引用本文： 倪銀蕓, 丁雨, 吳思思. 四種轉染試劑對 H9C2 細胞轉染效率的比較. 華西醫學, 2017, 32(7): 1024-1028. doi: 10.7507/1002-0179.201606200 復制
外源基因轉入真核細胞即通常所說的細胞轉染技術，是研究基因表達調控及基因治療的有效技術之一，目前可通過磷酸鈣沉淀法、脂質體介導法、電穿孔法、顯微注射法及病毒轉染等實現[1-5]，其中脂質體介導法具有安全、操作簡便、對細胞毒性低、低免疫原性等特點，被廣泛應用于細胞轉染中[6]。但脂質體轉染也存在對細胞類型具有選擇性，轉染效率隨細胞類型不同而差別較大的缺點[7]，因此對于不同細胞需選擇最適的脂質體進行轉染，以獲得較高的轉染效率。
大鼠心肌細胞系 H9C2，有著骨骼肌的很多特性[8]，是用于研究多種心血管藥效的重要細胞系[9]。H9C2 也被用于研究與心臟衰竭有關基因的功能，如基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）-2 和 MMP-9[10]。此外，還能以 H9C2 作為模型來研究多柔比星誘導的心肌細胞凋亡和細胞毒性[11]。隨著細胞轉染技術的廣泛應用，找到高效、無毒的轉染 H9C2 細胞方法將為心血管疾病治療提供更多思路。
本研究分別用 FuGene HD、Lipofectamine 2000、Lipofectamin 3000 和 DNA-In CRISPR 4 種轉染試劑轉染帶有增強綠色熒光蛋白（enhanced green fluorescent protein，EGFP）基因的質粒至 H9C2 細胞，以探究較適合 H9C2 細胞轉染的方法。現報告如下。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 細胞系和質粒 H9C2 細胞、HEK293 細胞、EGFP-LC3 質粒均由本實驗室保存。
1.1.2 主要試劑 Dulbecco 改良 Eagle 高糖培養基購自美國 Hyclone 公司；胎牛血清購自美國 Gibco 公司；FuGENE HD 轉染試劑購自美國 Roche 公司；Lipofectamine 2000 轉染試劑、Lipofectamine 3000 轉染試劑購自美國 Invitrogen 公司；DNA-In CRISPR 轉染試劑購自英國 Amsbio 公司；質粒提取試劑盒購自美國 Omega 公司；Cell Counting Kit-8（CCK-8）細胞增殖試劑盒購自日本同仁化學公司。
1.1.3 主要儀器 倒置熒光顯微鏡（OBSERVER D1/AX10 cam HRC，德國卡爾·蔡司公司），多功能熒光酶標儀（Synergy Mx，美國伯騰儀器有限公司）。
1.2 方法
1.2.1 質粒制備 將質粒 EGFP-LC3 轉化大腸桿菌感受態 DH5a，挑出陽性克隆，在含有氨芐抗性的 LB 培養基中擴大培養，用質粒提取試劑盒提取純化后測定濃度和純度，具體操作步驟根據產品說明書進行。
1.2.2 細胞轉染 將 H9C2 細胞和 HEK293 細胞分別按 1×104個/孔接種于 96 孔板，待細胞生長至約 70% 匯合度時轉染 EGFP-LC3 質粒，每孔轉染 0.1 μg 質粒。Lipofectamine 3000 和 Lipofectamine 2000 轉染試劑分別以轉染試劑∶質粒=1.5 μL∶1 μg 和 3 μL∶1 μg 的比例配制質粒-脂質體復合物；FuGENE HD 和 DNA-In CRISPR 轉染試劑則分別以 2 μL∶1 μg、3 μL∶1 μg、4 μL∶1 μg 的比例配制質粒-脂質體復合物，后續轉染步驟嚴格按照每種轉染試劑的說明書進行操作，37℃ 培養 48 h 后檢測轉染效率。
1.2.3 熒光顯微鏡采圖 細胞轉染 48 h 后，用倒置熒光顯微鏡觀察 EGFP 綠色熒光蛋白信號，使用 ZEN 圖像處理系統進行圖像采集與分析。
1.2.4 熒光強度檢測 細胞轉染 48 h 后，棄去培養基，用磷酸鹽緩沖液洗 1 次后每孔加入 100 μL 磷酸鹽緩沖液，用多功能熒光酶標儀在 488 nm 激發光，509 nm 發射光下檢測轉染細胞中綠色熒光強度。
1.2.5 細胞活性檢測 細胞轉染 48 h 后，換成新鮮培養基，每孔加入 10 μL CCK-8 溶液，在細胞培養箱內繼續孵育 2 h，然后用酶標儀在 450 nm 處測定各孔的吸光度。
1.3 統計學方法
所有統計均在 GraphPad Prism 6 軟件中完成。每組實驗重復 3 次以上，所有數據均以均數±標準差的形式表示，組間熒光強度和細胞活性比較采用單因素方差分析。檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 H9C2 和 HEK29 細胞轉染效率比較
將 FuGENE HD 和 EGFP-LC3 質粒分別以 2 μL∶1 μg、3 μL∶1 μg、4 μL∶1 μg 的比例配制質粒-脂質體復合物，對 H9C2 細胞和 HEK293 細胞進行轉染，48 h 后用熒光顯微鏡觀察，發現對于兩種細胞，FuGENE HD 和質粒比例為 4 μL∶1 μg 時轉染效率最高；但和 HEK293 細胞相比，H9C2 細胞轉染效率明顯要低很多（圖 1）。
圖1
4 種轉染試劑轉染 H9C2 細胞 48 h 后熒光顯微鏡像（×10）
2.2 各種轉染試劑轉染 H9C2 細胞效率比較
將 4 種轉染試劑和質粒以不同比例配制質粒-脂質體復合物后轉染 H9C2 細胞，48 h 后用熒光顯微鏡觀察，結果表明 Lipofectamine 3000（3 μL∶1 μg）轉染效率>50%，轉染效率最高；而 DNA-In CRISPR（4 μL∶1 μg）轉染效率最低，<1%；Lipofectamine 2000（3 μL∶1 μg）轉染效率約為 10%，略高于 FuGENE HD（4 μL∶1 μg）（圖 1、2）。進一步用熒光酶標儀檢測各轉染孔的熒光強度，結果也是一致的（圖 3）。
圖2
4 種轉染試劑轉染 H9C2 細胞 48 h 后熒光顯微鏡像（×10）
圖3
4 種轉染試劑轉染 H9C2 48 h 后 EGFP 熒光強度
2.3 各種轉染試劑對 H9C2 細胞活性的影響
用 CCK-8 試劑檢測 4 種轉染試劑對 H9C2 細胞活性的影響，結果顯示，FuGENE HD、DNA-In CRISPR 和 Lipofectamine 3000 對 H9C2 活性影響無明顯差異，轉染 48 h 后細胞活性均在 90% 左右；而 Lipofectamine 2000 對 H9C2 細胞毒性較前 3 種轉染試劑都大，轉染 48 h 后細胞活性僅為 59.60%（圖 4）。
圖4
4 種轉染試劑轉染 H9C2 48 h 后細胞活性
3 討論
脂質體是目前實驗研究中使用最廣泛的非病毒轉染載體，相對于其他非病毒載體，具有更高的轉染效率，并且與病毒載體相比，具有低免疫原性和低致瘤性等優點[12]，因此被廣泛應用于基因轉染等研究中。脂質體轉染試劑主要有 4 種，包括免疫脂質體、帶負電荷脂質體、陽離子脂質體和配體脂質體[13]。其中陽離子脂質體是被研究最多的脂質體，是將基因、蛋白和其他分子轉運進入細胞的重要載體。對于如何提高陽離子脂質體轉染效率，國內外已經進行了大量研究。潘寧等[14]采用 Lipofectamine 2000 包裹重組質粒轉染人克隆結腸腺癌細胞 Caco-2 細胞，通過優化細胞接種密度、DNA 用量及脂質體與 DNA 比例、脂質體-DNA 復合物形成時間、細胞與脂質體復合物的孵育時間、細胞傳代次數等條件，獲得了這些因素的最佳組合轉染方案。
雖然目前很多脂質體轉染試劑在提高轉染效率方面取得了進步，但是由于不同細胞的細胞表面結構以及細胞膜、核膜結構均存在較大差異，同種轉染試劑在不同細胞的轉染效率也會不盡相同。Liu 等[15]用聚乙烯亞胺（polyethyleneimine，PEI）陽離子脂質體轉染 H9C2 細胞，只獲得了 13.6% 的轉染效率，而同樣用 PEI 轉染 CHO-K1 細胞，轉染效率卻高達 93.6%。可見脂質體對細胞具有選擇性，不同細胞由于細胞表面結構不同、細胞倍增時間不同等，同種轉染試劑對不同細胞的轉染效率是不同的。本研究也比較了 FuGene HD 轉染試劑對 H9C2 和 HEK293 細胞的轉染效率，對轉染后細胞進行熒光采圖，發現 HEK293 細胞轉染效率要遠遠高于 H9C2 細胞。
隨著對陽離子脂質體的研究越來越多，更多新型的陽離子脂質體被研發出用于細胞轉染。為了獲得 H9C2 細胞較高的轉染效率，我們分別比較了 FuGene HD、Lipofectamine 2000、Lipofectamin 3000 和 DNA-In CRISPR 這 4 種陽離子脂質體對 H9C2 細胞的轉染效率。Lipofectamine 2000 用于外源 DNA 的轉染載體在很多文獻中都有報道，是一種經典的陽離子脂質體轉染試劑，但由于其操作時需要無血清轉染環境，并且需在轉染后 3～5 h 更換細胞培養液，操作上較其他幾種轉染試劑要復雜。而 Lipofecrtamin 3000 則是 Lipofectamin 2000 的升級，可在含血清的培養環境中完成。FuGENE HD 是一種以脂質體為基礎的多成分轉染試劑，在多種細胞中具有高效轉染的效果[16]，但在本研究中發現其對 H9C2 細胞轉染效率并不理想。DNA-In CRISPR 是由 AMSBIO 公司推出的適用于類似于 CRISPR/Cas9 等相對分子質量較大的質粒轉染的脂質體載體。我們通過對轉染試劑和質粒濃度的摸索，發現 Lipofectamine 3000 轉染效率高于 Lipofectamine 2000，后者又高于 FuGENE HD，而 DNA-In CRISPR 轉染效率最低。
研究表明 DNA 濃度也是影響轉染效率的重要因素，DNA 濃度并非越高越好，過高濃度的 DNA 反而會抑制轉染效率，這可能是過量 DNA 會沉積于細胞表面，對細胞造成一定毒性作用[17]。而脂質體和 DNA 比例與脂質體-DNA 復合物的粒徑和形態有關，隨著兩者比例的增加，脂質體復合物的粒徑和電荷比也會相應增加，從而影響轉染效率。有研究顯示，一定粒徑大小的脂質體復合物有利于提高轉染效率，一方面在進入細胞前粒徑較大的脂質體可以延遲脂質體和 DNA 的解離；另一方面在進入細胞后較大粒徑脂質體復合物形成的大囊泡更容易崩解，從而釋放大量的 DNA 進入細胞質中[14]。但粒徑過大的脂質體復合物又會對細胞產生毒性[18]。因此最佳比例的脂質體和 DNA 復合物對轉染效率影響至關重要。本實驗因此摸索了不同脂質體-DNA 復合物比例，發現當 Lipofectamine 3000 和質粒比例為 3 μL∶1 μg 時，轉染效率最高。
由于脂質體復合物對細胞會產生一定毒性，如脂質體復合物可能導致細胞發生一些改變，包括細胞收縮、有絲分裂減少等；也可能對蛋白激酶 C 等蛋白質帶來有害影響[19]。因此在獲得較高轉染效率的同時也要盡量減少對細胞的毒性。對 4 種轉染試劑轉染 H9C2 細胞 24 h 后檢測細胞活性，結果顯示 Lipofectamine 2000 對 H9C2 細胞毒性較另 3 種轉染試劑都要大，這可能與 Lipofectamine 2000 陽離子脂質體的特性有關，可能參與了細胞某些生理活動，如誘發細胞凋亡[20]、抑制腺苷三磷酸酶活性[21]等。
因此綜上考慮，本研究的 4 種轉染試劑中 Lipofectamine 3000 對 H9C2 細胞轉染效率最高，而轉染毒性相對較低，更適合用于 H9C2 細胞的轉染。
外源基因轉入真核細胞即通常所說的細胞轉染技術，是研究基因表達調控及基因治療的有效技術之一，目前可通過磷酸鈣沉淀法、脂質體介導法、電穿孔法、顯微注射法及病毒轉染等實現[1-5]，其中脂質體介導法具有安全、操作簡便、對細胞毒性低、低免疫原性等特點，被廣泛應用于細胞轉染中[6]。但脂質體轉染也存在對細胞類型具有選擇性，轉染效率隨細胞類型不同而差別較大的缺點[7]，因此對于不同細胞需選擇最適的脂質體進行轉染，以獲得較高的轉染效率。
大鼠心肌細胞系 H9C2，有著骨骼肌的很多特性[8]，是用于研究多種心血管藥效的重要細胞系[9]。H9C2 也被用于研究與心臟衰竭有關基因的功能，如基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）-2 和 MMP-9[10]。此外，還能以 H9C2 作為模型來研究多柔比星誘導的心肌細胞凋亡和細胞毒性[11]。隨著細胞轉染技術的廣泛應用，找到高效、無毒的轉染 H9C2 細胞方法將為心血管疾病治療提供更多思路。
本研究分別用 FuGene HD、Lipofectamine 2000、Lipofectamin 3000 和 DNA-In CRISPR 4 種轉染試劑轉染帶有增強綠色熒光蛋白（enhanced green fluorescent protein，EGFP）基因的質粒至 H9C2 細胞，以探究較適合 H9C2 細胞轉染的方法。現報告如下。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 細胞系和質粒 H9C2 細胞、HEK293 細胞、EGFP-LC3 質粒均由本實驗室保存。
1.1.2 主要試劑 Dulbecco 改良 Eagle 高糖培養基購自美國 Hyclone 公司；胎牛血清購自美國 Gibco 公司；FuGENE HD 轉染試劑購自美國 Roche 公司；Lipofectamine 2000 轉染試劑、Lipofectamine 3000 轉染試劑購自美國 Invitrogen 公司；DNA-In CRISPR 轉染試劑購自英國 Amsbio 公司；質粒提取試劑盒購自美國 Omega 公司；Cell Counting Kit-8（CCK-8）細胞增殖試劑盒購自日本同仁化學公司。
1.1.3 主要儀器 倒置熒光顯微鏡（OBSERVER D1/AX10 cam HRC，德國卡爾·蔡司公司），多功能熒光酶標儀（Synergy Mx，美國伯騰儀器有限公司）。
1.2 方法
1.2.1 質粒制備 將質粒 EGFP-LC3 轉化大腸桿菌感受態 DH5a，挑出陽性克隆，在含有氨芐抗性的 LB 培養基中擴大培養，用質粒提取試劑盒提取純化后測定濃度和純度，具體操作步驟根據產品說明書進行。
1.2.2 細胞轉染 將 H9C2 細胞和 HEK293 細胞分別按 1×104個/孔接種于 96 孔板，待細胞生長至約 70% 匯合度時轉染 EGFP-LC3 質粒，每孔轉染 0.1 μg 質粒。Lipofectamine 3000 和 Lipofectamine 2000 轉染試劑分別以轉染試劑∶質粒=1.5 μL∶1 μg 和 3 μL∶1 μg 的比例配制質粒-脂質體復合物；FuGENE HD 和 DNA-In CRISPR 轉染試劑則分別以 2 μL∶1 μg、3 μL∶1 μg、4 μL∶1 μg 的比例配制質粒-脂質體復合物，后續轉染步驟嚴格按照每種轉染試劑的說明書進行操作，37℃ 培養 48 h 后檢測轉染效率。
1.2.3 熒光顯微鏡采圖 細胞轉染 48 h 后，用倒置熒光顯微鏡觀察 EGFP 綠色熒光蛋白信號，使用 ZEN 圖像處理系統進行圖像采集與分析。
1.2.4 熒光強度檢測 細胞轉染 48 h 后，棄去培養基，用磷酸鹽緩沖液洗 1 次后每孔加入 100 μL 磷酸鹽緩沖液，用多功能熒光酶標儀在 488 nm 激發光，509 nm 發射光下檢測轉染細胞中綠色熒光強度。
1.2.5 細胞活性檢測 細胞轉染 48 h 后，換成新鮮培養基，每孔加入 10 μL CCK-8 溶液，在細胞培養箱內繼續孵育 2 h，然后用酶標儀在 450 nm 處測定各孔的吸光度。
1.3 統計學方法
所有統計均在 GraphPad Prism 6 軟件中完成。每組實驗重復 3 次以上，所有數據均以均數±標準差的形式表示，組間熒光強度和細胞活性比較采用單因素方差分析。檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 H9C2 和 HEK29 細胞轉染效率比較
將 FuGENE HD 和 EGFP-LC3 質粒分別以 2 μL∶1 μg、3 μL∶1 μg、4 μL∶1 μg 的比例配制質粒-脂質體復合物，對 H9C2 細胞和 HEK293 細胞進行轉染，48 h 后用熒光顯微鏡觀察，發現對于兩種細胞，FuGENE HD 和質粒比例為 4 μL∶1 μg 時轉染效率最高；但和 HEK293 細胞相比，H9C2 細胞轉染效率明顯要低很多（圖 1）。
圖1
4 種轉染試劑轉染 H9C2 細胞 48 h 后熒光顯微鏡像（×10）
2.2 各種轉染試劑轉染 H9C2 細胞效率比較
將 4 種轉染試劑和質粒以不同比例配制質粒-脂質體復合物后轉染 H9C2 細胞，48 h 后用熒光顯微鏡觀察，結果表明 Lipofectamine 3000（3 μL∶1 μg）轉染效率>50%，轉染效率最高；而 DNA-In CRISPR（4 μL∶1 μg）轉染效率最低，<1%；Lipofectamine 2000（3 μL∶1 μg）轉染效率約為 10%，略高于 FuGENE HD（4 μL∶1 μg）（圖 1、2）。進一步用熒光酶標儀檢測各轉染孔的熒光強度，結果也是一致的（圖 3）。
圖2
4 種轉染試劑轉染 H9C2 細胞 48 h 后熒光顯微鏡像（×10）
圖3
4 種轉染試劑轉染 H9C2 48 h 后 EGFP 熒光強度
2.3 各種轉染試劑對 H9C2 細胞活性的影響
用 CCK-8 試劑檢測 4 種轉染試劑對 H9C2 細胞活性的影響，結果顯示，FuGENE HD、DNA-In CRISPR 和 Lipofectamine 3000 對 H9C2 活性影響無明顯差異，轉染 48 h 后細胞活性均在 90% 左右；而 Lipofectamine 2000 對 H9C2 細胞毒性較前 3 種轉染試劑都大，轉染 48 h 后細胞活性僅為 59.60%（圖 4）。
圖4
4 種轉染試劑轉染 H9C2 48 h 后細胞活性
3 討論
脂質體是目前實驗研究中使用最廣泛的非病毒轉染載體，相對于其他非病毒載體，具有更高的轉染效率，并且與病毒載體相比，具有低免疫原性和低致瘤性等優點[12]，因此被廣泛應用于基因轉染等研究中。脂質體轉染試劑主要有 4 種，包括免疫脂質體、帶負電荷脂質體、陽離子脂質體和配體脂質體[13]。其中陽離子脂質體是被研究最多的脂質體，是將基因、蛋白和其他分子轉運進入細胞的重要載體。對于如何提高陽離子脂質體轉染效率，國內外已經進行了大量研究。潘寧等[14]采用 Lipofectamine 2000 包裹重組質粒轉染人克隆結腸腺癌細胞 Caco-2 細胞，通過優化細胞接種密度、DNA 用量及脂質體與 DNA 比例、脂質體-DNA 復合物形成時間、細胞與脂質體復合物的孵育時間、細胞傳代次數等條件，獲得了這些因素的最佳組合轉染方案。
雖然目前很多脂質體轉染試劑在提高轉染效率方面取得了進步，但是由于不同細胞的細胞表面結構以及細胞膜、核膜結構均存在較大差異，同種轉染試劑在不同細胞的轉染效率也會不盡相同。Liu 等[15]用聚乙烯亞胺（polyethyleneimine，PEI）陽離子脂質體轉染 H9C2 細胞，只獲得了 13.6% 的轉染效率，而同樣用 PEI 轉染 CHO-K1 細胞，轉染效率卻高達 93.6%。可見脂質體對細胞具有選擇性，不同細胞由于細胞表面結構不同、細胞倍增時間不同等，同種轉染試劑對不同細胞的轉染效率是不同的。本研究也比較了 FuGene HD 轉染試劑對 H9C2 和 HEK293 細胞的轉染效率，對轉染后細胞進行熒光采圖，發現 HEK293 細胞轉染效率要遠遠高于 H9C2 細胞。
隨著對陽離子脂質體的研究越來越多，更多新型的陽離子脂質體被研發出用于細胞轉染。為了獲得 H9C2 細胞較高的轉染效率，我們分別比較了 FuGene HD、Lipofectamine 2000、Lipofectamin 3000 和 DNA-In CRISPR 這 4 種陽離子脂質體對 H9C2 細胞的轉染效率。Lipofectamine 2000 用于外源 DNA 的轉染載體在很多文獻中都有報道，是一種經典的陽離子脂質體轉染試劑，但由于其操作時需要無血清轉染環境，并且需在轉染后 3～5 h 更換細胞培養液，操作上較其他幾種轉染試劑要復雜。而 Lipofecrtamin 3000 則是 Lipofectamin 2000 的升級，可在含血清的培養環境中完成。FuGENE HD 是一種以脂質體為基礎的多成分轉染試劑，在多種細胞中具有高效轉染的效果[16]，但在本研究中發現其對 H9C2 細胞轉染效率并不理想。DNA-In CRISPR 是由 AMSBIO 公司推出的適用于類似于 CRISPR/Cas9 等相對分子質量較大的質粒轉染的脂質體載體。我們通過對轉染試劑和質粒濃度的摸索，發現 Lipofectamine 3000 轉染效率高于 Lipofectamine 2000，后者又高于 FuGENE HD，而 DNA-In CRISPR 轉染效率最低。
研究表明 DNA 濃度也是影響轉染效率的重要因素，DNA 濃度并非越高越好，過高濃度的 DNA 反而會抑制轉染效率，這可能是過量 DNA 會沉積于細胞表面，對細胞造成一定毒性作用[17]。而脂質體和 DNA 比例與脂質體-DNA 復合物的粒徑和形態有關，隨著兩者比例的增加，脂質體復合物的粒徑和電荷比也會相應增加，從而影響轉染效率。有研究顯示，一定粒徑大小的脂質體復合物有利于提高轉染效率，一方面在進入細胞前粒徑較大的脂質體可以延遲脂質體和 DNA 的解離；另一方面在進入細胞后較大粒徑脂質體復合物形成的大囊泡更容易崩解，從而釋放大量的 DNA 進入細胞質中[14]。但粒徑過大的脂質體復合物又會對細胞產生毒性[18]。因此最佳比例的脂質體和 DNA 復合物對轉染效率影響至關重要。本實驗因此摸索了不同脂質體-DNA 復合物比例，發現當 Lipofectamine 3000 和質粒比例為 3 μL∶1 μg 時，轉染效率最高。
由于脂質體復合物對細胞會產生一定毒性，如脂質體復合物可能導致細胞發生一些改變，包括細胞收縮、有絲分裂減少等；也可能對蛋白激酶 C 等蛋白質帶來有害影響[19]。因此在獲得較高轉染效率的同時也要盡量減少對細胞的毒性。對 4 種轉染試劑轉染 H9C2 細胞 24 h 后檢測細胞活性，結果顯示 Lipofectamine 2000 對 H9C2 細胞毒性較另 3 種轉染試劑都要大，這可能與 Lipofectamine 2000 陽離子脂質體的特性有關，可能參與了細胞某些生理活動，如誘發細胞凋亡[20]、抑制腺苷三磷酸酶活性[21]等。
因此綜上考慮，本研究的 4 種轉染試劑中 Lipofectamine 3000 對 H9C2 細胞轉染效率最高，而轉染毒性相對較低，更適合用于 H9C2 細胞的轉染。
