引用本文： 丁春曉, 劉小虎, 齊越, 喬菊久, 李建華. 癲癇模型大鼠海馬齒狀回神經元凋亡及凋亡誘導因子與胱天蛋白酶 3 聯合表達的意義. 華西醫學, 2017, 32(4): 550-553. doi: 10.7507/1002-0179.201604034 復制
癲癇是腦部神經元異常放電所致的發作性運動、感覺、意識、精神及植物神經功能異常，并常伴有發作期間的學習記憶障礙的一類中樞神經系統臨床綜合征[1]。癲癇的臨床診斷主要依靠其典型的癥狀及腦電圖記錄到的異常電波[2]。依據國際抗癲癇聯合會分類，目前癲癇分為局灶性癲癇和全身性癲癇 2 類，而癲癇的發作則被分為全面性發作、部分性發作、難以分類的發作及特殊類型的發作等類型。癲癇致大腦神經元細胞的損傷，主要包括壞死和凋亡 2 種基本方式[3]。細胞凋亡的機制十分復雜，胱天蛋白酶（Caspase）-3 是凋亡關鍵執行者，其參與的凋亡過程是依賴 Caspase 的凋亡途徑，而凋亡誘導因子（apoptosis-inducing factor，AIF）介導的是不依賴 Caspase 的凋亡途徑。癲癇不僅致大腦神經元損傷的機制復雜，治療上也有一定難度，有研究顯示約有 30% 患者對傳統的一線抗癲癇藥產生耐藥[4]。因此，本研究旨在通過戊四氮建立大鼠癲癇模型，應用尼氏染色觀察大鼠齒狀回的神經元損傷情況，同時應用免疫組織化學（組化）染色技術檢測 Caspase-3、AIF 表達情況，判斷二者與細胞凋亡的關系，進一步揭示癲癇所致神經元凋亡的機制，為癲癇的治療提供新思路。現報告如下。
1 材料與方法
1.1 實驗動物
Wistar 大鼠 12 只，雌雄各半，體質量 180～200 g，均為無特定病原體動物級別，由遼寧長生生物技術有限公司提供，許可證號：SCXK（遼）2010-0001。
1.2 藥品與試劑
戊四氮：美國 Sigma 公司生產，批號：SLBF5034V。水合氯醛：北京市旭東化工廠生產，批號：20000530。多聚甲醛：國藥集團化學試劑有限公司生產，批號：F20091203。甲苯胺藍：北京索萊寶科技有限公司生產，批號：528A027。Caspase-3：武漢博士德生物工程有限公司生產，批號：BA111。AIF：武漢博士德生物工程有限公司生產，批號：83410P365。二氨基聯苯胺（3，3’-diaminobenzidine，DAB）顯色試劑盒：福建邁新生物技術開發有限公司生產，批號：1403030031。TMS-P 超敏試劑盒：福建邁新生物技術開發有限公司生產，批號：1312029706。無水乙醇：沈陽市新化試劑廠生產，批號 20140428。二甲苯：沈陽市新化試劑廠生產，批號：20140106。枸櫞酸：國藥集團化學試劑有限公司生產，批號：20130307。枸櫞酸鈉：國藥集團化學試劑有限公司生產，批號：20121009。磷酸二氫鈉：沈陽試劑三廠生產，批號：0601。磷酸氫二鉀：沈陽試劑一廠生產，批號：850901。氯化鈉：國藥集團化學試劑有限公司生產，批號：20130909。
1.3 儀器
光電顯微鏡：奧林巴斯中國有限公司生產，BX53 型。電熱恒溫培養箱：廈門醫療電子儀器廠生產，JKDP2 型。烤片機：陽光神琦醫用科技有限公司生產，YG-280 型。
1.4 方法
1.4.1 癲癇模型的建立及腦標本制備 將 12 只 Wistar 大鼠按體質量獲得原始編號，再按隨機數字表隨機分成空白對照組和模型組，每組 6 只。模型組大鼠腹腔注射 1% 戊四氮（64 mg/kg），空白對照組腹腔注射等體積生理鹽水。給藥后記錄癲癇發作情況，給藥數分鐘后，模型鼠全部出現癲癇發作，主要表現為肢體抽搐、濕狗樣擺動、姿勢失衡等，甚至表現為全身強直、尾巴僵硬、四肢抽搐、呼吸急促及口吐白沫等，造模成功。于給藥 24 h 后給予模型組大鼠 10% 水合氯醛（100 mg/kg）深度麻醉，仰臥固定于解剖板上，在劍突下開胸，暴露心臟，用輸液針從心尖部插入左心室，在右心耳處剪口放血，先用 200 mL 生理鹽水快速灌注，然后減慢灌注速度直到從右心耳處流出無色液體，接著用溶于 0.1 mol/L 的磷酸緩沖鹽液的 4% 多聚甲醛（pH 值 7.4）約 150 mL 繼續灌注固定。灌注完后斷頭取腦，然后放入 4% 多聚甲醛，4℃ 固定 72 h[5-6]。將組織塊脫水至蠟 23 h，然后石蠟包埋，在石蠟切片機上連續冠狀切片，厚度 5 μm，切片放入 40℃ 的蒸餾水中展開，然后用涂布 10% 多聚賴氨酸的清潔載玻片撈出，晾干后 46℃ 烘烤 2 h 備用。
1.4.2 尼氏染色方法 常規脫蠟至水后將切片浸入 1% 甲苯胺藍溶液染色 6 min，蒸餾水浸 5 min 去除浮色，依次放入 70% 乙醇 2 min，95% 乙醇 5 min，100% 乙醇浸泡 3 min；然后用透明劑（二甲苯）透明 2 次，5 min/次，中性樹膠封片[7-9]。每只大鼠隨機選擇 2 張經尼氏染色的大腦切片進行觀察[10]。將切片置于 200 倍顯微鏡下觀察各組大鼠海馬 CA1 區神經細胞尼氏小體的染色情況，同時于 400 倍鏡下對各組大鼠腦片海馬 CA1 相同部位進行神經元計數。
1.4.3 免疫組化染色 采用鏈霉菌抗生物素-過氧化物酶（streptavidin-peroxidase，SP）法，石蠟切片嚴格按照 DAB 試劑盒說明書操作進行免疫組化染色[11-14]，觀察海馬齒狀回的病理變化，并使用 ImageJ 軟件對經免疫組化染色的大腦切片海馬齒狀回 200 倍放大圖片進行灰度值分析。
1.5 統計學方法
采用 SPSS 17.0 統計軟件對試驗結果進行分析處理。計量資料采用均數±標準差表示，組間比較用t 檢驗。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 致癇大鼠海馬齒狀回神經元凋亡損傷情況
空白對照組大鼠海馬齒狀回的病理鏡下特點為組織結構及細胞結構清晰，椎體細胞排列整齊、極向良好，細胞結構完整，細胞核形規則，核仁清晰，細胞質內可見豐富的尼氏小體；而癲癇造模后大鼠海馬齒狀回神經元丟失，數目減少，細胞排列疏松，部分殘存神經元胞體皺縮，核固縮，細胞質內尼氏小體減少。空白對照組與模型組神經元損傷情況對比明顯，組間比較差異有統計學意義（P<0.05）。見表 1、圖 1。
圖1
兩組大鼠齒狀回尼氏染色圖片（Nissl ×200） 1a. 空白對照組；1b. 模型組 圖 2 兩組大鼠齒狀回 AIF 免疫組化染色圖片（SP ×400） 2a. 空白對照組；2b. 模型組 圖 3 兩組大鼠齒狀回 Caspase-3 免疫組化染色圖片（SP ×400） 3a. 空白對照組；3b. 模型組
表1
大鼠海馬齒狀回神經細胞計數及神經元凋亡損傷免疫組化染色結果（
n=6，
）
2.2 致癇大鼠海馬齒狀回 Caspase-3 及 AIF 蛋白免疫組織化學染色結果
致癇大鼠海馬齒狀回 Caspase-3 及 AIF 蛋白陽性表達較空白對照組明顯，在免疫組化病理切片的灰度值比較中，模型組與空白對照組比較差異有統計學意義（P<0.05）。見表 1 及圖 2、3。
圖2
兩組大鼠齒狀回 AIF 免疫組化染色圖片（SP ×400） a. 空白對照組；b. 模型組
圖3
兩組大鼠齒狀回 Caspase-3 免疫組化染色圖片（SP ×400） a. 空白對照組；b. 模型組
3 討論
癲癇是由已知或未知的多種原因引起的發作性、突然性、短暫性腦功能失常性疾病。戊四氮致癇的動物模型能產生與人類極其相似的生物學行為及神經病理改變，且戊四氮本身無特殊的神經毒性作用，致癇但不伴有神經元壞死，因此如果致癇動物出現神經元損傷，可明確判斷是癲癇發作本身所致[15]。癲癇的發作導致腦神經元的損傷，在我們的實驗過程中，通過觀察神經元尼氏小體的變化來衡量。尼氏小體又稱虎斑小體，是神經元胞體細胞質的特征性結構之一，為嗜堿性物質，光學顯微鏡下其呈斑塊狀或細顆粒狀散在均勻分布，電子顯微鏡下，尼氏小體由大量平行的粗面內質網和其間的游離核糖體組成。當神經元損傷時，尼氏小體溶解消失，尼氏染色是德國病理學家 Nissl 于 1982 年創立的，該染色方法尼氏小體清晰可辨，核、核仁也非常清晰，能直觀反映尼氏小體的損傷情況，進而反映神經元的損傷情況。本研究采用尼氏染色方法，通過對比空白對照組及模型組的尼氏小體的存在情況，進而評估神經元的損傷，發現兩組之間存在明顯差異，進一步論證了癲癇導致神經元損傷這一觀點。
神經元損傷主要有壞死及凋亡 2 種基本方式，而細胞凋亡是癲癇引起神經元損傷后神經元丟失的重要形式。神經元損傷后，引起膠質細胞的增生、苔蘚纖維出芽、突觸重建等腦結構和功能的可塑性變化，而大腦的這些可塑性變化在形態上又使得癲癇更加反復發作，這也是癲癇頻發和難治的主要原因之一[3]。因此，研究癲癇的關鍵，即為研究癲癇導致神經元凋亡這一環節，這一點，已引起人們的廣泛關注。
在引起神經元凋亡這一過程中，Caspase 家族是導致細胞凋亡的主要蛋白酶系統，它可以特異性地切開天冬氨酸與半胱氨酸形成的肽鍵，主要是結構域之間的位點，是細胞死亡或凋亡的直接執行者，使處于級聯反應中心環節的某種蛋白失去活性或被降解，被稱為死亡蛋白酶，而 Caspase-3 又位于級聯反應的核心環節，它的激活被認為是神經元凋亡的標志。因為神經元的壞死是急性細胞裂解的過程，不存在 Caspase-3 的激活和之后染色質的階段性降解[16]。在癲癇病中，隨著神經的凋亡，Caspase-3 陽性表達增加，本實驗通過對免疫組化染色病理切片進行灰度值比對，模型組比空白對照組有明顯增強，驗證了 Caspase-3 參與了癲癇所致的神經元的凋亡過程。
Caspase-3 介導的是依賴 Caspase 的凋亡途徑，而 AIF 是第一個被發現的不依賴 Caspase 的凋亡因子，當受到某種凋亡信號刺激后，AIF 從線粒體釋放到胞質中，然后轉位到細胞核，促使染色質凝集及 DNA 的降解，引起不依賴 Caspase 的細胞凋亡過程。有研究表明釋放到細胞質之后的 AIF 可以使線粒體通透性改變，促進 AIF 再釋放，還可以使線粒體釋放更多的細胞色素 C，從而引起一系列 Caspase 級聯反應[17]。而激活的 Caspase 和 Caspase 激活的蛋白質 t-Bid 同樣能使純化的線粒體釋放 AIF。由此可見 Caspase 依賴和非 Caspase 依賴（AIF）兩種凋亡途徑同時存在，兩者之間有著錯綜復雜的關系并同時參與介導著凋亡過程。
綜上所述，本實驗通過尼氏染色，模型組相比對照組神經元數目明顯減少，驗證了癲癇導致神經元損傷這一觀點；通過對 Caspase-3 及 AIF 進行免疫組化染色，模型組相比對照組染色深度明顯加深，說明戊四氮致大鼠癲癇后，依賴 Caspase 的 Caspase-3 介導的凋亡途徑及非依賴 Caspase 的 AIF 介導的凋亡途徑，均存在于癲癇致神經細胞凋亡的過程中，二者作用孰重孰輕，還有待進一步研究。
癲癇是腦部神經元異常放電所致的發作性運動、感覺、意識、精神及植物神經功能異常，并常伴有發作期間的學習記憶障礙的一類中樞神經系統臨床綜合征[1]。癲癇的臨床診斷主要依靠其典型的癥狀及腦電圖記錄到的異常電波[2]。依據國際抗癲癇聯合會分類，目前癲癇分為局灶性癲癇和全身性癲癇 2 類，而癲癇的發作則被分為全面性發作、部分性發作、難以分類的發作及特殊類型的發作等類型。癲癇致大腦神經元細胞的損傷，主要包括壞死和凋亡 2 種基本方式[3]。細胞凋亡的機制十分復雜，胱天蛋白酶（Caspase）-3 是凋亡關鍵執行者，其參與的凋亡過程是依賴 Caspase 的凋亡途徑，而凋亡誘導因子（apoptosis-inducing factor，AIF）介導的是不依賴 Caspase 的凋亡途徑。癲癇不僅致大腦神經元損傷的機制復雜，治療上也有一定難度，有研究顯示約有 30% 患者對傳統的一線抗癲癇藥產生耐藥[4]。因此，本研究旨在通過戊四氮建立大鼠癲癇模型，應用尼氏染色觀察大鼠齒狀回的神經元損傷情況，同時應用免疫組織化學（組化）染色技術檢測 Caspase-3、AIF 表達情況，判斷二者與細胞凋亡的關系，進一步揭示癲癇所致神經元凋亡的機制，為癲癇的治療提供新思路。現報告如下。
1 材料與方法
1.1 實驗動物
Wistar 大鼠 12 只，雌雄各半，體質量 180～200 g，均為無特定病原體動物級別，由遼寧長生生物技術有限公司提供，許可證號：SCXK（遼）2010-0001。
1.2 藥品與試劑
戊四氮：美國 Sigma 公司生產，批號：SLBF5034V。水合氯醛：北京市旭東化工廠生產，批號：20000530。多聚甲醛：國藥集團化學試劑有限公司生產，批號：F20091203。甲苯胺藍：北京索萊寶科技有限公司生產，批號：528A027。Caspase-3：武漢博士德生物工程有限公司生產，批號：BA111。AIF：武漢博士德生物工程有限公司生產，批號：83410P365。二氨基聯苯胺（3，3’-diaminobenzidine，DAB）顯色試劑盒：福建邁新生物技術開發有限公司生產，批號：1403030031。TMS-P 超敏試劑盒：福建邁新生物技術開發有限公司生產，批號：1312029706。無水乙醇：沈陽市新化試劑廠生產，批號 20140428。二甲苯：沈陽市新化試劑廠生產，批號：20140106。枸櫞酸：國藥集團化學試劑有限公司生產，批號：20130307。枸櫞酸鈉：國藥集團化學試劑有限公司生產，批號：20121009。磷酸二氫鈉：沈陽試劑三廠生產，批號：0601。磷酸氫二鉀：沈陽試劑一廠生產，批號：850901。氯化鈉：國藥集團化學試劑有限公司生產，批號：20130909。
1.3 儀器
光電顯微鏡：奧林巴斯中國有限公司生產，BX53 型。電熱恒溫培養箱：廈門醫療電子儀器廠生產，JKDP2 型。烤片機：陽光神琦醫用科技有限公司生產，YG-280 型。
1.4 方法
1.4.1 癲癇模型的建立及腦標本制備 將 12 只 Wistar 大鼠按體質量獲得原始編號，再按隨機數字表隨機分成空白對照組和模型組，每組 6 只。模型組大鼠腹腔注射 1% 戊四氮（64 mg/kg），空白對照組腹腔注射等體積生理鹽水。給藥后記錄癲癇發作情況，給藥數分鐘后，模型鼠全部出現癲癇發作，主要表現為肢體抽搐、濕狗樣擺動、姿勢失衡等，甚至表現為全身強直、尾巴僵硬、四肢抽搐、呼吸急促及口吐白沫等，造模成功。于給藥 24 h 后給予模型組大鼠 10% 水合氯醛（100 mg/kg）深度麻醉，仰臥固定于解剖板上，在劍突下開胸，暴露心臟，用輸液針從心尖部插入左心室，在右心耳處剪口放血，先用 200 mL 生理鹽水快速灌注，然后減慢灌注速度直到從右心耳處流出無色液體，接著用溶于 0.1 mol/L 的磷酸緩沖鹽液的 4% 多聚甲醛（pH 值 7.4）約 150 mL 繼續灌注固定。灌注完后斷頭取腦，然后放入 4% 多聚甲醛，4℃ 固定 72 h[5-6]。將組織塊脫水至蠟 23 h，然后石蠟包埋，在石蠟切片機上連續冠狀切片，厚度 5 μm，切片放入 40℃ 的蒸餾水中展開，然后用涂布 10% 多聚賴氨酸的清潔載玻片撈出，晾干后 46℃ 烘烤 2 h 備用。
1.4.2 尼氏染色方法 常規脫蠟至水后將切片浸入 1% 甲苯胺藍溶液染色 6 min，蒸餾水浸 5 min 去除浮色，依次放入 70% 乙醇 2 min，95% 乙醇 5 min，100% 乙醇浸泡 3 min；然后用透明劑（二甲苯）透明 2 次，5 min/次，中性樹膠封片[7-9]。每只大鼠隨機選擇 2 張經尼氏染色的大腦切片進行觀察[10]。將切片置于 200 倍顯微鏡下觀察各組大鼠海馬 CA1 區神經細胞尼氏小體的染色情況，同時于 400 倍鏡下對各組大鼠腦片海馬 CA1 相同部位進行神經元計數。
1.4.3 免疫組化染色 采用鏈霉菌抗生物素-過氧化物酶（streptavidin-peroxidase，SP）法，石蠟切片嚴格按照 DAB 試劑盒說明書操作進行免疫組化染色[11-14]，觀察海馬齒狀回的病理變化，并使用 ImageJ 軟件對經免疫組化染色的大腦切片海馬齒狀回 200 倍放大圖片進行灰度值分析。
1.5 統計學方法
采用 SPSS 17.0 統計軟件對試驗結果進行分析處理。計量資料采用均數±標準差表示，組間比較用t 檢驗。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 致癇大鼠海馬齒狀回神經元凋亡損傷情況
空白對照組大鼠海馬齒狀回的病理鏡下特點為組織結構及細胞結構清晰，椎體細胞排列整齊、極向良好，細胞結構完整，細胞核形規則，核仁清晰，細胞質內可見豐富的尼氏小體；而癲癇造模后大鼠海馬齒狀回神經元丟失，數目減少，細胞排列疏松，部分殘存神經元胞體皺縮，核固縮，細胞質內尼氏小體減少。空白對照組與模型組神經元損傷情況對比明顯，組間比較差異有統計學意義（P<0.05）。見表 1、圖 1。
圖1
兩組大鼠齒狀回尼氏染色圖片（Nissl ×200） 1a. 空白對照組；1b. 模型組 圖 2 兩組大鼠齒狀回 AIF 免疫組化染色圖片（SP ×400） 2a. 空白對照組；2b. 模型組 圖 3 兩組大鼠齒狀回 Caspase-3 免疫組化染色圖片（SP ×400） 3a. 空白對照組；3b. 模型組
表1
大鼠海馬齒狀回神經細胞計數及神經元凋亡損傷免疫組化染色結果（
n=6，
）
2.2 致癇大鼠海馬齒狀回 Caspase-3 及 AIF 蛋白免疫組織化學染色結果
致癇大鼠海馬齒狀回 Caspase-3 及 AIF 蛋白陽性表達較空白對照組明顯，在免疫組化病理切片的灰度值比較中，模型組與空白對照組比較差異有統計學意義（P<0.05）。見表 1 及圖 2、3。
圖2
兩組大鼠齒狀回 AIF 免疫組化染色圖片（SP ×400） a. 空白對照組；b. 模型組
圖3
兩組大鼠齒狀回 Caspase-3 免疫組化染色圖片（SP ×400） a. 空白對照組；b. 模型組
3 討論
癲癇是由已知或未知的多種原因引起的發作性、突然性、短暫性腦功能失常性疾病。戊四氮致癇的動物模型能產生與人類極其相似的生物學行為及神經病理改變，且戊四氮本身無特殊的神經毒性作用，致癇但不伴有神經元壞死，因此如果致癇動物出現神經元損傷，可明確判斷是癲癇發作本身所致[15]。癲癇的發作導致腦神經元的損傷，在我們的實驗過程中，通過觀察神經元尼氏小體的變化來衡量。尼氏小體又稱虎斑小體，是神經元胞體細胞質的特征性結構之一，為嗜堿性物質，光學顯微鏡下其呈斑塊狀或細顆粒狀散在均勻分布，電子顯微鏡下，尼氏小體由大量平行的粗面內質網和其間的游離核糖體組成。當神經元損傷時，尼氏小體溶解消失，尼氏染色是德國病理學家 Nissl 于 1982 年創立的，該染色方法尼氏小體清晰可辨，核、核仁也非常清晰，能直觀反映尼氏小體的損傷情況，進而反映神經元的損傷情況。本研究采用尼氏染色方法，通過對比空白對照組及模型組的尼氏小體的存在情況，進而評估神經元的損傷，發現兩組之間存在明顯差異，進一步論證了癲癇導致神經元損傷這一觀點。
神經元損傷主要有壞死及凋亡 2 種基本方式，而細胞凋亡是癲癇引起神經元損傷后神經元丟失的重要形式。神經元損傷后，引起膠質細胞的增生、苔蘚纖維出芽、突觸重建等腦結構和功能的可塑性變化，而大腦的這些可塑性變化在形態上又使得癲癇更加反復發作，這也是癲癇頻發和難治的主要原因之一[3]。因此，研究癲癇的關鍵，即為研究癲癇導致神經元凋亡這一環節，這一點，已引起人們的廣泛關注。
在引起神經元凋亡這一過程中，Caspase 家族是導致細胞凋亡的主要蛋白酶系統，它可以特異性地切開天冬氨酸與半胱氨酸形成的肽鍵，主要是結構域之間的位點，是細胞死亡或凋亡的直接執行者，使處于級聯反應中心環節的某種蛋白失去活性或被降解，被稱為死亡蛋白酶，而 Caspase-3 又位于級聯反應的核心環節，它的激活被認為是神經元凋亡的標志。因為神經元的壞死是急性細胞裂解的過程，不存在 Caspase-3 的激活和之后染色質的階段性降解[16]。在癲癇病中，隨著神經的凋亡，Caspase-3 陽性表達增加，本實驗通過對免疫組化染色病理切片進行灰度值比對，模型組比空白對照組有明顯增強，驗證了 Caspase-3 參與了癲癇所致的神經元的凋亡過程。
Caspase-3 介導的是依賴 Caspase 的凋亡途徑，而 AIF 是第一個被發現的不依賴 Caspase 的凋亡因子，當受到某種凋亡信號刺激后，AIF 從線粒體釋放到胞質中，然后轉位到細胞核，促使染色質凝集及 DNA 的降解，引起不依賴 Caspase 的細胞凋亡過程。有研究表明釋放到細胞質之后的 AIF 可以使線粒體通透性改變，促進 AIF 再釋放，還可以使線粒體釋放更多的細胞色素 C，從而引起一系列 Caspase 級聯反應[17]。而激活的 Caspase 和 Caspase 激活的蛋白質 t-Bid 同樣能使純化的線粒體釋放 AIF。由此可見 Caspase 依賴和非 Caspase 依賴（AIF）兩種凋亡途徑同時存在，兩者之間有著錯綜復雜的關系并同時參與介導著凋亡過程。
綜上所述，本實驗通過尼氏染色，模型組相比對照組神經元數目明顯減少，驗證了癲癇導致神經元損傷這一觀點；通過對 Caspase-3 及 AIF 進行免疫組化染色，模型組相比對照組染色深度明顯加深，說明戊四氮致大鼠癲癇后，依賴 Caspase 的 Caspase-3 介導的凋亡途徑及非依賴 Caspase 的 AIF 介導的凋亡途徑，均存在于癲癇致神經細胞凋亡的過程中，二者作用孰重孰輕，還有待進一步研究。
