引用本文： 曾義軍, 余水, 雷町, 張恒, 李勁梅, 周章明. 谷氨酸受體 5 在人難治性顳葉癲癇腦組織中的表達研究. 華西醫學, 2017, 32(5): 659-664. doi: 10.7507/1002-0179.201604129 復制
藥物難治性癲癇是指經過 3 種及以上一線抗癲癇藥物正規治療 2 年以上，發作頻率>2 次/月的原發性癲癇。藥物難治性癲癇占癲癇患者的 20%～40%，其中以顳葉癲癇最為常見[1]。長期以來，人們一直在探索顳葉癲癇的病因、病變特點及其發病機制，并努力尋找治療的有效措施。近年在癲癇發病機制相關神經遞質受體的研究中，從屬于谷氨酸受體（glutamic receptor，GLUR）的紅藻氨酸受體（kainate receptors，KAR）家族越來越受到關注，紅藻氨酸（kainate，KA）是從一種海藻中天然提取的興奮性氨基酸——谷氨酸的結構類似物，通過 KA 誘導的癲癇動物模型中發現，KA 在顳葉癲癇中誘導癇樣發作和產生神經病理性損害，表明 KA 是一種強效的神經毒素[2-3]。KA 誘導的癲癇模型的特點是具有典型的顳葉癲癇的共同特征：對大部分抗癲癇藥物耐藥；與人類顳葉癲癇有相似的癲癇發作行為特點；神經病理學上特異的海馬損傷與顳葉癲癇的海馬硬化有關[3]。分子克隆發現 KA 與離子型 GLUR 存在高親和性[4-5]。在 KA 誘導的顳葉癲癇模型中很早就發現 KAR 是 GLUR 中的一個獨立受體家族[6]。通過 KAR 亞基克隆明確發現 KAR 家族由 5 種受體亞基組成，包括 GLUR5、GLUR6、GLUR7、KA1 和 KA2；KAR 在中樞神經系統中廣泛分布，皮質的椎體細胞樹突棘的突觸后密度是主要分布部位，而膠質細胞少見分布[7]。目前對難治性顳葉癲癇發病機制的研究主要來源于嚙齒類鼠模型或體外細胞實驗，但是對人藥物難治性癲癇研究甚少。因此，本研究通過測定 GLUR5 在人難治性顳葉癲癇和馬桑內酯誘導的恒河猴癲癇模型腦組織（海馬和顳葉）中的蛋白表達水平，探討 GLUR5 與人難治性癲癇的發病關系，為癲癇的病因學研究和臨床治療提供可能的理論依據。現報告如下。
1 材料與方法
1.1 研究對象
1.1.1 臨床資料部分 本研究經過我院倫理委員會批準。選取 2007 年 1 月—2015 年 12 月在四川大學華西醫院行手術治療的 54 例藥物難治性顳葉癲癇患者作為臨床病例組。納入標準：① 年齡≥14 歲；② 有復雜部分性發作或復雜部分性發作繼發全身性發作的顳葉癲癇典型臨床表現和腦電圖特征，經正規服用 3 種或 3 種以上一線抗癲癇藥物有效劑量治療 2 年以上，發作頻率>2 次/月；③ 患者術前經視頻腦電圖或術前放置硬膜下皮質電極監測，并結合 CT 或 MRI（MRS）定位致癇灶；④ 患者嚴格進行術前評估，確定適合手術后并于術中用皮質電極監測；⑤ 患者及其家屬術前簽署知情同意書。54 例患者中，男 34 例，女 20 例；年齡 15～45 歲，平均（23.87±6.32）歲；病程 2～24 年，平均（9.93±6.95）年；術前癲癇發作頻數為 4～58 次/月，平均（15.25±14.40）次/月；癲癇發作類型為復雜部分性發作或繼發全身性發作；抗癲癇藥物使用：3 種 41 例，3 種以上 13 例；MRI 或 CT 檢查：海馬硬化 33 例，顳葉內側占位病變 9 例，正常 12 例；視頻腦電圖檢查：癇波發放 54 例；手術切除部位：海馬 31 例，顳葉+海馬 23 例；病理檢查：異常改變 52 例，正常 2 例。
選取 2007 年 1 月—2015 年 12 月在四川大學華西醫院收治的 43 例因外傷、腫瘤或大面積腦出血并發腦疝行去顳葉皮質減壓手術的患者作為臨床對照組。納入標準：① 年齡≥14 歲；② 無癲癇發作史；③ 病理切片證實腦組織結構基本正常；④ 取材部位為顳葉或海馬；⑤ 患者家屬同意，并簽署知情同意書。43 例患者中，男 28 例，女 15 例；年齡 19～57 歲，平均（37.75±12.56）歲；病因：腦外傷 27 例，膠質細胞瘤 5 例，大面積腦出血并腦疝 11 例；手術切除部位：顳葉 27 例，海馬 16 例；病理檢查：異常改變 3 例，正常 40 例。
1.1.2 動物實驗部分 選取 6 只健康成年恒河猴，均為雄性，平均年齡 35.5 個月，體質量 5.1～6.2 kg，由四川大學實驗動物中心提供。用隨機數字表法將恒河猴分為動物實驗組和動物對照組，每組各 3 只。
1.2 研究方法
1.2.1 動物癲癇模型的建立 對動物實驗組恒河猴采用肌肉注射馬桑內酯（5 mg/mL，成都中醫藥大學提取），按 0.6 mL/kg 肌肉注射，每 72 小時注射 1 次，每天觀察恒河猴情況，并根據恒河猴每次對馬桑內酯的反應調整用藥，以達到癇樣發作的最小劑量為準，造模成功的動物實驗組恒河猴均有自發性癲癇發作，且符合顳葉癲癇的表現。頭皮電極和深部電極顯示癇波來自顳區和海馬。動物對照組給予相應劑量的生理鹽水肌肉注射。動物實驗組和動物對照組的飼養時間均為 90 d。若發生癲癇持續狀態則給予地西泮 1 mg/kg 肌肉注射以終止癲癇發作，降低其死亡率。動物實驗組 3 只恒河猴均未發生癲癇持續狀態，均成活。
1.2.2 樣本收集 ① 臨床患者標本：術中獲取標本后立即放入已編號并用焦炭酸二乙酯液浸泡 24 h 以上的細胞凍存管，置于液氮中冷凍保存。同時切取細條狀顳葉皮質組織和海馬組織放入丙二酮中固定。② 動物實驗標本：兩組恒河猴均給予氯胺酮深度麻醉后開顱切取其海馬及顳葉組織，其他處理同臨床患者標本。
1.2.3 熒光定量聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR） ① RNA 制備及質量檢測：細胞總信使 RNA（messenger RNA，mRNA）采用 Unlzol 試劑盒，提取的總 RNA 沉淀在加入了無 RNA 酶的 Mikki-Q 水完全溶解后，–80℃ 冰箱保存。② 熒光定量 PCR：紫外分光光度儀、電泳實驗進行質量檢測。檢測合格后采用 mRNA 柱純化試劑盒（Boistar 公司）純化個體樣品的mRNA，逆轉錄生成互補 DNA。分別取 5 μg mRNA 為逆轉錄模板。
根據熒光定量逆轉錄 PCR 引物設計原則，采用 Primer Express 1.5 軟件（美國 Invitrogen 公司）設計引物：GLUR5 上游引物為 5’-GAAGACAGCACAGGTCTAAT-3’，下游引物為 5’-CAATCAAATATCACATAGAACT- 3’，Taqman 探針為 5’-CTCATCAAAGCTCCCTCCAGA-3’。Beta-actin 為內參基因，上游引物為 5’-tgggtgtgaa ccacgagaa-3’，下游引物為 5’-ggcatggactgtggtcatga-3’，Taqman 探針為5’-ctgcaccaccaactgcttagc-3’。
反應體系置于 FTC2000 PCR 儀（加拿大 Funglyn 公司）進行 PCR。樣品按下列條件擴增：94℃ 2 min；94℃ 20 s；55℃ 30 s；60℃ 40 s，45 個循環，每個樣品重復檢測 3 次。PCR 反應產物任取 2 個樣本 1.5% 瓊脂糖凝膠電泳，觀察擴增片段。測定各個樣品的循環閾值（cycle threshold，CT），即每個反應管內的熒光信號達到設定的閾值時所經歷的循環數。使用 Rest 軟件進行 CT 值的相對定量分析，并計算各樣品中 GLUR5 的 mRNA 表達比值（expression ratios），即R 值[8]。
1.2.4 蛋白質印跡實驗 各組的每個腦組織樣本均稱取 100 mg，勻漿后離心，取少量上清液行二辛可寧酸蛋白定量，調整濃度為 2 μg/μL。第 1 泳道 maker 上樣 10 μL，其余泳道上樣 30 μL。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，恒定電壓 160 V 進行電泳。電轉移至聚偏氟乙烯膜（美國 Dupont 公司），300 V、300 mA 恒壓轉移 1 h。聚偏氟乙烯膜用磷酸鹽緩沖液洗滌后入含 3% 牛血清白蛋白的 pH 值 7.2 的磷酸鹽緩沖液封閉 1 h。
加入一抗兔抗人 GLUR5 抗體（#22053，美國 MilliPORE 公司，）4℃ 過夜，一抗稀釋比例為 1∶1 000。選擇辣根過氧化物標記的二抗 PIERCE，1∶1 000 稀釋，室溫下反應 1 h。辣根過氧化物-電化學發光法將 X 線片曝光，顯影，定影。圖像分析采用 LabworksTM 掃描分析軟件計算灰度值。
1.3 統計學方法
采用 SPSS 13.0 軟件行統計分析。計量數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析及t 檢驗。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 臨床病例與對照結果
2.1.1 熒光定量 PCR 結果 臨床病例組與臨床對照組顳葉組織的 GLUR5 mRNA 表達的R 值為 0.262，差異無統計學意義（P>0.05）；海馬組織的 GLUR5 mRNA 表達R 值為 4.896，差異有統計學意義（P<0.05）。GLUR5 擴增曲線顯示臨床病例組較臨床對照組海馬組織中 GLUR5 mRNA 水平向上調節；擴增曲線顯示臨床病例組與臨床對照組顳葉組織中 GLUR5 mRNA 水平無明顯變化。GLUR5 PCR 擴增產物電泳圖顯示擴增片段為 161 bp。見圖 1～3。
圖1
臨床病例組與臨床對照組海馬組織的 GLUR5 擴增曲線圖
C：臨床對照組；E：臨床病例組
圖2
臨床病例組與臨床對照組顳葉組織的 GLUR5 擴增曲線圖
C：臨床對照組；E：臨床病例組
圖3
GLUR5 PCR 擴增產物電泳圖
a. 難治性顳葉癲癇患者海馬組織擴增產物電泳圖；b. actin 擴增片段；M 為 maker；1、2 為任選樣
2.1.2 蛋白質印跡實驗結果 GLUR5/actin 灰度值：臨床病例組顳葉組織為 2.172±0.063，臨床對照組為 2.142±0.060，差異無統計學意義（P>0.05）；臨床病例組海馬組織為 2.548±0.509，臨床對照組為 1.584±0.415，差異有統計學意義（P<0.05）。目的蛋白條帶結果顯示 GLUR5 蛋白表達臨床病例組顳葉組織與臨床對照組比較差異無統計學意義（P>0.05）；而在海馬組織中的表達明顯高于臨床對照組，差異有統計學意義（P<0.05）。見圖 4。
圖4
兩組患者顳葉、海馬組織中 GLUR5 的蛋白表達
a. 顳葉組織，1～3 為臨床病例組，4～6 為臨床對照組；b. 海馬組織，1～4 為臨床病例組，5～7 為臨床對照組
2.2 動物實驗結果
蛋白質印跡實驗結果：動物實驗組海馬組織 GLUR5/actin 灰度值為 1.007±0.034，動物對照組為 1.001±0.032，差異無統計學意義（P>0.05）。動物實驗組顳葉組織 GLUR5/actin 灰度值為 0.763±0.026，動物對照組為 0.742±0.034，差異無統計學意義（P>0.05）。目的蛋白條帶結果顯示 GLUR5 蛋白表達動物實驗組海馬及顳葉組織與動物對照組差異均無統計學意義（P>0.05）。見圖 5。
圖5
兩組動物海馬、顳葉組織中 GLUR5 的蛋白表達
a. 海馬組織；b. 顳葉組織；1～3 為動物實驗組，4～6 為動物對照組
3 討論
3.1 GLUR5 在難治性顳葉癲癇中的作用
國外研究發現 KAR 在癲癇發病中的主要功能是促進興奮性突觸傳遞，影響 γ-氨基丁酸（gamma aminobutyric acid，GABA）能中間神經元的活性，整合突觸內電流，突觸重組，參與誘導興奮性中毒作用[9-10]。GLUR5 是 KAR 中主要的也是研究最廣泛的亞基，在突觸傳遞和突觸重組中有重要作用[11]。動物實驗發現托吡酯（商品名：妥泰）不僅可選擇性阻滯大鼠背外側的杏仁核神經元的 GLUR5 受體而降低興奮性突觸后電流波幅，也能提高 GLUR5 的激動劑三磷酸腺苷酶所誘發的陣攣性癲癇的閾值[12]。Smolders 等[13]在動物實驗和體外實驗均證實 GLUR5 特異性受體抑制劑 Y33337 可以阻止癲癇活動，他們認為這種作用可能是通過阻滯谷氨酸介導的神經興奮作用，增加 GABA 介導的抑制作用實現的。這些研究均支持 GLUR5 受體是癲癇活動的關鍵興奮性環節的假說。GLUR5 對突觸內電流的影響及其在突觸傳遞中的具體作用機制尚需進一步深入研究。
3.2 GLUR5 在難治性顳葉癲癇患者海馬及顳葉中的表達
Mathern 等[14]曾用原位雜交的方法探討顳葉癲癇患者術后海馬組織中 GLUR5-7 的 mRNA 表達水平，但該研究的主要缺點是使用尸體解剖后的海馬組織作為對照組，很可能因海馬組織難以耐受缺氧而導致 mRNA 總體水平下降，因而其研究結果可信度不高，該研究也未檢測 KAR 的蛋白質表達水平。GLUR5 在人類難治性顳葉癲癇中是否被激活并不清楚，國內外少有臨床研究涉及。因此，我們檢測難治性顳葉癲癇患者顳葉皮質和海馬組織中 GLUR5 的 mRNA 和蛋白質水平，了解 GLUR5 在人難治性顳葉癲癇腦組織中的表達情況，探討其與難治性顳葉癲癇的關系。我們的研究在符合人體試驗倫理要求的前提下采用活體組織作為對照，通過熒光定量 PCR 和蛋白質印跡法檢測難治性顳葉癲癇患者術后顳葉組織和海馬組織，結果發現 GLUR5 的 mRNA 水平和蛋白質表達水平在海馬組織中異常升高，而顳葉皮質中 GLUR5 的表達水平與對照組相比差異無統計學意義，與 DeFelipe 等[15]的研究結果一致，提示盡管顳葉皮質也是難治性顳葉癲癇的病灶部位，但 GLUR5 的主要作用部位不在顳葉皮質，而是在顳葉癲癇的核心病變部位海馬。海馬一直是研究 GLUR5 的優勢部位，我們的研究結果進一步證實 GLUR5 在人難治性顳葉癲癇中仍然是通過作用于海馬參與難治性顳葉癲癇疾病發生機制。
3.3 GLUR5 在馬桑內酯誘導的恒河猴癲癇模型中的表達
GLUR5 的異常表達是否也存在于非難治性癲癇并不清楚，在無法得到非難治性癲癇患者標本的情況下，我們選擇在種屬上與人類更接近，病理檢查證實海馬有病理改變，皮質電極也證實癇波來自顳葉海馬的馬桑內酯誘導的恒河猴癲癇模型作為研究對象，經過 3 個月反復誘導癲癇發作后處死，在其海馬中進一步檢測 GLUR5 和 GLUR6 蛋白質水平，結果發現恒河猴癲癇模型的海馬中 GLUR5 蛋白質水平與對照組的差異無統計學意義。這一研究結果可能提示并非所有來源于顳葉的癲癇活動都與 GLUR 作用有關。我們的研究結果與 KA 誘導的癲癇大鼠模型實驗結果存在差異。Ullal 等[16]研究發現在 KA 刺激后 72 h 和 180 d 后的大鼠海馬中的 GLUR5 均持續升高。經馬桑內酯誘導的癲癇模型致癇機制可能通過激活 L2 型鈣離子通道和 N2 甲基 2D2 天冬氨酸受體介導的鈣離子通道引起神經細胞內鈣離子濃度升高抑制 GABA 功能，而引起癲癇發作[17]。在我們的研究中馬桑內酯癲癇模型誘導過程僅 3 個月，目的在于建立非難治性癲癇模型；并且在恒河猴癲癇模型海馬的病理結果中僅發現神經元的變性，而神經纖維染色并未發現苔蘚纖維軸突出芽現象。而在難治性顳葉癲癇患者海馬中觀察到神經元丟失、壞死，苔蘚纖維出芽現象。因此馬桑內酯誘導的恒河猴癲癇模型海馬中的 GLUR5 蛋白質水平與對照組比較差異無統計學意義，可能支持 GLUR5 的異常表達主要參與難治性癲癇的發生，也或許與種屬差異或誘導劑有關。而 GLUR5 是否也參與其他慢性非難治性癲癇的發生，需進一步研究來證實。
與癲癇相關的 KAR 受體研究已經進入了分子水平，但仍有很多需要進一步探索的領域。如探討研究 KAR 與難治性顳葉癲癇發生的因果關系，是因為 KAR 的表達異常導致癲癇的發生，還是因為癲癇發生后引起 KAR 的異常表達增高，導致難治性癲癇發生還不清楚。其次，GLUR5 在難治性癲癇患者中高表達說明其可能參與人難治性癲癇的發病機制，托吡酯是目前唯一可以阻滯 GLUR5 受體的抗癲癇藥物，但是研究發現 GLUR5 拮抗劑對預防和阻止邊緣葉所致的癲癇發作無明顯效果。托吡酯具有阻滯鈉離子通道，增加 GABA 介導的抑制作用和阻滯谷氨酸介導的神經興奮作用，影響氯離子膜運轉及鈣離子通道阻滯的多重作用機制，其可能不只是通過選擇性作用于 GLUR5 受體而發揮抗癲癇的藥物作用。應進一步明確 GLUR5 與人難治性顳葉癲癇中的致病關系及其在難治性顳葉癲癇中的病理機制，為研發新的抗癲癇藥物提供可能的理論依據。
藥物難治性癲癇是指經過 3 種及以上一線抗癲癇藥物正規治療 2 年以上，發作頻率>2 次/月的原發性癲癇。藥物難治性癲癇占癲癇患者的 20%～40%，其中以顳葉癲癇最為常見[1]。長期以來，人們一直在探索顳葉癲癇的病因、病變特點及其發病機制，并努力尋找治療的有效措施。近年在癲癇發病機制相關神經遞質受體的研究中，從屬于谷氨酸受體（glutamic receptor，GLUR）的紅藻氨酸受體（kainate receptors，KAR）家族越來越受到關注，紅藻氨酸（kainate，KA）是從一種海藻中天然提取的興奮性氨基酸——谷氨酸的結構類似物，通過 KA 誘導的癲癇動物模型中發現，KA 在顳葉癲癇中誘導癇樣發作和產生神經病理性損害，表明 KA 是一種強效的神經毒素[2-3]。KA 誘導的癲癇模型的特點是具有典型的顳葉癲癇的共同特征：對大部分抗癲癇藥物耐藥；與人類顳葉癲癇有相似的癲癇發作行為特點；神經病理學上特異的海馬損傷與顳葉癲癇的海馬硬化有關[3]。分子克隆發現 KA 與離子型 GLUR 存在高親和性[4-5]。在 KA 誘導的顳葉癲癇模型中很早就發現 KAR 是 GLUR 中的一個獨立受體家族[6]。通過 KAR 亞基克隆明確發現 KAR 家族由 5 種受體亞基組成，包括 GLUR5、GLUR6、GLUR7、KA1 和 KA2；KAR 在中樞神經系統中廣泛分布，皮質的椎體細胞樹突棘的突觸后密度是主要分布部位，而膠質細胞少見分布[7]。目前對難治性顳葉癲癇發病機制的研究主要來源于嚙齒類鼠模型或體外細胞實驗，但是對人藥物難治性癲癇研究甚少。因此，本研究通過測定 GLUR5 在人難治性顳葉癲癇和馬桑內酯誘導的恒河猴癲癇模型腦組織（海馬和顳葉）中的蛋白表達水平，探討 GLUR5 與人難治性癲癇的發病關系，為癲癇的病因學研究和臨床治療提供可能的理論依據。現報告如下。
1 材料與方法
1.1 研究對象
1.1.1 臨床資料部分 本研究經過我院倫理委員會批準。選取 2007 年 1 月—2015 年 12 月在四川大學華西醫院行手術治療的 54 例藥物難治性顳葉癲癇患者作為臨床病例組。納入標準：① 年齡≥14 歲；② 有復雜部分性發作或復雜部分性發作繼發全身性發作的顳葉癲癇典型臨床表現和腦電圖特征，經正規服用 3 種或 3 種以上一線抗癲癇藥物有效劑量治療 2 年以上，發作頻率>2 次/月；③ 患者術前經視頻腦電圖或術前放置硬膜下皮質電極監測，并結合 CT 或 MRI（MRS）定位致癇灶；④ 患者嚴格進行術前評估，確定適合手術后并于術中用皮質電極監測；⑤ 患者及其家屬術前簽署知情同意書。54 例患者中，男 34 例，女 20 例；年齡 15～45 歲，平均（23.87±6.32）歲；病程 2～24 年，平均（9.93±6.95）年；術前癲癇發作頻數為 4～58 次/月，平均（15.25±14.40）次/月；癲癇發作類型為復雜部分性發作或繼發全身性發作；抗癲癇藥物使用：3 種 41 例，3 種以上 13 例；MRI 或 CT 檢查：海馬硬化 33 例，顳葉內側占位病變 9 例，正常 12 例；視頻腦電圖檢查：癇波發放 54 例；手術切除部位：海馬 31 例，顳葉+海馬 23 例；病理檢查：異常改變 52 例，正常 2 例。
選取 2007 年 1 月—2015 年 12 月在四川大學華西醫院收治的 43 例因外傷、腫瘤或大面積腦出血并發腦疝行去顳葉皮質減壓手術的患者作為臨床對照組。納入標準：① 年齡≥14 歲；② 無癲癇發作史；③ 病理切片證實腦組織結構基本正常；④ 取材部位為顳葉或海馬；⑤ 患者家屬同意，并簽署知情同意書。43 例患者中，男 28 例，女 15 例；年齡 19～57 歲，平均（37.75±12.56）歲；病因：腦外傷 27 例，膠質細胞瘤 5 例，大面積腦出血并腦疝 11 例；手術切除部位：顳葉 27 例，海馬 16 例；病理檢查：異常改變 3 例，正常 40 例。
1.1.2 動物實驗部分 選取 6 只健康成年恒河猴，均為雄性，平均年齡 35.5 個月，體質量 5.1～6.2 kg，由四川大學實驗動物中心提供。用隨機數字表法將恒河猴分為動物實驗組和動物對照組，每組各 3 只。
1.2 研究方法
1.2.1 動物癲癇模型的建立 對動物實驗組恒河猴采用肌肉注射馬桑內酯（5 mg/mL，成都中醫藥大學提取），按 0.6 mL/kg 肌肉注射，每 72 小時注射 1 次，每天觀察恒河猴情況，并根據恒河猴每次對馬桑內酯的反應調整用藥，以達到癇樣發作的最小劑量為準，造模成功的動物實驗組恒河猴均有自發性癲癇發作，且符合顳葉癲癇的表現。頭皮電極和深部電極顯示癇波來自顳區和海馬。動物對照組給予相應劑量的生理鹽水肌肉注射。動物實驗組和動物對照組的飼養時間均為 90 d。若發生癲癇持續狀態則給予地西泮 1 mg/kg 肌肉注射以終止癲癇發作，降低其死亡率。動物實驗組 3 只恒河猴均未發生癲癇持續狀態，均成活。
1.2.2 樣本收集 ① 臨床患者標本：術中獲取標本后立即放入已編號并用焦炭酸二乙酯液浸泡 24 h 以上的細胞凍存管，置于液氮中冷凍保存。同時切取細條狀顳葉皮質組織和海馬組織放入丙二酮中固定。② 動物實驗標本：兩組恒河猴均給予氯胺酮深度麻醉后開顱切取其海馬及顳葉組織，其他處理同臨床患者標本。
1.2.3 熒光定量聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR） ① RNA 制備及質量檢測：細胞總信使 RNA（messenger RNA，mRNA）采用 Unlzol 試劑盒，提取的總 RNA 沉淀在加入了無 RNA 酶的 Mikki-Q 水完全溶解后，–80℃ 冰箱保存。② 熒光定量 PCR：紫外分光光度儀、電泳實驗進行質量檢測。檢測合格后采用 mRNA 柱純化試劑盒（Boistar 公司）純化個體樣品的mRNA，逆轉錄生成互補 DNA。分別取 5 μg mRNA 為逆轉錄模板。
根據熒光定量逆轉錄 PCR 引物設計原則，采用 Primer Express 1.5 軟件（美國 Invitrogen 公司）設計引物：GLUR5 上游引物為 5’-GAAGACAGCACAGGTCTAAT-3’，下游引物為 5’-CAATCAAATATCACATAGAACT- 3’，Taqman 探針為 5’-CTCATCAAAGCTCCCTCCAGA-3’。Beta-actin 為內參基因，上游引物為 5’-tgggtgtgaa ccacgagaa-3’，下游引物為 5’-ggcatggactgtggtcatga-3’，Taqman 探針為5’-ctgcaccaccaactgcttagc-3’。
反應體系置于 FTC2000 PCR 儀（加拿大 Funglyn 公司）進行 PCR。樣品按下列條件擴增：94℃ 2 min；94℃ 20 s；55℃ 30 s；60℃ 40 s，45 個循環，每個樣品重復檢測 3 次。PCR 反應產物任取 2 個樣本 1.5% 瓊脂糖凝膠電泳，觀察擴增片段。測定各個樣品的循環閾值（cycle threshold，CT），即每個反應管內的熒光信號達到設定的閾值時所經歷的循環數。使用 Rest 軟件進行 CT 值的相對定量分析，并計算各樣品中 GLUR5 的 mRNA 表達比值（expression ratios），即R 值[8]。
1.2.4 蛋白質印跡實驗 各組的每個腦組織樣本均稱取 100 mg，勻漿后離心，取少量上清液行二辛可寧酸蛋白定量，調整濃度為 2 μg/μL。第 1 泳道 maker 上樣 10 μL，其余泳道上樣 30 μL。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，恒定電壓 160 V 進行電泳。電轉移至聚偏氟乙烯膜（美國 Dupont 公司），300 V、300 mA 恒壓轉移 1 h。聚偏氟乙烯膜用磷酸鹽緩沖液洗滌后入含 3% 牛血清白蛋白的 pH 值 7.2 的磷酸鹽緩沖液封閉 1 h。
加入一抗兔抗人 GLUR5 抗體（#22053，美國 MilliPORE 公司，）4℃ 過夜，一抗稀釋比例為 1∶1 000。選擇辣根過氧化物標記的二抗 PIERCE，1∶1 000 稀釋，室溫下反應 1 h。辣根過氧化物-電化學發光法將 X 線片曝光，顯影，定影。圖像分析采用 LabworksTM 掃描分析軟件計算灰度值。
1.3 統計學方法
采用 SPSS 13.0 軟件行統計分析。計量數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析及t 檢驗。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 臨床病例與對照結果
2.1.1 熒光定量 PCR 結果 臨床病例組與臨床對照組顳葉組織的 GLUR5 mRNA 表達的R 值為 0.262，差異無統計學意義（P>0.05）；海馬組織的 GLUR5 mRNA 表達R 值為 4.896，差異有統計學意義（P<0.05）。GLUR5 擴增曲線顯示臨床病例組較臨床對照組海馬組織中 GLUR5 mRNA 水平向上調節；擴增曲線顯示臨床病例組與臨床對照組顳葉組織中 GLUR5 mRNA 水平無明顯變化。GLUR5 PCR 擴增產物電泳圖顯示擴增片段為 161 bp。見圖 1～3。
圖1
臨床病例組與臨床對照組海馬組織的 GLUR5 擴增曲線圖
C：臨床對照組；E：臨床病例組
圖2
臨床病例組與臨床對照組顳葉組織的 GLUR5 擴增曲線圖
C：臨床對照組；E：臨床病例組
圖3
GLUR5 PCR 擴增產物電泳圖
a. 難治性顳葉癲癇患者海馬組織擴增產物電泳圖；b. actin 擴增片段；M 為 maker；1、2 為任選樣
2.1.2 蛋白質印跡實驗結果 GLUR5/actin 灰度值：臨床病例組顳葉組織為 2.172±0.063，臨床對照組為 2.142±0.060，差異無統計學意義（P>0.05）；臨床病例組海馬組織為 2.548±0.509，臨床對照組為 1.584±0.415，差異有統計學意義（P<0.05）。目的蛋白條帶結果顯示 GLUR5 蛋白表達臨床病例組顳葉組織與臨床對照組比較差異無統計學意義（P>0.05）；而在海馬組織中的表達明顯高于臨床對照組，差異有統計學意義（P<0.05）。見圖 4。
圖4
兩組患者顳葉、海馬組織中 GLUR5 的蛋白表達
a. 顳葉組織，1～3 為臨床病例組，4～6 為臨床對照組；b. 海馬組織，1～4 為臨床病例組，5～7 為臨床對照組
2.2 動物實驗結果
蛋白質印跡實驗結果：動物實驗組海馬組織 GLUR5/actin 灰度值為 1.007±0.034，動物對照組為 1.001±0.032，差異無統計學意義（P>0.05）。動物實驗組顳葉組織 GLUR5/actin 灰度值為 0.763±0.026，動物對照組為 0.742±0.034，差異無統計學意義（P>0.05）。目的蛋白條帶結果顯示 GLUR5 蛋白表達動物實驗組海馬及顳葉組織與動物對照組差異均無統計學意義（P>0.05）。見圖 5。
圖5
兩組動物海馬、顳葉組織中 GLUR5 的蛋白表達
a. 海馬組織；b. 顳葉組織；1～3 為動物實驗組，4～6 為動物對照組
3 討論
3.1 GLUR5 在難治性顳葉癲癇中的作用
國外研究發現 KAR 在癲癇發病中的主要功能是促進興奮性突觸傳遞，影響 γ-氨基丁酸（gamma aminobutyric acid，GABA）能中間神經元的活性，整合突觸內電流，突觸重組，參與誘導興奮性中毒作用[9-10]。GLUR5 是 KAR 中主要的也是研究最廣泛的亞基，在突觸傳遞和突觸重組中有重要作用[11]。動物實驗發現托吡酯（商品名：妥泰）不僅可選擇性阻滯大鼠背外側的杏仁核神經元的 GLUR5 受體而降低興奮性突觸后電流波幅，也能提高 GLUR5 的激動劑三磷酸腺苷酶所誘發的陣攣性癲癇的閾值[12]。Smolders 等[13]在動物實驗和體外實驗均證實 GLUR5 特異性受體抑制劑 Y33337 可以阻止癲癇活動，他們認為這種作用可能是通過阻滯谷氨酸介導的神經興奮作用，增加 GABA 介導的抑制作用實現的。這些研究均支持 GLUR5 受體是癲癇活動的關鍵興奮性環節的假說。GLUR5 對突觸內電流的影響及其在突觸傳遞中的具體作用機制尚需進一步深入研究。
3.2 GLUR5 在難治性顳葉癲癇患者海馬及顳葉中的表達
Mathern 等[14]曾用原位雜交的方法探討顳葉癲癇患者術后海馬組織中 GLUR5-7 的 mRNA 表達水平，但該研究的主要缺點是使用尸體解剖后的海馬組織作為對照組，很可能因海馬組織難以耐受缺氧而導致 mRNA 總體水平下降，因而其研究結果可信度不高，該研究也未檢測 KAR 的蛋白質表達水平。GLUR5 在人類難治性顳葉癲癇中是否被激活并不清楚，國內外少有臨床研究涉及。因此，我們檢測難治性顳葉癲癇患者顳葉皮質和海馬組織中 GLUR5 的 mRNA 和蛋白質水平，了解 GLUR5 在人難治性顳葉癲癇腦組織中的表達情況，探討其與難治性顳葉癲癇的關系。我們的研究在符合人體試驗倫理要求的前提下采用活體組織作為對照，通過熒光定量 PCR 和蛋白質印跡法檢測難治性顳葉癲癇患者術后顳葉組織和海馬組織，結果發現 GLUR5 的 mRNA 水平和蛋白質表達水平在海馬組織中異常升高，而顳葉皮質中 GLUR5 的表達水平與對照組相比差異無統計學意義，與 DeFelipe 等[15]的研究結果一致，提示盡管顳葉皮質也是難治性顳葉癲癇的病灶部位，但 GLUR5 的主要作用部位不在顳葉皮質，而是在顳葉癲癇的核心病變部位海馬。海馬一直是研究 GLUR5 的優勢部位，我們的研究結果進一步證實 GLUR5 在人難治性顳葉癲癇中仍然是通過作用于海馬參與難治性顳葉癲癇疾病發生機制。
3.3 GLUR5 在馬桑內酯誘導的恒河猴癲癇模型中的表達
GLUR5 的異常表達是否也存在于非難治性癲癇并不清楚，在無法得到非難治性癲癇患者標本的情況下，我們選擇在種屬上與人類更接近，病理檢查證實海馬有病理改變，皮質電極也證實癇波來自顳葉海馬的馬桑內酯誘導的恒河猴癲癇模型作為研究對象，經過 3 個月反復誘導癲癇發作后處死，在其海馬中進一步檢測 GLUR5 和 GLUR6 蛋白質水平，結果發現恒河猴癲癇模型的海馬中 GLUR5 蛋白質水平與對照組的差異無統計學意義。這一研究結果可能提示并非所有來源于顳葉的癲癇活動都與 GLUR 作用有關。我們的研究結果與 KA 誘導的癲癇大鼠模型實驗結果存在差異。Ullal 等[16]研究發現在 KA 刺激后 72 h 和 180 d 后的大鼠海馬中的 GLUR5 均持續升高。經馬桑內酯誘導的癲癇模型致癇機制可能通過激活 L2 型鈣離子通道和 N2 甲基 2D2 天冬氨酸受體介導的鈣離子通道引起神經細胞內鈣離子濃度升高抑制 GABA 功能，而引起癲癇發作[17]。在我們的研究中馬桑內酯癲癇模型誘導過程僅 3 個月，目的在于建立非難治性癲癇模型；并且在恒河猴癲癇模型海馬的病理結果中僅發現神經元的變性，而神經纖維染色并未發現苔蘚纖維軸突出芽現象。而在難治性顳葉癲癇患者海馬中觀察到神經元丟失、壞死，苔蘚纖維出芽現象。因此馬桑內酯誘導的恒河猴癲癇模型海馬中的 GLUR5 蛋白質水平與對照組比較差異無統計學意義，可能支持 GLUR5 的異常表達主要參與難治性癲癇的發生，也或許與種屬差異或誘導劑有關。而 GLUR5 是否也參與其他慢性非難治性癲癇的發生，需進一步研究來證實。
與癲癇相關的 KAR 受體研究已經進入了分子水平，但仍有很多需要進一步探索的領域。如探討研究 KAR 與難治性顳葉癲癇發生的因果關系，是因為 KAR 的表達異常導致癲癇的發生，還是因為癲癇發生后引起 KAR 的異常表達增高，導致難治性癲癇發生還不清楚。其次，GLUR5 在難治性癲癇患者中高表達說明其可能參與人難治性癲癇的發病機制，托吡酯是目前唯一可以阻滯 GLUR5 受體的抗癲癇藥物，但是研究發現 GLUR5 拮抗劑對預防和阻止邊緣葉所致的癲癇發作無明顯效果。托吡酯具有阻滯鈉離子通道，增加 GABA 介導的抑制作用和阻滯谷氨酸介導的神經興奮作用，影響氯離子膜運轉及鈣離子通道阻滯的多重作用機制，其可能不只是通過選擇性作用于 GLUR5 受體而發揮抗癲癇的藥物作用。應進一步明確 GLUR5 與人難治性顳葉癲癇中的致病關系及其在難治性顳葉癲癇中的病理機制，為研發新的抗癲癇藥物提供可能的理論依據。
