引用本文： 李偉, 王紅莉, 李虹, 陳甦, 余美英, 周秋媛, 徐艷華, 曲延剛. 甲胎蛋白陰性與陽性穿刺活檢人肝細胞癌中 CD34 及多克隆癌胚抗原的表達及其病理診斷意義. 華西醫學, 2017, 32(8): 1195-1198. doi: 10.7507/1002-0179.201606041 復制
肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是目前惡性腫瘤中比較常見的一種疾病[1]，其病程進展迅速，往往發現時已到了中晚期，失去了最佳治療時機，且手術切除率低，其惡性程度、治療效果及預后都比較差。近年來，超聲引導下肝臟穿刺活檢已成為肝臟疾病診斷的重要輔助手段[2-3]，且是安全簡單的方法[4]，尤其是對于肝癌的診斷，但同時由于穿刺活檢所取得組織塊小，比較局限，增加了病理診斷的難度和風險。鑒于此，本研究旨在通過免疫組織化學（免疫組化）檢測甲胎蛋白（alpha fetoprotein，AFP）、多克隆癌胚抗原（polyclone carcinoembryonic antigen，pCEA）和 CD34 在HCC中的表達情況，探討其在肝穿刺活檢標本中輔助診斷 HCC 的病理診斷價值。現報告如下。
1 材料與方法
1.1 材料
共收集 2013 年—2015 年恩施土家族苗族自治州中心醫院穿刺活檢的 HCC 標本 54 例，所有病例均經過病理診斷證實，且為真實反映腫瘤細胞蛋白的表達水平，患者穿刺前未經任何針對腫瘤的化學治療及放射治療。其中男 43 例，女 11 例；年齡 27～70 歲，中位年齡 53 歲。依據血清學及免疫組化法檢查 AFP 結果，血清 AFP≥400 ng/mL 及 AFP 免疫組化染色示HCC組織中癌細胞細胞質中見棕黃色著色視為陽性，將患者按其分為 2 組，AFP 陽性組 33 例，AFP 陰性組 21 例。
1.2 方法
1.2.1 主要試劑 鼠抗人癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）多克隆抗體、鼠抗人 CD34 單克隆抗體、兔抗人 AFP 多克隆抗體及即用型鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結法（streptavidin-perosidase，SP）試劑盒及二氨基聯苯胺（diaminobenzine，DAB）顯色劑購自北京中杉金橋生物技術有限公司。
1.2.2 免疫組化染色 所有標本均經過 4% 中性甲醛固定，常規石蠟包埋，制成 4 μm 厚連續切片。免疫組化染色采用 SP 法，鼠抗人 CEA 多克隆抗體標記 CEA 蛋白，鼠抗人 CD34 單克隆抗體標記血管內皮細胞，兔抗人 AFP 多克隆抗體標記 AFP 蛋白，CEA、 CD34 和 AFP共同進行高壓鍋熱修復（120℃，3 min 30 s）及 DAB 顯色、蘇木素復染、中性樹膠封片。實驗步驟按試劑盒說明書進行，嚴格控制實驗條件，每組實驗均設陽性對照和用磷酸鹽緩沖液代替一抗作陰性對照，每組均作常規蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色。
1.2.3 結果判斷 pCEA 陽性者免疫組化染色示毛細膽管內可見棕黃色顆粒，CD34 陽性者對 HCC 組織染色以呈現彌漫和均勻分布的新生微血管內皮細胞質或細胞膜著色為特征[5]，每張切片隨機計數 10 個視野（×200），每個視野計數 100 個腫瘤細胞或非腫瘤肝細胞內免疫染色陽性細胞數，計算出每張切片的陽性細胞百分數，以陽性細胞百分數高于 5% 以上為陽性表達。由 2 名病理醫生采用雙盲法獨立檢測[6]。
1.3 統計學方法
采用 SPSS 16. 0 軟件對研究數據進行統計學分析。計數資料用例數和百分比表示，率的比較采用 χ2 檢驗。檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 HCC 中 pCEA 的表達情況
AFP 陽性組及 AFP 陰性組中 pCEA 表達陽性率分別為 69.7%（23/33）、38.1%（8/21）。陽性表達染色呈淡黃色或棕黃色，定位于毛細膽管上（圖 1）；AFP 陽性組的陽性表達率顯著高于 AFP 陰性組，差異有統計學意義（P<0.05），見表 1。
表1
pCEA 在 HCC 組織中的表達情況[例（%）]
圖1
pCEA 在 HCC 中的表達（SP ×200）
陽性染色表達定位在毛細膽管上，呈棕黃色或淡黃色
2.2 CD34 在 HCC 中的表達情況
AFP 陽性組及 AFP 陰性組中 CD34 表達陽性率分別為 90.91%（30/33）、85.71%（18/21），陽性表達染色為淡黃色或棕黃色的單個或成簇血管內皮細胞，定位于微血管內皮細胞細胞膜和細胞質中，呈現出線狀型、環狀型等形態（圖 2）；AFP 陽性組的 CD34 陽性表達率與 AFP 陰性組的陽性表達率相比較，差異無統計學意義（P>0.05），見表 2。
表2
HCC 組織中 CD34 的表達情況[例（%）]
圖2
CD34 在 HCC 中的表達（SP ×200）
a. 陽性染色表達定位在單個或者成簇的血管內皮細胞，呈棕黃色的環狀型；b. 陽性染色表達定位在單個或者成簇的血管內皮細胞，呈棕黃色的線狀型
3 討論
原發性肝癌是一種常見且嚴重危害人類生命健康的惡性腫瘤，近年在我國發病率呈上升趨勢[7]，其特點主要是發病隱匿，早期缺乏典型癥狀，惡性程度高，危害大，大多數患者就診時已經屬于中晚期，很多患者也因此失去手術根治機會，導致其病死率很高，在世界范圍內已逐年升高位居第 2 位[8]。因此對原發性肝癌的早期診斷顯得尤為重要。其病因和發病機制尚不十分明了，目前認為與病毒性肝炎、肝硬化、黃曲霉菌等致癌物質和環境因素有關[9-10]。而原發性肝癌在病理組織學上分為 HCC、膽管細胞癌和混合細胞型肝癌 3 型，其中 HCC 是最多見的組織學類型，我國 90% 以上病例屬原發性 HCC。因肝癌癥狀不典型，早期診斷有一定困難。而隨著現代科技的發展進步，微創穿刺術的應用，使原發性肝癌的診斷水平較以前有所提高，然而在肝臟穿刺活檢標本中，由于取材的局限性，對 HCC 的病理診斷，增加了病理工作者的診斷難度。
AFP 是一種由胚胎卵黃囊細胞、胚胎肝細胞和胎兒腸道細胞合成的一種糖蛋白，隨著胎兒生長發育，AFP 濃度逐漸降低，至出生 2 年后可降至正常成人水平（<0.02 mg/L）；AFP 作為原發性肝癌較為特異的生化指標[11]，被公認為目前臨床上 HCC 患者血清學診斷的“金標準”，對肝癌有相對的專一性，但至目前為止，在臨床的原發性肝癌患者中，約 60%～85% 的患者其 AFP 陽性，約 30% 的肝癌患者 AFP 為陰性[12]，表明其為一種特異性強，但敏感性較低的腫瘤標志物，故 AFP 陰性絕不能排除肝癌的診斷，否則容易造成漏診或誤診；在我們的研究中也證實了這一點，并不是所有的 HCC 都表達 AFP。
CEA 為癌胚抗原，是血清中的一種糖蛋白，主要產生于消化道及胰腺等器官，在內胚葉消化系統惡性腫瘤中存在廣泛，是一種廣譜的腫瘤標志物，雖然不能作為診斷某種惡性腫瘤的特異性指標，但在惡性腫瘤的鑒別診斷、病情監測、病情進展、療效評價等方面仍有重要作用，除了在 HCC 中表達，還可在轉移性肝癌、結腸癌、胰腺癌、胃癌、肺癌等有不同程度的陽性率。作為 HCC 的一種免疫組化標志物，有單克隆與多克隆之分，可以識別不同的抗原決定簇。單克隆 CEA（mCEA）呈胞漿型染色，在膽管細胞癌或轉移性腺癌的陽性表達率分別為 60%～75%，而在 HCC 中的陽性表達率為 0%～11%，且不顯示毛細膽管[13]。pCEA 對于 HCC 是以特異性的小管染色模式，而在轉移性腺癌或膽管細胞癌中一般不染色或者僅是細胞質染色，但其在腺樣肝癌中一般染色于腺的腔側緣，pCEA 在轉移性腺癌或膽管細胞癌中有時可見弱或管腔染色，所以有時其染色模式很難識別，特別是在分化差的 HCC 中，因此 pCEA 的使用價值受到了一定的限制。本研究發現，在 HCC 患者中，AFP 陽性患者的 pCEA 的陽性表達率明顯高于 AFP 陰性患者，兩者具有一定的相關性，在平時工作中對 HCC 的病理診斷中可以聯合檢測 AFP 和 pCEA，提高對 HCC 的診斷及其鑒別診斷。
CD34 是一種高度甲基化的 Ⅰ 型跨膜蛋白的磷酸糖蛋白，其相對分子質量為 11.5×104，最早發現于骨髓淋巴及粒系早期細胞膜上，參與造血干/祖細胞的黏附、分化等過程，但很快人們就發現小血管內皮細胞及部分原始的間質細胞上也存在 CD34 抗原，目前被認為是血管源性腫瘤的特異性標志物之一，HCC 是一種富含血管的實質性腫瘤，HCC 中的 CD34 陽性表達的微血管呈長條狀或分枝狀，管壁纖細，管腔狹窄，分布均勻彌漫；而膽管細胞癌和轉移性腺癌組織中微血管呈干枝狀，稀疏雜亂[14]。盡管 CD34 本身不直接顯示 HCC 的癌細胞，但 HCC 組織中 CD34 陽性表達的微血管分布形式比較特異，可將其分為點狀型、線狀型、環狀型、條索型，將其特稱為“HCC 型染色”[5, 13, 15-17]，故 CD34 可被視為有用的 HCC 診斷標志物[5]。在本次檢測中發現 CD34 的陽性表達與 AFP 并無相關性，但其在 HCC 中陽性表達率達到了 90.90% 和 85.71%，再一次證實了 CD34 特征性的微血管表達特點同 HCC 的相關性，故在 HCC 的病理診斷工作中，可將 AFP、CD34 與 pCEA 聯合應用，可提高穿刺活檢中 HCC 的診斷率，降低誤診率。
本次研究旨在通過免疫組化檢測 CD34 和 pCEA 在穿刺活檢人 HCC 中的表達情況以及二者與 AFP 的相關性進行研究，結果顯示在 HCC 患者中，AFP 陽性患者的 pCEA 的陽性表達率明顯高于 AFP 陰性患者，兩者具有一定的相關性。然而 CD34 的陽性表達與 AFP 并無明顯相關性，但其在 HCC 中特征性的微血管著色方式對于 HCC 的病理診斷具有較大的指導意義。鑒于此，在實際工作中，可將 AFP、CD34 與 pCEA 合并運用于 HCC 的病理診斷中。
肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是目前惡性腫瘤中比較常見的一種疾病[1]，其病程進展迅速，往往發現時已到了中晚期，失去了最佳治療時機，且手術切除率低，其惡性程度、治療效果及預后都比較差。近年來，超聲引導下肝臟穿刺活檢已成為肝臟疾病診斷的重要輔助手段[2-3]，且是安全簡單的方法[4]，尤其是對于肝癌的診斷，但同時由于穿刺活檢所取得組織塊小，比較局限，增加了病理診斷的難度和風險。鑒于此，本研究旨在通過免疫組織化學（免疫組化）檢測甲胎蛋白（alpha fetoprotein，AFP）、多克隆癌胚抗原（polyclone carcinoembryonic antigen，pCEA）和 CD34 在HCC中的表達情況，探討其在肝穿刺活檢標本中輔助診斷 HCC 的病理診斷價值。現報告如下。
1 材料與方法
1.1 材料
共收集 2013 年—2015 年恩施土家族苗族自治州中心醫院穿刺活檢的 HCC 標本 54 例，所有病例均經過病理診斷證實，且為真實反映腫瘤細胞蛋白的表達水平，患者穿刺前未經任何針對腫瘤的化學治療及放射治療。其中男 43 例，女 11 例；年齡 27～70 歲，中位年齡 53 歲。依據血清學及免疫組化法檢查 AFP 結果，血清 AFP≥400 ng/mL 及 AFP 免疫組化染色示HCC組織中癌細胞細胞質中見棕黃色著色視為陽性，將患者按其分為 2 組，AFP 陽性組 33 例，AFP 陰性組 21 例。
1.2 方法
1.2.1 主要試劑 鼠抗人癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）多克隆抗體、鼠抗人 CD34 單克隆抗體、兔抗人 AFP 多克隆抗體及即用型鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結法（streptavidin-perosidase，SP）試劑盒及二氨基聯苯胺（diaminobenzine，DAB）顯色劑購自北京中杉金橋生物技術有限公司。
1.2.2 免疫組化染色 所有標本均經過 4% 中性甲醛固定，常規石蠟包埋，制成 4 μm 厚連續切片。免疫組化染色采用 SP 法，鼠抗人 CEA 多克隆抗體標記 CEA 蛋白，鼠抗人 CD34 單克隆抗體標記血管內皮細胞，兔抗人 AFP 多克隆抗體標記 AFP 蛋白，CEA、 CD34 和 AFP共同進行高壓鍋熱修復（120℃，3 min 30 s）及 DAB 顯色、蘇木素復染、中性樹膠封片。實驗步驟按試劑盒說明書進行，嚴格控制實驗條件，每組實驗均設陽性對照和用磷酸鹽緩沖液代替一抗作陰性對照，每組均作常規蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色。
1.2.3 結果判斷 pCEA 陽性者免疫組化染色示毛細膽管內可見棕黃色顆粒，CD34 陽性者對 HCC 組織染色以呈現彌漫和均勻分布的新生微血管內皮細胞質或細胞膜著色為特征[5]，每張切片隨機計數 10 個視野（×200），每個視野計數 100 個腫瘤細胞或非腫瘤肝細胞內免疫染色陽性細胞數，計算出每張切片的陽性細胞百分數，以陽性細胞百分數高于 5% 以上為陽性表達。由 2 名病理醫生采用雙盲法獨立檢測[6]。
1.3 統計學方法
采用 SPSS 16. 0 軟件對研究數據進行統計學分析。計數資料用例數和百分比表示，率的比較采用 χ2 檢驗。檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 HCC 中 pCEA 的表達情況
AFP 陽性組及 AFP 陰性組中 pCEA 表達陽性率分別為 69.7%（23/33）、38.1%（8/21）。陽性表達染色呈淡黃色或棕黃色，定位于毛細膽管上（圖 1）；AFP 陽性組的陽性表達率顯著高于 AFP 陰性組，差異有統計學意義（P<0.05），見表 1。
表1
pCEA 在 HCC 組織中的表達情況[例（%）]
圖1
pCEA 在 HCC 中的表達（SP ×200）
陽性染色表達定位在毛細膽管上，呈棕黃色或淡黃色
2.2 CD34 在 HCC 中的表達情況
AFP 陽性組及 AFP 陰性組中 CD34 表達陽性率分別為 90.91%（30/33）、85.71%（18/21），陽性表達染色為淡黃色或棕黃色的單個或成簇血管內皮細胞，定位于微血管內皮細胞細胞膜和細胞質中，呈現出線狀型、環狀型等形態（圖 2）；AFP 陽性組的 CD34 陽性表達率與 AFP 陰性組的陽性表達率相比較，差異無統計學意義（P>0.05），見表 2。
表2
HCC 組織中 CD34 的表達情況[例（%）]
圖2
CD34 在 HCC 中的表達（SP ×200）
a. 陽性染色表達定位在單個或者成簇的血管內皮細胞，呈棕黃色的環狀型；b. 陽性染色表達定位在單個或者成簇的血管內皮細胞，呈棕黃色的線狀型
3 討論
原發性肝癌是一種常見且嚴重危害人類生命健康的惡性腫瘤，近年在我國發病率呈上升趨勢[7]，其特點主要是發病隱匿，早期缺乏典型癥狀，惡性程度高，危害大，大多數患者就診時已經屬于中晚期，很多患者也因此失去手術根治機會，導致其病死率很高，在世界范圍內已逐年升高位居第 2 位[8]。因此對原發性肝癌的早期診斷顯得尤為重要。其病因和發病機制尚不十分明了，目前認為與病毒性肝炎、肝硬化、黃曲霉菌等致癌物質和環境因素有關[9-10]。而原發性肝癌在病理組織學上分為 HCC、膽管細胞癌和混合細胞型肝癌 3 型，其中 HCC 是最多見的組織學類型，我國 90% 以上病例屬原發性 HCC。因肝癌癥狀不典型，早期診斷有一定困難。而隨著現代科技的發展進步，微創穿刺術的應用，使原發性肝癌的診斷水平較以前有所提高，然而在肝臟穿刺活檢標本中，由于取材的局限性，對 HCC 的病理診斷，增加了病理工作者的診斷難度。
AFP 是一種由胚胎卵黃囊細胞、胚胎肝細胞和胎兒腸道細胞合成的一種糖蛋白，隨著胎兒生長發育，AFP 濃度逐漸降低，至出生 2 年后可降至正常成人水平（<0.02 mg/L）；AFP 作為原發性肝癌較為特異的生化指標[11]，被公認為目前臨床上 HCC 患者血清學診斷的“金標準”，對肝癌有相對的專一性，但至目前為止，在臨床的原發性肝癌患者中，約 60%～85% 的患者其 AFP 陽性，約 30% 的肝癌患者 AFP 為陰性[12]，表明其為一種特異性強，但敏感性較低的腫瘤標志物，故 AFP 陰性絕不能排除肝癌的診斷，否則容易造成漏診或誤診；在我們的研究中也證實了這一點，并不是所有的 HCC 都表達 AFP。
CEA 為癌胚抗原，是血清中的一種糖蛋白，主要產生于消化道及胰腺等器官，在內胚葉消化系統惡性腫瘤中存在廣泛，是一種廣譜的腫瘤標志物，雖然不能作為診斷某種惡性腫瘤的特異性指標，但在惡性腫瘤的鑒別診斷、病情監測、病情進展、療效評價等方面仍有重要作用，除了在 HCC 中表達，還可在轉移性肝癌、結腸癌、胰腺癌、胃癌、肺癌等有不同程度的陽性率。作為 HCC 的一種免疫組化標志物，有單克隆與多克隆之分，可以識別不同的抗原決定簇。單克隆 CEA（mCEA）呈胞漿型染色，在膽管細胞癌或轉移性腺癌的陽性表達率分別為 60%～75%，而在 HCC 中的陽性表達率為 0%～11%，且不顯示毛細膽管[13]。pCEA 對于 HCC 是以特異性的小管染色模式，而在轉移性腺癌或膽管細胞癌中一般不染色或者僅是細胞質染色，但其在腺樣肝癌中一般染色于腺的腔側緣，pCEA 在轉移性腺癌或膽管細胞癌中有時可見弱或管腔染色，所以有時其染色模式很難識別，特別是在分化差的 HCC 中，因此 pCEA 的使用價值受到了一定的限制。本研究發現，在 HCC 患者中，AFP 陽性患者的 pCEA 的陽性表達率明顯高于 AFP 陰性患者，兩者具有一定的相關性，在平時工作中對 HCC 的病理診斷中可以聯合檢測 AFP 和 pCEA，提高對 HCC 的診斷及其鑒別診斷。
CD34 是一種高度甲基化的 Ⅰ 型跨膜蛋白的磷酸糖蛋白，其相對分子質量為 11.5×104，最早發現于骨髓淋巴及粒系早期細胞膜上，參與造血干/祖細胞的黏附、分化等過程，但很快人們就發現小血管內皮細胞及部分原始的間質細胞上也存在 CD34 抗原，目前被認為是血管源性腫瘤的特異性標志物之一，HCC 是一種富含血管的實質性腫瘤，HCC 中的 CD34 陽性表達的微血管呈長條狀或分枝狀，管壁纖細，管腔狹窄，分布均勻彌漫；而膽管細胞癌和轉移性腺癌組織中微血管呈干枝狀，稀疏雜亂[14]。盡管 CD34 本身不直接顯示 HCC 的癌細胞，但 HCC 組織中 CD34 陽性表達的微血管分布形式比較特異，可將其分為點狀型、線狀型、環狀型、條索型，將其特稱為“HCC 型染色”[5, 13, 15-17]，故 CD34 可被視為有用的 HCC 診斷標志物[5]。在本次檢測中發現 CD34 的陽性表達與 AFP 并無相關性，但其在 HCC 中陽性表達率達到了 90.90% 和 85.71%，再一次證實了 CD34 特征性的微血管表達特點同 HCC 的相關性，故在 HCC 的病理診斷工作中，可將 AFP、CD34 與 pCEA 聯合應用，可提高穿刺活檢中 HCC 的診斷率，降低誤診率。
本次研究旨在通過免疫組化檢測 CD34 和 pCEA 在穿刺活檢人 HCC 中的表達情況以及二者與 AFP 的相關性進行研究，結果顯示在 HCC 患者中，AFP 陽性患者的 pCEA 的陽性表達率明顯高于 AFP 陰性患者，兩者具有一定的相關性。然而 CD34 的陽性表達與 AFP 并無明顯相關性，但其在 HCC 中特征性的微血管著色方式對于 HCC 的病理診斷具有較大的指導意義。鑒于此，在實際工作中，可將 AFP、CD34 與 pCEA 合并運用于 HCC 的病理診斷中。
