引用本文： 王穎, 肖雪, 李丹, 鐘春燕, 范翔, 李剛銳, 孟堯. 帶 His 標簽重組產朊假絲酵母尿酸酶的表達、純化與部分酶學性質研究. 華西醫學, 2018, 33(8): 989-993. doi: 10.7507/1002-0179.201604005 復制
在動物、植物、酵母、真菌和細菌中均發現有尿酸酶（urate oxidase，uricase；EC1.7.3.3）的存在，其作為一種廣泛存在的酶，可以分子氧作為受體催化尿酸氧化，參與生物體內嘌呤的代謝，將尿酸氧化分解為尿囊素、二氧化碳和過氧化氫。若人體內缺乏該酶，嘌呤代謝終產物尿酸及其鹽類在血液中難于溶解，就會引發高尿酸血癥，繼而誘發痛風、心血管病等疾病。血清尿酸水平也是腎臟功能檢測的重要指標。尿酸酶可以作為治療高尿酸血癥的潛在藥物，也可用于檢測血清尿酸濃度，因此具有較高的臨床應用價值[1-2]，是檢測痛風和高尿酸血癥試劑盒中的關鍵工具酶。但近幾十年用于試劑盒的高質量尿酸酶還主要依賴于進口，因此許多學者對其都進行了較為深入的研究。目前對重組尿酸酶的研究較多，但對帶 His 標簽尿酸酶的研究報道較少，中國藥科大學曾對重組豬尿酸酶添加 His 標簽，并進行了克隆、表達、純化等研究[3]。本實驗利用帶 His 標簽的重組產朊假絲酵母尿酸酶工程菌，研究了帶 His 標簽尿酸酶的高效表達條件、目的蛋白的分離純化及部分酶學性質，為尿酸酶的研發補充了相關的理論和實驗基礎。現報告如下。
1 材料與方法
1.1 主要材料
1.1.1 主要化學試劑
丙烯酰胺、N,N'-甲叉雙丙烯酰胺、十二烷基硫酸鈉均購自美國 Bio-Rad 公司；低分子量標準蛋白、Ni-瓊脂糖凝膠（Ni-Sepharose）及 Sephacryl S-200 HR 購自瑞典 Pharmacia 公司；蛋白胨、酵母粉購自英國 Oxoid 公司；尿酸購自德國 Sigma-Aldrich 公司；其他試劑均為國產 A.R 級。
1.1.2 菌種來源
以克隆在 pET 載體上的產朊假絲酵母尿酸酶基因為目的基因，pET28a 質粒為目的基因載體，E.coli JM109（DE3）為宿主菌。得到的重組質粒 pET-Uricase 轉化 E.coli JM109（DE3），通過卡那霉素抗性篩選并經酶切檢驗得到表達尿酸酶的工程菌。
1.2 培養基
1.2.1 種子培養基
蛋白胨 10 g/L，氯化鈉 10 g/L，酵母浸膏 5 g/L。
1.2.2 發酵培養基
蛋白胨 12 g/L，酵母浸膏 10 g/L，氯化鈉 8 g/L，葡萄糖 8 g/L，磷酸氫二鉀 12.54 g/L，磷酸二氫鉀 2.13 g/L，硫酸鎂 0.2 g/L。種子培養基和發酵培養基均含氨芐青霉素 50 μg/mL。
1.3 主要儀器
Dansence 3000K 型發酵罐（蘇州鼎興生物工程設備有限公司）；HZQ-C 型空氣浴振蕩器（哈爾濱市東明醫療儀器廠）；KS-600 超聲波細胞粉碎機（寧波海曙科生超聲設備有限公司）；Beckman Avanti J-20XP 高速冷凍離心機 （美國貝克曼公司）；PAC300 電泳儀（德國 Bio-Rad 公司）；Unico UV-2102 紫外可見分光光度計（上海尤尼柯儀器有限公司）；721 型分光光度計（上海第三分析儀器廠）。
1.4 培養方法
1.4.1 種子培養
取凍存的工程菌，接種于含 1 g/dL 瓊脂的種子培養基中，37℃ 條件下活化培養 12 h。挑取生長飽滿的單菌落接種于種子培養基，于 37℃ 和 220 r/min 條件下培養 12 h，期間收集少許菌液供十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分析其目的蛋白表達量。
1.4.2 發酵培養
以 5% 的接種量將種子培養液接入發酵培養基中，37℃ 和 220 r/min 搖床震蕩培養 24 h。每隔 2 h 定時取樣，期間通氣量調節至使氧飽和度>30%。針對誘導劑的選擇，采用測定波長在 600 nm 處的吸光度（A600 nm）繪制生長曲線，在 1 L 三角瓶中（裝液量 20%）培養工程菌，于菌體生長對數末期分別加異丙基-β-D-1-硫代半乳糖苷（isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside，IPTG）和乳糖，濃度分別為 0.5 mmol/L、5 g/L[4]。誘導后每隔 1 h 取樣，根據酶活性確定誘導終了時間。針對誘導培養時間對蛋白表達量的影響，采用以 5% 的接種量將三角瓶種子接種于 50 L 發酵罐（裝液量 70%），37℃、220 r/min 培養。定時取樣，測 A600 nm 并繪制生長曲線，在菌體生長對數末期加乳糖至 5 g/L，誘導后每隔 1 h 取樣檢測酶活力。酶活性不再增長或下降時，停止發酵，確定誘導培養時間。培養結束后，以離心發酵液稱量菌體濕重，比較兩者的誘導效果確定誘導劑的選擇。
1.4.3 重組尿酸酶的純化
取 50 g 菌體懸浮于 400 mL，20 mmol/L pH 值 8.5 的三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽［Tris（hydroxymethyl）aminomethane hydrochloride，Tris-HCl］緩沖液中，隨后采用超聲波破碎法破碎細胞，低溫離心（轉速 10 000 r/min，離心半徑 10.5 cm，離心時間 15 min），收集上清液得粗酶液。粗酶液經 Ni-Sepharose 親和層析（先用含 20 mmol/L 咪唑的 pH 值 8.5，20 mmol/L 的 Tris-HCl 緩沖液沖洗雜蛋白，然后用含 0.5 mol/L 咪唑的 pH 值 8.5，20 mmol/L Tris-HCl 緩沖液洗脫目的蛋白）和 Sephacryl S-200 HR 分子篩層析即可得到目的蛋白純品。
1.5 酶學性質研究
1.5.1 酶的最適反應 pH 值和酸堿穩定性
不同 pH 值緩沖液［pH 值 5.0～8.0 磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）、pH 值 8.0～8.9 Tris-HCl、pH 值 9.3～10.1 硼砂-氫氧化鈉］配制的尿酸 2.5 mL 與適當稀釋的 0.5 mL 尿酸酶在 37℃ 條件下精確反應 5 min，加 0.2 mL 氫氧化鉀（potassium hydroxide，KOH）終止反應并于 290 nm 處測定吸光度（A290 nm），并作酶活力隨 pH 值變化的曲線；將尿酸酶用 50 mmol/L pH 值 3.0～12.0（pH 值 3.0～5.0 磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液、pH 值 5.0～8.0 PBS、pH 值 8.0～8.9 Tris-HCl、pH 值 9.3～10.1 硼砂-氫氧化鈉、pH 值 10.9～12.0 磷酸氫二鈉-氫氧化鈉）緩沖液體系分別適當稀釋，37℃ 條件下處理 30 min 后測定酶活性并繪制酸堿穩定曲線。
1.5.2 酶的最適溫度和熱穩定性
以 2.0 mL 尿酸為底物，分別與 25、30、35、40、45、50、55℃ 水浴條件下保溫的 0.5 mL 酶液精確反應 5 min，作酶活力隨溫度變化的曲線。對于該酶的熱穩定性研究，將尿酸酶樣品分別在 40、45、50、55℃ 的水浴條件下精確保溫 5、10、15、20、25、30 min 后，冰水浴迅速冷卻，然后在最適 pH 值條件下測各樣品的酶活力，繪制熱穩定性曲線。
1.6 蛋白含量與酶活性測定方法
蛋白濃度測定采用 Bradford 法[5]，以牛血清白蛋白為標準蛋白對照。酶活定義及測定按照參考文獻[6]加以改進：在 40℃、pH 值 7.5 條件下，1 min 內催化 1 μmoL 尿酸分解所需的酶量定義為 1 個酶活性單位。具體方法為取 2.0 mL 尿酸溶液（含 0.001% 尿酸，pH 值 7.5 的 50 mmol/L 硼酸緩沖液，0.001% Triton X-100 和 1.0 mmol/L 乙二胺四乙酸），加 0.5 mL 水，再加入 0.5 mL 適當稀釋倍數的酶液，37℃ 準確反應 5 min。加入 0.2 mL 20% KOH 終止反應。空白管則先加入 KOH，再加入酶液，290 nm 處測定吸光度的減少量。
1.7 觀察指標
觀察誘導培養過程中的比活性、生物量；重組尿酸酶純化過程中的總活性、總蛋白、比活性、純化倍數及收率；重組尿酸酶的最適 pH 值、酸堿穩定性、最適溫度和熱穩定性。
2 結果
2.1 誘導條件對工程菌表達的影響
2.1.1 誘導劑的選擇
IPTG 誘導 4 h 時，酶活力達最大，為 156 U/g 菌體；乳糖誘導 6 h 時，效果最佳，為 144 U/g 菌體；菌體濕重分別為 18.7 g/L 發酵液（IPTG 誘導）、22 g/L 發酵液（乳糖誘導）。乳糖誘導產酶的總量多于 IPTG。因此選擇乳糖作為誘導劑。見圖 1。
圖1
誘導劑對重組尿酸酶表達的影響
2.1.2 誘導培養時間對蛋白表達的影響
工程菌培養 9 h，處于對數生長末期，加誘導劑乳糖，誘導培養 6 h 左右時，酶活性增長迅速。誘導培養 7 h 時，酶活力達 164 U/g 菌體，菌體濕重為 23 g/L。見圖 2。
圖2
50 L 發酵罐培養工程菌結果
2.2 重組尿酸酶的純化
重組尿酸酶經 Ni-Sepharose 親和層析和 Sephacryl S-200 HR 凝膠層析的純化結果見表 1，其最終純化倍數為 5.3，活性回收率為 66%；不同純化步驟獲得的酶樣品經 SDS-PAGE 分析結果見圖 3，結果表明 Ni-Sepharose 親和層析，尿酸酶已達很高純度，純化效果顯著，但仍存在微弱的非特異性結合雜蛋白，再經 Sephacryl S-200 HR 層析純化，可有效地去除此雜蛋白。純化的尿酸酶顯示為單鏈蛋白，對應的相對分子質量為 34×103。
表1
重組尿酸酶純化過程和結果
圖3
重組尿酸酶不同純化階段的 SDS-PAGE 分析
泳道 1、2、6、7：粗酶液；泳道 3、8：經 Ni-Sepharose 親和柱純化樣品；泳道 4、9：經 Sephacryl S-200 HR 純化樣品；泳道 5：蛋白標準相對分子質量（從上到下：磷酸化酶 97.4×103；白蛋白 66.2×103；卵清蛋白 45.0×103；碳酸酐酶 30.0×103；胰蛋白酶抑制劑 20.1×103）。泳道 1～4 為還原條件下電泳，泳道 6～9 為非還原條件下電泳
2.3 尿酸酶的酶學性質
尿酸酶作用于尿酸的最適 pH 值見圖 4，顯示該酶在 pH 值 7.5 時活性最高，pH 值高于或低于 7.5 時活性都會下降。尿酸酶在 pH 值 6.0～10.0 較穩定，其活性丟失甚微，可保留原活性的 90% 以上（圖 5）。該酶作用于尿酸的最適反應溫度為 40℃（圖 6），低于或高于此溫度時活性明顯降低。圖 7 顯示了該酶熱穩定性的分析結果，在低于 45℃ 的條件下熱穩定性較好，當高于 50℃ 時，隨著溫度的升高，其穩定性顯著下降。在 50℃ 處理 20 min 或 55℃ 處理 10 min，剩余酶活力均不足 50%。
圖4
重組尿酸酶的最適 pH 值
圖5
重組尿酸酶的酸堿穩定性
圖6
重組尿酸酶的最適溫度
圖7
重組尿酸酶的熱穩定性
3 討論
迄今為止，已有許多有關克隆與表達尿酸酶基因的研究。綜合分析表明，產酶來源比較豐富，如產朊假絲酵母尿酸酶（Candida utilis uricase）[7-9]，黃曲霉尿酸酶（Aspergillus flavusuricase）[10]和枯草芽孢桿菌尿酸酶（Bacillus subtilis uricase）[11]等，但綜合分析存在的問題主要集中在分離純化步驟繁瑣且成本較高。本項目組之前對重組尿酸酶的發酵培養條件及制備做了較為系統的研究[12]，其中分離純化主要利用了硫酸銨沉淀和 Q-Sepharose FF 離子交換層析，雖然最終也得到了尿酸酶的純品，但分離純化操作步驟較為繁瑣。本文針對這一主要問題提出利用帶 His 標簽的重組產朊假絲酵母尿酸酶工程菌，對其高效表達條件、目的蛋白的分離純化及部分酶學性質進行了較為系統的研究。結果表明，與乳糖相比，IPTG 作為誘導劑具有誘導時間短，比活力高的特點；但每升發酵液中乳糖誘導產酶總量高于 IPTG，且由于 IPTG 價格相對比較昂貴，不適宜大規模發酵生產。從工業應用角度考慮以價格低廉的乳糖作為誘導劑最佳。在 50 L 發酵罐中擴大化培養，乳糖誘導培養 7 h 酶活力和生物量均可達到最大。該重組尿酸酶帶有 His 標簽，粗酶液經 Ni-Sepharose 柱親和層析可一步達到分離純化的目的，再經過 Sephacryl S-200HR 分子篩層析后即可獲得該酶的純品，純化流程更為簡單。
本研究得到的重組尿酸酶比活力為 4.5 U/mg，比天然的[13]和重組無標簽的[14]尿酸酶比活力低。與天然尿酸酶相比，在最適反應溫度上均保持一致，但最適反應 pH 值為 7.5，比天然尿酸酶最適 pH 值 8.5 偏酸，酸堿穩定性和熱穩定性與天然尿酸酶有所差異。該酶在 45℃ 以下有較好的熱穩定性，在 pH 值 6.0～10.0 具有較好的酸堿穩定性，分析其原因可能是 His 標簽的添加改變了尿酸酶的天然結構，導致其活性降低。不過與天然的和重組無標簽的尿酸酶相比，帶 His 標簽的重組尿酸酶具有純化效率高的特點。這些研究均為帶 His 標簽重組尿酸酶的進一步開發利用提供了理論和實踐基礎。
在動物、植物、酵母、真菌和細菌中均發現有尿酸酶（urate oxidase，uricase；EC1.7.3.3）的存在，其作為一種廣泛存在的酶，可以分子氧作為受體催化尿酸氧化，參與生物體內嘌呤的代謝，將尿酸氧化分解為尿囊素、二氧化碳和過氧化氫。若人體內缺乏該酶，嘌呤代謝終產物尿酸及其鹽類在血液中難于溶解，就會引發高尿酸血癥，繼而誘發痛風、心血管病等疾病。血清尿酸水平也是腎臟功能檢測的重要指標。尿酸酶可以作為治療高尿酸血癥的潛在藥物，也可用于檢測血清尿酸濃度，因此具有較高的臨床應用價值[1-2]，是檢測痛風和高尿酸血癥試劑盒中的關鍵工具酶。但近幾十年用于試劑盒的高質量尿酸酶還主要依賴于進口，因此許多學者對其都進行了較為深入的研究。目前對重組尿酸酶的研究較多，但對帶 His 標簽尿酸酶的研究報道較少，中國藥科大學曾對重組豬尿酸酶添加 His 標簽，并進行了克隆、表達、純化等研究[3]。本實驗利用帶 His 標簽的重組產朊假絲酵母尿酸酶工程菌，研究了帶 His 標簽尿酸酶的高效表達條件、目的蛋白的分離純化及部分酶學性質，為尿酸酶的研發補充了相關的理論和實驗基礎。現報告如下。
1 材料與方法
1.1 主要材料
1.1.1 主要化學試劑
丙烯酰胺、N,N'-甲叉雙丙烯酰胺、十二烷基硫酸鈉均購自美國 Bio-Rad 公司；低分子量標準蛋白、Ni-瓊脂糖凝膠（Ni-Sepharose）及 Sephacryl S-200 HR 購自瑞典 Pharmacia 公司；蛋白胨、酵母粉購自英國 Oxoid 公司；尿酸購自德國 Sigma-Aldrich 公司；其他試劑均為國產 A.R 級。
1.1.2 菌種來源
以克隆在 pET 載體上的產朊假絲酵母尿酸酶基因為目的基因，pET28a 質粒為目的基因載體，E.coli JM109（DE3）為宿主菌。得到的重組質粒 pET-Uricase 轉化 E.coli JM109（DE3），通過卡那霉素抗性篩選并經酶切檢驗得到表達尿酸酶的工程菌。
1.2 培養基
1.2.1 種子培養基
蛋白胨 10 g/L，氯化鈉 10 g/L，酵母浸膏 5 g/L。
1.2.2 發酵培養基
蛋白胨 12 g/L，酵母浸膏 10 g/L，氯化鈉 8 g/L，葡萄糖 8 g/L，磷酸氫二鉀 12.54 g/L，磷酸二氫鉀 2.13 g/L，硫酸鎂 0.2 g/L。種子培養基和發酵培養基均含氨芐青霉素 50 μg/mL。
1.3 主要儀器
Dansence 3000K 型發酵罐（蘇州鼎興生物工程設備有限公司）；HZQ-C 型空氣浴振蕩器（哈爾濱市東明醫療儀器廠）；KS-600 超聲波細胞粉碎機（寧波海曙科生超聲設備有限公司）；Beckman Avanti J-20XP 高速冷凍離心機 （美國貝克曼公司）；PAC300 電泳儀（德國 Bio-Rad 公司）；Unico UV-2102 紫外可見分光光度計（上海尤尼柯儀器有限公司）；721 型分光光度計（上海第三分析儀器廠）。
1.4 培養方法
1.4.1 種子培養
取凍存的工程菌，接種于含 1 g/dL 瓊脂的種子培養基中，37℃ 條件下活化培養 12 h。挑取生長飽滿的單菌落接種于種子培養基，于 37℃ 和 220 r/min 條件下培養 12 h，期間收集少許菌液供十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分析其目的蛋白表達量。
1.4.2 發酵培養
以 5% 的接種量將種子培養液接入發酵培養基中，37℃ 和 220 r/min 搖床震蕩培養 24 h。每隔 2 h 定時取樣，期間通氣量調節至使氧飽和度>30%。針對誘導劑的選擇，采用測定波長在 600 nm 處的吸光度（A600 nm）繪制生長曲線，在 1 L 三角瓶中（裝液量 20%）培養工程菌，于菌體生長對數末期分別加異丙基-β-D-1-硫代半乳糖苷（isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside，IPTG）和乳糖，濃度分別為 0.5 mmol/L、5 g/L[4]。誘導后每隔 1 h 取樣，根據酶活性確定誘導終了時間。針對誘導培養時間對蛋白表達量的影響，采用以 5% 的接種量將三角瓶種子接種于 50 L 發酵罐（裝液量 70%），37℃、220 r/min 培養。定時取樣，測 A600 nm 并繪制生長曲線，在菌體生長對數末期加乳糖至 5 g/L，誘導后每隔 1 h 取樣檢測酶活力。酶活性不再增長或下降時，停止發酵，確定誘導培養時間。培養結束后，以離心發酵液稱量菌體濕重，比較兩者的誘導效果確定誘導劑的選擇。
1.4.3 重組尿酸酶的純化
取 50 g 菌體懸浮于 400 mL，20 mmol/L pH 值 8.5 的三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽［Tris（hydroxymethyl）aminomethane hydrochloride，Tris-HCl］緩沖液中，隨后采用超聲波破碎法破碎細胞，低溫離心（轉速 10 000 r/min，離心半徑 10.5 cm，離心時間 15 min），收集上清液得粗酶液。粗酶液經 Ni-Sepharose 親和層析（先用含 20 mmol/L 咪唑的 pH 值 8.5，20 mmol/L 的 Tris-HCl 緩沖液沖洗雜蛋白，然后用含 0.5 mol/L 咪唑的 pH 值 8.5，20 mmol/L Tris-HCl 緩沖液洗脫目的蛋白）和 Sephacryl S-200 HR 分子篩層析即可得到目的蛋白純品。
1.5 酶學性質研究
1.5.1 酶的最適反應 pH 值和酸堿穩定性
不同 pH 值緩沖液［pH 值 5.0～8.0 磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）、pH 值 8.0～8.9 Tris-HCl、pH 值 9.3～10.1 硼砂-氫氧化鈉］配制的尿酸 2.5 mL 與適當稀釋的 0.5 mL 尿酸酶在 37℃ 條件下精確反應 5 min，加 0.2 mL 氫氧化鉀（potassium hydroxide，KOH）終止反應并于 290 nm 處測定吸光度（A290 nm），并作酶活力隨 pH 值變化的曲線；將尿酸酶用 50 mmol/L pH 值 3.0～12.0（pH 值 3.0～5.0 磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液、pH 值 5.0～8.0 PBS、pH 值 8.0～8.9 Tris-HCl、pH 值 9.3～10.1 硼砂-氫氧化鈉、pH 值 10.9～12.0 磷酸氫二鈉-氫氧化鈉）緩沖液體系分別適當稀釋，37℃ 條件下處理 30 min 后測定酶活性并繪制酸堿穩定曲線。
1.5.2 酶的最適溫度和熱穩定性
以 2.0 mL 尿酸為底物，分別與 25、30、35、40、45、50、55℃ 水浴條件下保溫的 0.5 mL 酶液精確反應 5 min，作酶活力隨溫度變化的曲線。對于該酶的熱穩定性研究，將尿酸酶樣品分別在 40、45、50、55℃ 的水浴條件下精確保溫 5、10、15、20、25、30 min 后，冰水浴迅速冷卻，然后在最適 pH 值條件下測各樣品的酶活力，繪制熱穩定性曲線。
1.6 蛋白含量與酶活性測定方法
蛋白濃度測定采用 Bradford 法[5]，以牛血清白蛋白為標準蛋白對照。酶活定義及測定按照參考文獻[6]加以改進：在 40℃、pH 值 7.5 條件下，1 min 內催化 1 μmoL 尿酸分解所需的酶量定義為 1 個酶活性單位。具體方法為取 2.0 mL 尿酸溶液（含 0.001% 尿酸，pH 值 7.5 的 50 mmol/L 硼酸緩沖液，0.001% Triton X-100 和 1.0 mmol/L 乙二胺四乙酸），加 0.5 mL 水，再加入 0.5 mL 適當稀釋倍數的酶液，37℃ 準確反應 5 min。加入 0.2 mL 20% KOH 終止反應。空白管則先加入 KOH，再加入酶液，290 nm 處測定吸光度的減少量。
1.7 觀察指標
觀察誘導培養過程中的比活性、生物量；重組尿酸酶純化過程中的總活性、總蛋白、比活性、純化倍數及收率；重組尿酸酶的最適 pH 值、酸堿穩定性、最適溫度和熱穩定性。
2 結果
2.1 誘導條件對工程菌表達的影響
2.1.1 誘導劑的選擇
IPTG 誘導 4 h 時，酶活力達最大，為 156 U/g 菌體；乳糖誘導 6 h 時，效果最佳，為 144 U/g 菌體；菌體濕重分別為 18.7 g/L 發酵液（IPTG 誘導）、22 g/L 發酵液（乳糖誘導）。乳糖誘導產酶的總量多于 IPTG。因此選擇乳糖作為誘導劑。見圖 1。
圖1
誘導劑對重組尿酸酶表達的影響
2.1.2 誘導培養時間對蛋白表達的影響
工程菌培養 9 h，處于對數生長末期，加誘導劑乳糖，誘導培養 6 h 左右時，酶活性增長迅速。誘導培養 7 h 時，酶活力達 164 U/g 菌體，菌體濕重為 23 g/L。見圖 2。
圖2
50 L 發酵罐培養工程菌結果
2.2 重組尿酸酶的純化
重組尿酸酶經 Ni-Sepharose 親和層析和 Sephacryl S-200 HR 凝膠層析的純化結果見表 1，其最終純化倍數為 5.3，活性回收率為 66%；不同純化步驟獲得的酶樣品經 SDS-PAGE 分析結果見圖 3，結果表明 Ni-Sepharose 親和層析，尿酸酶已達很高純度，純化效果顯著，但仍存在微弱的非特異性結合雜蛋白，再經 Sephacryl S-200 HR 層析純化，可有效地去除此雜蛋白。純化的尿酸酶顯示為單鏈蛋白，對應的相對分子質量為 34×103。
表1
重組尿酸酶純化過程和結果
圖3
重組尿酸酶不同純化階段的 SDS-PAGE 分析
泳道 1、2、6、7：粗酶液；泳道 3、8：經 Ni-Sepharose 親和柱純化樣品；泳道 4、9：經 Sephacryl S-200 HR 純化樣品；泳道 5：蛋白標準相對分子質量（從上到下：磷酸化酶 97.4×103；白蛋白 66.2×103；卵清蛋白 45.0×103；碳酸酐酶 30.0×103；胰蛋白酶抑制劑 20.1×103）。泳道 1～4 為還原條件下電泳，泳道 6～9 為非還原條件下電泳
2.3 尿酸酶的酶學性質
尿酸酶作用于尿酸的最適 pH 值見圖 4，顯示該酶在 pH 值 7.5 時活性最高，pH 值高于或低于 7.5 時活性都會下降。尿酸酶在 pH 值 6.0～10.0 較穩定，其活性丟失甚微，可保留原活性的 90% 以上（圖 5）。該酶作用于尿酸的最適反應溫度為 40℃（圖 6），低于或高于此溫度時活性明顯降低。圖 7 顯示了該酶熱穩定性的分析結果，在低于 45℃ 的條件下熱穩定性較好，當高于 50℃ 時，隨著溫度的升高，其穩定性顯著下降。在 50℃ 處理 20 min 或 55℃ 處理 10 min，剩余酶活力均不足 50%。
圖4
重組尿酸酶的最適 pH 值
圖5
重組尿酸酶的酸堿穩定性
圖6
重組尿酸酶的最適溫度
圖7
重組尿酸酶的熱穩定性
3 討論
迄今為止，已有許多有關克隆與表達尿酸酶基因的研究。綜合分析表明，產酶來源比較豐富，如產朊假絲酵母尿酸酶（Candida utilis uricase）[7-9]，黃曲霉尿酸酶（Aspergillus flavusuricase）[10]和枯草芽孢桿菌尿酸酶（Bacillus subtilis uricase）[11]等，但綜合分析存在的問題主要集中在分離純化步驟繁瑣且成本較高。本項目組之前對重組尿酸酶的發酵培養條件及制備做了較為系統的研究[12]，其中分離純化主要利用了硫酸銨沉淀和 Q-Sepharose FF 離子交換層析，雖然最終也得到了尿酸酶的純品，但分離純化操作步驟較為繁瑣。本文針對這一主要問題提出利用帶 His 標簽的重組產朊假絲酵母尿酸酶工程菌，對其高效表達條件、目的蛋白的分離純化及部分酶學性質進行了較為系統的研究。結果表明，與乳糖相比，IPTG 作為誘導劑具有誘導時間短，比活力高的特點；但每升發酵液中乳糖誘導產酶總量高于 IPTG，且由于 IPTG 價格相對比較昂貴，不適宜大規模發酵生產。從工業應用角度考慮以價格低廉的乳糖作為誘導劑最佳。在 50 L 發酵罐中擴大化培養，乳糖誘導培養 7 h 酶活力和生物量均可達到最大。該重組尿酸酶帶有 His 標簽，粗酶液經 Ni-Sepharose 柱親和層析可一步達到分離純化的目的，再經過 Sephacryl S-200HR 分子篩層析后即可獲得該酶的純品，純化流程更為簡單。
本研究得到的重組尿酸酶比活力為 4.5 U/mg，比天然的[13]和重組無標簽的[14]尿酸酶比活力低。與天然尿酸酶相比，在最適反應溫度上均保持一致，但最適反應 pH 值為 7.5，比天然尿酸酶最適 pH 值 8.5 偏酸，酸堿穩定性和熱穩定性與天然尿酸酶有所差異。該酶在 45℃ 以下有較好的熱穩定性，在 pH 值 6.0～10.0 具有較好的酸堿穩定性，分析其原因可能是 His 標簽的添加改變了尿酸酶的天然結構，導致其活性降低。不過與天然的和重組無標簽的尿酸酶相比，帶 His 標簽的重組尿酸酶具有純化效率高的特點。這些研究均為帶 His 標簽重組尿酸酶的進一步開發利用提供了理論和實踐基礎。
