成都市科龍化工試劑廠）。
實驗用薄層板：① 取薄層層析硅膠 G（青島海浪硅膠干燥劑有限公司）適量，按 1∶3 的比例加入含 0.3% 羧甲基纖維素鈉的水溶液混勻，用自動薄層制板器制成 10 cm×20 cm、厚度為 0.4 mm 硅膠G 板，晾干后，于 105℃ 烘 1 h，置干燥器內存放。② 聚酰胺薄膜（江蘇長豐化工有限公司）。
1.1.2 試劑與藥材 乙酸乙酯（天津市富起化工有限公司）；甲醇（成都天華化工科技有限公司）；正丁醇、乙醇（廣東光華科技股份有限公司）；鹽酸、硫酸、三氯甲烷、甲酸、甲苯、氨水（天津市科密歐化學試劑有限公司）；碳酸鈉、三氯化鐵、無水硫酸鈉、中性氧化鋁、氫氧化鈉（成都市科龍化工試劑廠）。
黃芪對照藥材（購于中國藥品生物制品檢定所，批號：120974-200508）；黃芩對照藥材（購于中國藥品生物制品檢定所，批號：120955-200406）；黃芪甲苷對照品（購于中國藥品生物制品檢定所，批號：110781-200613）；黃芩素對照品（購于中國藥品生物制品檢定所，批號：11595-200402）；鼻竅通顆粒批號：151012、151124、151205。
1.2 黃芪的鑒別
1.2.1 溶液的制備 ① 供試品溶液的制備：取鼻竅通顆粒 20 g，加水 40 mL 溶解，用水飽和正丁醇振搖提取 2 次，15 mL/次，合并正丁醇液，用 5% 碳酸鈉溶液洗滌 2 次，15 mL/次，棄去水液，正丁醇液蒸干，加水 20 mL 溶解，加至 D101 大孔吸附樹脂（柱高 10 cm，內徑 1.2 cm），依次用 2 倍柱體積的水、40% 乙醇洗脫，棄去洗脫液，再以 3 倍柱體積的 70% 乙醇洗脫，收集洗脫液，洗脫液濃縮至約 2 mL，作為供試品溶液。② 對照藥材溶液的制備：取黃芪對照藥材 2 g，同法制成對照藥材溶液。③ 對照品溶液的制備：另取黃芪甲苷對照品適量，加甲醇制成每 1 mL 含 1 mg 黃芪甲苷的溶液，作為對照品溶液。
1.2.2 展開系統選擇 吸取“1.2.1”項下的 3 種溶液，點于同一硅膠 G 薄層板上，分別以條件 1 [乙酸乙酯-甲醇-甲酸-水（10∶1∶1∶1）][6]、條件 2 [氯仿-甲醇（10∶1）][7]、條件 3 [氯仿-甲醇-水（13∶7∶2）][8]的下層溶液為展開劑；將上述薄層板取出，晾干，噴以 10% 硫酸乙醇溶液，在 105℃ 加熱至斑點顯色清晰。
1.2.3 不同檢視條件的考察 吸取“1.2.1”項下的 3 種溶液，在“1.2.2”項下選出的最佳展開系統下展開，取出，晾干，分別在不同紫外燈波長下（254、302、365 nm），或噴 10% 硫酸乙醇溶液加熱至斑點顯色后，日光下檢視。
1.2.4 點樣量的選擇 吸取“1.2.1”項下的 3 種溶液，各 2、5、10、20 μL，點于同一硅膠 G 薄層板上，以“1.2.2”項下選出的最佳展開系統和“1.2.3”項下選出的最佳檢視條件同法檢視。
1.2.5 專屬性的考察 陰性對照品溶液的制備：取除黃芪外的其他處方量藥材制成陰性對照品溶液。吸取陰性對照品溶液 10 μL 和“1.2.1”項下的 3 種溶液，按照“1.2.2–1.2.4”項下選出的最佳條件同法檢視。
1.2.6 不同溫度、濕度的考察 本實驗配置不同濃度的硫酸水溶液置展開缸的一側，密閉 15 min 后，控制其相對濕度；并將裝有薄層板的層析缸分別放置在 4～10℃ 冰箱中，20℃ 室溫空調房中，35℃ 恒溫干燥箱中進行不同溫度的考察。取“1.2.1”項下的 3 種溶液，按照“1.2.2—1.2.4”項下選出的最佳條件進行點樣，分別在下列條件展開：① 溫度 10℃、濕度 45%；② 溫度 10℃、濕度 65%；③ 溫度 20℃、濕度 45%；④ 溫度 20℃、濕度 65%；⑤ 溫度 20℃、濕度 85%；⑥ 溫度 35℃、濕度 65%；⑦ 溫度 35℃、濕度 85%。分別以“1.2.3”項下選出的最佳檢視條件同法檢視。
1.2.7 不同薄層板的考察 吸取“1.2.1”項下的3 種溶液，取不同的薄層板：青島海浪硅膠干燥劑有限公司生產的硅膠 G 薄層板、自制的硅膠 G 薄層板，分別按“1.2.2—1.2.4”項下選出的最佳方法檢視。
1.3 黃芩的鑒別
1.3.1 溶液的制備 ① 供試品溶液的制備：取鼻竅通顆粒 20 g，加乙酸乙酯∶甲醇（3∶1）的混合溶液 100 mL，加熱回流 30 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇 2 mL 溶解，作為黃芩的供試品溶液。② 對照藥材溶液的制備：取黃芩對照藥材 1 g，同法制成對照藥材溶液。③ 對照品溶液的制備：取黃芩素對照品適量，加甲醇制成每 1 mL 含 1 mg 黃芪素的溶液，作為對照品溶液。
1.3.2 展開系統選擇 條件 1：分別吸取“1.3.1”項下 3 種溶液點于同一聚酰胺薄膜上，用甲苯-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（10∶3∶1∶2）[9]、冰乙酸[10]為展開劑，取出晾干后直接置紫外燈（365 nm）下檢視；條件 2：分別吸取“1.3.1”項下 3 種溶液點于同一硅膠 G 薄層板上，用乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水（5∶3∶1∶1）[11]的上層溶液為展開劑，取出晾干后噴以 2% 三氯化鐵溶液為展開劑；條件 3：分別吸取“1.3.1”項下 3 種溶液點于同一硅膠 G 薄層板上，用甲苯-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（9∶3∶2∶2）為展開劑，取出晾干，在日光下放置 30 min 后直接觀察。
1.3.3 不同檢視條件的考察 吸取“1.3.1”項下的 3 種溶液，在“1.3.2”項下選出的最佳展開系統下展開，取出，晾干，分別在不同紫外燈波長（254 nm 和 365 nm）下；或噴以 2% 三氯化鐵乙醇溶液，在日光下檢視；或日光下放置 30 min 后直接觀察。
1.3.4 點樣量的選擇 吸取“1.3.1”項下的 3 種溶液，各 2、5、10 和 20 μL，點于同一硅膠 G 薄層板上，以“1.3.2”項下選出的最佳展開系統和“1.3.3”項下選出的最佳檢視條件同法檢視。
1.3.5 專屬性的考察 陰性對照品溶液的制備：取除黃芩外的其他處方量藥材制成陰性對照品溶液。吸取陰性對照品溶液 10 μL 和“1.3.1”項下的 3 種溶液，按照“1.3.2—1.3.4”項下選出的最佳條件同法檢視。
1.3.6 不同溫度、濕度的考察 本實驗配置不同濃度的硫酸水溶液置展開缸的一側，密閉 15 min 后，控制其相對濕度；并將裝有薄層板的層析缸分別放置在 4～10℃ 冰箱中，20℃ 室溫空調房中，35℃ 恒溫干燥箱中進行不同溫度的考察。取“1.3.1”項下的 3 種溶液，按照“1.3.2—1.3.4”項下選出的最佳條件進行點樣，分別在下列條件展開：① 溫度 10℃、濕度 45%；② 溫度 10℃、濕度 65%；③ 溫度 20℃、濕度 45%；④ 溫度 20℃、濕度 65%；⑤ 溫度 20℃、濕度 85%；⑥ 溫度 35℃、濕度 65%；⑦ 溫度 35℃、濕度 85%。分別以“1.3.4”項下選出的最佳檢視條件同法檢視。
1.3.7 不同薄層板的考察 取“1.3.1”項下的 3 種溶液，取不同的薄層板：青島海浪硅膠干燥劑有限公司生產的硅膠 G 薄層板；自制的硅膠 G 薄層板，分別按“1.3.2—1.3.4”項下選出的最佳方法檢視。
2 結果
2.1 黃芪薄層條件考察結果
2.1.1 展開系統考察結果 在條件 1、2 的展開系統下，雜質干擾較多，斑點拖尾嚴重，陰性有干擾；在條件 3 的展開系統下，斑點分離度好，陰性無干擾，比移（retention factor, Rf） 值適中。綜合上述因素，最終確定以三氯甲烷-甲醇-水（13∶7∶2）的下層溶液為本品的最佳展開系統。
2.1.2 點樣量的選擇結果 根據斑點的清晰度和分離度確定本品最佳點樣量為供試品溶液 20 μL 和對照品溶液 5 μL。
2.1.3 不同檢視條件的考察結果 本品噴 10% 硫酸乙醇溶液，在 105℃ 加熱至斑點顯色清晰，故確定以此為最佳檢視條件。
2.1.4 專屬性的考察結果 陰性對照品色譜中，在與對照品色譜和對照藥材色譜相應的位置上無斑點，該方法的專屬性好。
2.1.5 不同溫度、濕度的考察結果 在上述不同溫度、濕度條件下，供試品色譜在與對照品色譜的相應位置上，均有相同顏色的斑點，且分離度良好，Rf 值有稍許變化，說明溫度在 10～35℃ 范圍內，濕度在 45%～85% 范圍內，對本品的薄層鑒別影響小，重復性和穩定性好。
2.1.6 不同薄層板的考察結果 在不同薄層板條件下，特征主斑點的分離度達到要求，斑點清晰。
2.1.7 黃芪薄層條件最終結果 ① 展開系統：以三氯甲烷-甲醇-水（13∶7∶2）的下層溶液為展開劑，取出，晾干。② 點樣條件：吸取供試品溶液和對照藥材溶液各 20 μL，對照品溶液 5 μL，分別點于同一硅膠 G 薄層板上。③ 檢視條件：噴以 10% 硫酸乙醇溶液，在 105℃ 加熱至斑點顯色清晰。見圖 1。
圖1
黃芪的薄層色譜鑒別圖
1～3：供試品；4：黃芪甲苷對照品；5：黃芪陰性對照品；6：黃芪對照藥材
2.2 黃芩薄層條件考察結果
2.2.1 展開系統考察結果 在展開系統條件 1 下，供試品在與對照品和對照藥材相應位置，暗色斑點不明顯，且拖尾嚴重；在條件 2、3 下，通過觀察主斑點的 Rf 值、分離度、拖尾情況，確定以甲苯-乙酸乙酯-甲酸-甲醇（9∶3∶2∶2）為本品的最佳展開系統。
2.2.2 點樣量的選擇結果 根據斑點的清晰度和分離度確定本品最佳點樣量為供試品溶液 20 μL，對照品和對照藥材溶液各 5 μL。
2.2.3 不同檢視條件的考察結果 本品特征斑點在日光下放置 30 min 后直接觀察時，斑點最明顯，故確定以此為最佳檢視條件。
2.2.4 專屬性的考察結果 陰性對照品色譜中，在與對照品色譜和對照藥材色譜相應的位置上無斑點，該方法的專屬性好。
2.2.5 不同溫度、濕度的考察結果 在上述不同溫度、濕度條件下，供試品色譜在與對照品和對照藥材色譜的相應位置上，均有相同顏色的斑點，且分離度良好，Rf 值有稍許變化，說明溫度在 10～35℃ 范圍內，濕度在 45%～85% 范圍內，對本品的薄層鑒別影響小，重復性和穩定性好。
2.2.6 不同薄層板的考察結果 在不同薄層板條件下，特征主斑點的分離度達到要求，斑點清晰。
2.2.7 黃芩薄層條件最終結果 ① 展開系統：以甲苯-乙酸乙酯-甲酸-甲醇（9∶3∶2∶2）為展開劑，取出，晾干。② 點樣條件：吸取供試品溶液 20 μL，對照品溶液和對照藥材溶液各 5 μL，分別點于同一硅膠 G 薄層板上。③ 檢視條件：日光下放置 30 min 后直接觀察，供試品在與對照品和對照藥材相應位置有相同顏色的斑點。見圖 2。
圖2
黃芩的薄層色譜鑒別圖
1～3：供試品；4：黃芩素對照品；5：黃芩對照藥材；6：黃芩陰性對照品
3 討論
本實驗對本品中黃芪和黃芩藥材進行鑒別時，還探索了其他條件：參照中國藥典 2015 年版一部黃芪[12]項下方法，將鼻竅通顆粒用乙醇加熱回流提取，濾液蒸干加 0.3% 氫氧化鈉溶解，用稀鹽酸調節 pH 值至 5～6，采用乙酸乙酯萃取 2 次，蒸干后殘渣加甲醇 2 mL溶 解，作為供試品溶液；以氯仿∶甲醇（3∶1）為展開劑，但在此條件下雜質干擾較多，斑點拖尾嚴重，陰性有干擾，故未采用該方法制備黃芪的供試品溶液。另外參照文獻[13]將鼻竅通顆粒的甲醇提取液蒸干后通過中性氧化鋁進行純化，先用 40% 甲醇 150 mL 洗脫，洗脫液蒸干后，用水飽和正丁醇萃取，把萃取液作為供試品溶液，以氯仿-甲醇-甲酸（9∶0.5∶0.5）為展開劑，但是該供試品在與對照藥材相應位置斑點雜質干擾較大，分離度不好，故也未采用該方法制備黃芪的供試品溶液。參照文獻[14]方法對黃芩制樣，先用乙醚除脂溶性成分，水液加酸調 pH 值后用乙酸乙酯萃取，萃取液作為供試品液，但在該條件下黃芩拖尾嚴重，陰性有干擾，故未采用該方法制備黃芩的供試品溶液。上述條件的影響是由于鼻竅通顆粒由 19 味中藥組成，成分復雜，提取液中溶出成分多，待測成分與其他雜質成分均被提取出來，導致薄層鑒別干擾嚴重，分離效果差，故在選擇提取制備工藝時，需要根據待測成分的性質進行選擇。
在進行黃芪和黃芩的耐用性試驗考察時，溫度和濕度的變化對 Rf 值會有影響，但在此條件變化的情況下，其特征主斑點分離度和清晰度良好；另外，本次實驗還采用了市售薄層板和自制薄層版分別進行考察，黃芪和黃芩的主斑點在這 2 種薄層板上的分離度和重現性均能達到相關要求，說明本次實驗方案有效、可行。
我們還嘗試過鑒別該處方中其他幾味藥材，但由于方中部分藥材含有揮發性成分，還有部分藥材的鑒別成分遇熱不穩定，在顆粒制備的煎煮工藝中，揮發性成分損失，有效成分被破壞，在薄層色譜中難以鑒別出其特征斑點，故鑒別意義不大[15-17]；還有部分藥材通過薄層鑒別篩選后，也存在專屬性不強、斑點不明顯的現象，故未納入標準正文中。
綜上所述，醫療機構制劑遵循安全、實用、規范和質量可控的原則，建立有代表性的、簡便快速、專屬性和靈敏度高的方法，才能有效地控制醫療機構制劑的質量，保證臨床療效。本研究對鼻竅通顆粒中黃芪和黃芩進行了薄層鑒別方法學驗證考察，結果顯示圖譜中的特征斑點清晰，分離度好，陰性對照無干擾，操作簡便，表明該方法的重現性好、專屬性高，可作為鼻竅通顆粒質量控制的檢測指標。
鼻竅通顆粒是四川大學華西醫院驗方基礎上自制的中藥口服制劑，主要由黃芪、黃芩、蒼耳子和魚腥草等 19 味中藥組成，具有祛風除濕、通竅止痛的功效，用于鼻竇炎所引起的頭昏痛、流膿涕等不適癥狀，臨床上治療效果突出，副作用小。根據復方中藥制劑相關指導辦法，質量標準的指標成分建立一般首選君藥[1]。而本方原質量標準中僅有梔子和赤芍的薄層鑒別，質量可控性較差。黃芪為本方中的君藥，具有益氣固表、托毒排膿生肌的功效，主治體虛自汗、久瀉、脫肛、子宮脫垂、慢性腎炎、體虛浮腫、慢性潰瘍、瘡口久不愈合等癥[2]；黃芩為方中佐使藥，具有清熱燥濕、瀉火解毒、止血、安胎等功效，主治溫熱病、上呼吸道感染、肺熱咳嗽、濕熱黃膽、肺炎、癰腫癤瘡等癥[3]。為提高醫院制劑的原質量標準，本研究在原標準基礎上增加了黃芪和黃芩的薄層鑒別方法，并進行了系統方法學研究，以便更好地控制鼻竅通顆粒成品的質量，為保證其臨床用藥安全有效提供參考依據。黃芪中含有多種有效活性成分，其中黃芪甲苷等皂苷類成分具有抗炎鎮痛、抗血栓形成、抗衰老、增強免疫等藥理作用[4]；黃芩中含有黃酮類、多糖和萜類化合物等成分，黃芩素是其有效成分之一，具有多種藥理作用，目前臨床主要用于抗炎和抗菌的作用[5]。因此，本研究選擇黃芩素與黃芪甲苷作為鑒別黃芩與黃芪的指標成分。現報告如下。
1 材料與方法
1.1 儀器、試劑與藥材
1.1.1 儀器 AS3120 型超聲波處理器（天津奧特賽恩斯儀器有限公司）；HWS24 型電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科技儀器有限公司）；ZF-90 型多功能暗箱式紫外透射儀（上海寶山顧村電光儀器廠）；XP205DR 十萬分之一電子分析天平（瑞士梅特勒-托利多集團）；IRD-7080 型鼓風干燥箱（上海智誠分析儀器制造有限公司）；LP2102 電子天平（常熟市鴻泰儀器儀表技術有限公司）；D101 大孔吸附樹脂（成都市科龍化工試劑廠）。
實驗用薄層板：① 取薄層層析硅膠 G（青島海浪硅膠干燥劑有限公司）適量，按 1∶3 的比例加入含 0.3% 羧甲基纖維素鈉的水溶液混勻，用自動薄層制板器制成 10 cm×20 cm、厚度為 0.4 mm 硅膠G 板，晾干后，于 105℃ 烘 1 h，置干燥器內存放。② 聚酰胺薄膜（江蘇長豐化工有限公司）。
1.1.2 試劑與藥材 乙酸乙酯（天津市富起化工有限公司）；甲醇（成都天華化工科技有限公司）；正丁醇、乙醇（廣東光華科技股份有限公司）；鹽酸、硫酸、三氯甲烷、甲酸、甲苯、氨水（天津市科密歐化學試劑有限公司）；碳酸鈉、三氯化鐵、無水硫酸鈉、中性氧化鋁、氫氧化鈉（成都市科龍化工試劑廠）。
黃芪對照藥材（購于中國藥品生物制品檢定所，批號：120974-200508）；黃芩對照藥材（購于中國藥品生物制品檢定所，批號：120955-200406）；黃芪甲苷對照品（購于中國藥品生物制品檢定所，批號：110781-200613）；黃芩素對照品（購于中國藥品生物制品檢定所，批號：11595-200402）；鼻竅通顆粒批號：151012、151124、151205。
1.2 黃芪的鑒別
1.2.1 溶液的制備 ① 供試品溶液的制備：取鼻竅通顆粒 20 g，加水 40 mL 溶解，用水飽和正丁醇振搖提取 2 次，15 mL/次，合并正丁醇液，用 5% 碳酸鈉溶液洗滌 2 次，15 mL/次，棄去水液，正丁醇液蒸干，加水 20 mL 溶解，加至 D101 大孔吸附樹脂（柱高 10 cm，內徑 1.2 cm），依次用 2 倍柱體積的水、40% 乙醇洗脫，棄去洗脫液，再以 3 倍柱體積的 70% 乙醇洗脫，收集洗脫液，洗脫液濃縮至約 2 mL，作為供試品溶液。② 對照藥材溶液的制備：取黃芪對照藥材 2 g，同法制成對照藥材溶液。③ 對照品溶液的制備：另取黃芪甲苷對照品適量，加甲醇制成每 1 mL 含 1 mg 黃芪甲苷的溶液，作為對照品溶液。
1.2.2 展開系統選擇 吸取“1.2.1”項下的 3 種溶液，點于同一硅膠 G 薄層板上，分別以條件 1 [乙酸乙酯-甲醇-甲酸-水（10∶1∶1∶1）][6]、條件 2 [氯仿-甲醇（10∶1）][7]、條件 3 [氯仿-甲醇-水（13∶7∶2）][8]的下層溶液為展開劑；將上述薄層板取出，晾干，噴以 10% 硫酸乙醇溶液，在 105℃ 加熱至斑點顯色清晰。
1.2.3 不同檢視條件的考察 吸取“1.2.1”項下的 3 種溶液，在“1.2.2”項下選出的最佳展開系統下展開，取出，晾干，分別在不同紫外燈波長下（254、302、365 nm），或噴 10% 硫酸乙醇溶液加熱至斑點顯色后，日光下檢視。
1.2.4 點樣量的選擇 吸取“1.2.1”項下的 3 種溶液，各 2、5、10、20 μL，點于同一硅膠 G 薄層板上，以“1.2.2”項下選出的最佳展開系統和“1.2.3”項下選出的最佳檢視條件同法檢視。
1.2.5 專屬性的考察 陰性對照品溶液的制備：取除黃芪外的其他處方量藥材制成陰性對照品溶液。吸取陰性對照品溶液 10 μL 和“1.2.1”項下的 3 種溶液，按照“1.2.2–1.2.4”項下選出的最佳條件同法檢視。
1.2.6 不同溫度、濕度的考察 本實驗配置不同濃度的硫酸水溶液置展開缸的一側，密閉 15 min 后，控制其相對濕度；并將裝有薄層板的層析缸分別放置在 4～10℃ 冰箱中，20℃ 室溫空調房中，35℃ 恒溫干燥箱中進行不同溫度的考察。取“1.2.1”項下的 3 種溶液，按照“1.2.2—1.2.4”項下選出的最佳條件進行點樣，分別在下列條件展開：① 溫度 10℃、濕度 45%；② 溫度 10℃、濕度 65%；③ 溫度 20℃、濕度 45%；④ 溫度 20℃、濕度 65%；⑤ 溫度 20℃、濕度 85%；⑥ 溫度 35℃、濕度 65%；⑦ 溫度 35℃、濕度 85%。分別以“1.2.3”項下選出的最佳檢視條件同法檢視。
1.2.7 不同薄層板的考察 吸取“1.2.1”項下的3 種溶液，取不同的薄層板：青島海浪硅膠干燥劑有限公司生產的硅膠 G 薄層板、自制的硅膠 G 薄層板，分別按“1.2.2—1.2.4”項下選出的最佳方法檢視。
1.3 黃芩的鑒別
1.3.1 溶液的制備 ① 供試品溶液的制備：取鼻竅通顆粒 20 g，加乙酸乙酯∶甲醇（3∶1）的混合溶液 100 mL，加熱回流 30 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇 2 mL 溶解，作為黃芩的供試品溶液。② 對照藥材溶液的制備：取黃芩對照藥材 1 g，同法制成對照藥材溶液。③ 對照品溶液的制備：取黃芩素對照品適量，加甲醇制成每 1 mL 含 1 mg 黃芪素的溶液，作為對照品溶液。
1.3.2 展開系統選擇 條件 1：分別吸取“1.3.1”項下 3 種溶液點于同一聚酰胺薄膜上，用甲苯-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（10∶3∶1∶2）[9]、冰乙酸[10]為展開劑，取出晾干后直接置紫外燈（365 nm）下檢視；條件 2：分別吸取“1.3.1”項下 3 種溶液點于同一硅膠 G 薄層板上，用乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水（5∶3∶1∶1）[11]的上層溶液為展開劑，取出晾干后噴以 2% 三氯化鐵溶液為展開劑；條件 3：分別吸取“1.3.1”項下 3 種溶液點于同一硅膠 G 薄層板上，用甲苯-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（9∶3∶2∶2）為展開劑，取出晾干，在日光下放置 30 min 后直接觀察。
1.3.3 不同檢視條件的考察 吸取“1.3.1”項下的 3 種溶液，在“1.3.2”項下選出的最佳展開系統下展開，取出，晾干，分別在不同紫外燈波長（254 nm 和 365 nm）下；或噴以 2% 三氯化鐵乙醇溶液，在日光下檢視；或日光下放置 30 min 后直接觀察。
1.3.4 點樣量的選擇 吸取“1.3.1”項下的 3 種溶液，各 2、5、10 和 20 μL，點于同一硅膠 G 薄層板上，以“1.3.2”項下選出的最佳展開系統和“1.3.3”項下選出的最佳檢視條件同法檢視。
1.3.5 專屬性的考察 陰性對照品溶液的制備：取除黃芩外的其他處方量藥材制成陰性對照品溶液。吸取陰性對照品溶液 10 μL 和“1.3.1”項下的 3 種溶液，按照“1.3.2—1.3.4”項下選出的最佳條件同法檢視。
1.3.6 不同溫度、濕度的考察 本實驗配置不同濃度的硫酸水溶液置展開缸的一側，密閉 15 min 后，控制其相對濕度；并將裝有薄層板的層析缸分別放置在 4～10℃ 冰箱中，20℃ 室溫空調房中，35℃ 恒溫干燥箱中進行不同溫度的考察。取“1.3.1”項下的 3 種溶液，按照“1.3.2—1.3.4”項下選出的最佳條件進行點樣，分別在下列條件展開：① 溫度 10℃、濕度 45%；② 溫度 10℃、濕度 65%；③ 溫度 20℃、濕度 45%；④ 溫度 20℃、濕度 65%；⑤ 溫度 20℃、濕度 85%；⑥ 溫度 35℃、濕度 65%；⑦ 溫度 35℃、濕度 85%。分別以“1.3.4”項下選出的最佳檢視條件同法檢視。
1.3.7 不同薄層板的考察 取“1.3.1”項下的 3 種溶液，取不同的薄層板：青島海浪硅膠干燥劑有限公司生產的硅膠 G 薄層板；自制的硅膠 G 薄層板，分別按“1.3.2—1.3.4”項下選出的最佳方法檢視。
2 結果
2.1 黃芪薄層條件考察結果
2.1.1 展開系統考察結果 在條件 1、2 的展開系統下，雜質干擾較多，斑點拖尾嚴重，陰性有干擾；在條件 3 的展開系統下，斑點分離度好，陰性無干擾，比移（retention factor, Rf） 值適中。綜合上述因素，最終確定以三氯甲烷-甲醇-水（13∶7∶2）的下層溶液為本品的最佳展開系統。
2.1.2 點樣量的選擇結果 根據斑點的清晰度和分離度確定本品最佳點樣量為供試品溶液 20 μL 和對照品溶液 5 μL。
2.1.3 不同檢視條件的考察結果 本品噴 10% 硫酸乙醇溶液，在 105℃ 加熱至斑點顯色清晰，故確定以此為最佳檢視條件。
2.1.4 專屬性的考察結果 陰性對照品色譜中，在與對照品色譜和對照藥材色譜相應的位置上無斑點，該方法的專屬性好。
2.1.5 不同溫度、濕度的考察結果 在上述不同溫度、濕度條件下，供試品色譜在與對照品色譜的相應位置上，均有相同顏色的斑點，且分離度良好，Rf 值有稍許變化，說明溫度在 10～35℃ 范圍內，濕度在 45%～85% 范圍內，對本品的薄層鑒別影響小，重復性和穩定性好。
2.1.6 不同薄層板的考察結果 在不同薄層板條件下，特征主斑點的分離度達到要求，斑點清晰。
2.1.7 黃芪薄層條件最終結果 ① 展開系統：以三氯甲烷-甲醇-水（13∶7∶2）的下層溶液為展開劑，取出，晾干。② 點樣條件：吸取供試品溶液和對照藥材溶液各 20 μL，對照品溶液 5 μL，分別點于同一硅膠 G 薄層板上。③ 檢視條件：噴以 10% 硫酸乙醇溶液，在 105℃ 加熱至斑點顯色清晰。見圖 1。
圖1
黃芪的薄層色譜鑒別圖
1～3：供試品；4：黃芪甲苷對照品；5：黃芪陰性對照品；6：黃芪對照藥材
2.2 黃芩薄層條件考察結果
2.2.1 展開系統考察結果 在展開系統條件 1 下，供試品在與對照品和對照藥材相應位置，暗色斑點不明顯，且拖尾嚴重；在條件 2、3 下，通過觀察主斑點的 Rf 值、分離度、拖尾情況，確定以甲苯-乙酸乙酯-甲酸-甲醇（9∶3∶2∶2）為本品的最佳展開系統。
2.2.2 點樣量的選擇結果 根據斑點的清晰度和分離度確定本品最佳點樣量為供試品溶液 20 μL，對照品和對照藥材溶液各 5 μL。
2.2.3 不同檢視條件的考察結果 本品特征斑點在日光下放置 30 min 后直接觀察時，斑點最明顯，故確定以此為最佳檢視條件。
2.2.4 專屬性的考察結果 陰性對照品色譜中，在與對照品色譜和對照藥材色譜相應的位置上無斑點，該方法的專屬性好。
2.2.5 不同溫度、濕度的考察結果 在上述不同溫度、濕度條件下，供試品色譜在與對照品和對照藥材色譜的相應位置上，均有相同顏色的斑點，且分離度良好，Rf 值有稍許變化，說明溫度在 10～35℃ 范圍內，濕度在 45%～85% 范圍內，對本品的薄層鑒別影響小，重復性和穩定性好。
2.2.6 不同薄層板的考察結果 在不同薄層板條件下，特征主斑點的分離度達到要求，斑點清晰。
2.2.7 黃芩薄層條件最終結果 ① 展開系統：以甲苯-乙酸乙酯-甲酸-甲醇（9∶3∶2∶2）為展開劑，取出，晾干。② 點樣條件：吸取供試品溶液 20 μL，對照品溶液和對照藥材溶液各 5 μL，分別點于同一硅膠 G 薄層板上。③ 檢視條件：日光下放置 30 min 后直接觀察，供試品在與對照品和對照藥材相應位置有相同顏色的斑點。見圖 2。
圖2
黃芩的薄層色譜鑒別圖
1～3：供試品；4：黃芩素對照品；5：黃芩對照藥材；6：黃芩陰性對照品
3 討論
本實驗對本品中黃芪和黃芩藥材進行鑒別時，還探索了其他條件：參照中國藥典 2015 年版一部黃芪[12]項下方法，將鼻竅通顆粒用乙醇加熱回流提取，濾液蒸干加 0.3% 氫氧化鈉溶解，用稀鹽酸調節 pH 值至 5～6，采用乙酸乙酯萃取 2 次，蒸干后殘渣加甲醇 2 mL溶 解，作為供試品溶液；以氯仿∶甲醇（3∶1）為展開劑，但在此條件下雜質干擾較多，斑點拖尾嚴重，陰性有干擾，故未采用該方法制備黃芪的供試品溶液。另外參照文獻[13]將鼻竅通顆粒的甲醇提取液蒸干后通過中性氧化鋁進行純化，先用 40% 甲醇 150 mL 洗脫，洗脫液蒸干后，用水飽和正丁醇萃取，把萃取液作為供試品溶液，以氯仿-甲醇-甲酸（9∶0.5∶0.5）為展開劑，但是該供試品在與對照藥材相應位置斑點雜質干擾較大，分離度不好，故也未采用該方法制備黃芪的供試品溶液。參照文獻[14]方法對黃芩制樣，先用乙醚除脂溶性成分，水液加酸調 pH 值后用乙酸乙酯萃取，萃取液作為供試品液，但在該條件下黃芩拖尾嚴重，陰性有干擾，故未采用該方法制備黃芩的供試品溶液。上述條件的影響是由于鼻竅通顆粒由 19 味中藥組成，成分復雜，提取液中溶出成分多，待測成分與其他雜質成分均被提取出來，導致薄層鑒別干擾嚴重，分離效果差，故在選擇提取制備工藝時，需要根據待測成分的性質進行選擇。
在進行黃芪和黃芩的耐用性試驗考察時，溫度和濕度的變化對 Rf 值會有影響，但在此條件變化的情況下，其特征主斑點分離度和清晰度良好；另外，本次實驗還采用了市售薄層板和自制薄層版分別進行考察，黃芪和黃芩的主斑點在這 2 種薄層板上的分離度和重現性均能達到相關要求，說明本次實驗方案有效、可行。
我們還嘗試過鑒別該處方中其他幾味藥材，但由于方中部分藥材含有揮發性成分，還有部分藥材的鑒別成分遇熱不穩定，在顆粒制備的煎煮工藝中，揮發性成分損失，有效成分被破壞，在薄層色譜中難以鑒別出其特征斑點，故鑒別意義不大[15-17]；還有部分藥材通過薄層鑒別篩選后，也存在專屬性不強、斑點不明顯的現象，故未納入標準正文中。
綜上所述，醫療機構制劑遵循安全、實用、規范和質量可控的原則，建立有代表性的、簡便快速、專屬性和靈敏度高的方法，才能有效地控制醫療機構制劑的質量，保證臨床療效。本研究對鼻竅通顆粒中黃芪和黃芩進行了薄層鑒別方法學驗證考察，結果顯示圖譜中的特征斑點清晰，分離度好，陰性對照無干擾，操作簡便，表明該方法的重現性好、專屬性高，可作為鼻竅通顆粒質量控制的檢測指標。
