引用本文： 梅亞君, 秦永平, 章麗, 南峰, 向瑾, 余勤, 梁茂植. 高效液相色譜-串聯質譜法測定人血清中伏立諾他及其M2代謝物濃度. 華西醫學, 2016, 31(2): 278-282. doi: 10.7507/1002-0179.20160075 復制
組蛋白去乙酰化酶（HDAC）抑制劑可以允許蛋白質的重新表達，促進細胞凋亡和細胞分化而抑制細胞循環和細胞分裂[1-5]。因其具有廣譜低毒和靶向性的特點成為近年來抗腫瘤藥物研究領域中的熱點之一[6-8]。伏立諾他（SHA）用于治療加重、持續和復發或2種全身性用藥治療后無效的皮膚T細胞淋巴瘤（CTCL），是德國Merck公司開發的世界上第一個抑制HDAC的新型抗腫瘤藥物[9-11]，2006年10月被美國食品和藥物管理局（FDA）批準上市。有研究顯示，SHA可通過誘導細胞凋亡、分化和抑制細胞周期以及增加腫瘤抑制基因的表達來抑制胰腺癌細胞的增長[12]。此外，還發現SHA治療慢性B細胞復發性淋巴瘤[13]、抑制HCT-116結腸癌細胞增殖和誘導組蛋白高度乙酰化從而治療結腸癌[14]、治療轉移性頭頸癌[15]。有關生物樣品中SHA及其代謝物的測定方法國外文獻報道較多而國內較少。杜曉瑯等[16]采用高效液相色譜-串聯質譜法（HPLC-MS/MS），對血清樣品采用甲醇直接沉淀蛋白法，尿液直接稀釋進樣，測定了血清及尿液中SHA和M2代謝物的濃度。Du等[17]采用HPLC-MS/MS法實行在線萃取SHA及代謝物。Parise等[18]用HPLC-MS/MS法乙腈沉淀蛋白、梯度洗脫方法測定SHA及代謝物濃度。本文液-液萃取法建立了靈敏、準確的測定血清中SHA及其主要代謝物M2的HPLC-MS/MS分析方法，已用于其人體藥物代謝動力學研究預實驗。現報告如下。
1 材料與方法
1.1 儀器
日本島津公司SL-HTC系列高效液相色譜儀（HPLC，含系統控制器，全自動進樣器）；美國ABI公司API 3000型LC-MS/MS液質聯用系統（含 Analyst1.4色譜工作站）；德國Eppendorf公司 Centrifuge 5810R 型臺式低溫離心機。
1.2 試劑
SHA對照品（北京福瑞康正醫藥技術研究所，含量：＞99.5%，批號：20130318）；M2代謝物對照品（中國食品藥品檢定研究所，含量：98%，批號：100095-201205）；d5-SHA對照品（加拿大TRC公司，含量：98.6%，批號：6-PTR-92-2）；乙腈、甲醇、異丙醇為色譜純；其余試劑為分析純，其中乙醚在用前景重蒸餾后使用，實驗用純水由美國Millipore公司Milli-Q型超純水器制備所得。
1.3 方法
1.3.1 色譜與質譜條件
采用Gemini C18（50 mm×3.0 mm，3 μm）分析柱，流動相為甲醇︰乙腈︰水︰1 mol/L氨水︰甲酸（25︰15︰60︰0.1︰0.05），流速0.23 mL/min，柱溫為40 ℃。質譜檢測采用電噴霧離子源，多反應離子監測模式檢測，噴霧電壓為5 000 V；干燥氣流速7 L/min、溫度為450℃，碰撞氣為7 psi，霧化氣為8 psi，氣簾氣為7 psi；離子去簇電壓為20 V；環形聚焦電壓為57 V；SHA、M2和內標d5-SHA 的監測離子對m/z分別為265.2/232.2、194.1/176.1和270.3/237.3，碰撞室射出電壓分別為5、9和5 V，碰撞誘導解離電壓分別為17、16和18 V，入口電壓分別為7、5和7 V。
1.3.2 溶液配制
① SHA儲備液配制。精密稱取SHA對照品10.0 mg于50 mL容量瓶中，用50%甲醇定容至刻度，即得SHA儲備液（200 μg/mL），置4℃冰箱保存。
② M2代謝物儲備液配制。精密稱量M2對照品10.2 mg（相當于M2為10 mg）于50 mL容量瓶中，用純水定容至刻度，即得M2儲備液（200 μg/mL），置4 ℃冰箱保存。
③ d5-SHA儲備液（內標）及工作液配制。用十萬分之一電子分析天平采用減重稱量法精密稱量d5-SHA對照品1.0 mg，置100 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻即得d5-SHA儲備液（10 μg/mL），置4℃冰箱保存。臨用前用流動相稀釋至400 μg/L使用。
④ SHA及M2標準曲線工作液配制。取1.0 mL SHA儲備液（200 μg/mL）和2.0 mL M2儲備液（200 μg/mL）于100 mL容量瓶，加入50%甲醇定容至刻度即得標準曲線最高管工作液（SHA 2 000 ng/mL，M2 4 000 ng/mL），以后各濃度管用50%甲醇依次稀釋即得。
1.3.3 血清樣品的預處理
取配制好的血清樣品200 μL，加入50%甲醇100 μL、內標工作液（400 ng/mL）100 μL、0.5 mol/L鹽酸溶液100 μL，混勻后加3.5 mL含3%異丙醇的重蒸乙醚渦旋混合5 min，4 ℃離心8 min（3 000 r/min），轉上層液于尖底管中，置40 ℃水浴通空氣流揮干。殘渣用50 μL流動相復溶，進樣10 μL。記錄SHA、M2及內標色譜峰面積，以SHA、M2與內標的峰面積之比（y）帶入相應的標準曲線上求算血清濃度。
1.3.4 方法專屬性考察
分別取6個不同個體的空白血清各200 μL，加入100 μL 50%甲醇、100 μL流動相后按前述血清樣品的預處理中的“加入0.5 mol/L鹽酸溶液100 μL”起，同法操作，進樣10 μL；進樣對照品溶液10 μL；按前述血清樣品的預處理方法處理空白血清加對照品溶液以及受試者血清樣品，觀察空白血清中的雜質是否干擾樣品的測定。
1.3.5 線性關系及最低定量限考察
分別取空白血清200 μL 9份，依次加入SHA及M2標準系列工作液各100 μL，使SHA血漿濃度分別為1 000、500、250、100、50、25、10、2.5、1 μg/L，M2血漿濃度分別為2 000、1 000、500、200、100、50、20、5、2 μg/L，加入內標工作液100 μL，再加入50%甲醇 100 μL，按前述血清樣品的預處理中的“加入0.5 mol/L鹽酸溶液100 μL”起，同法操作，進樣10 μL。記錄藥物及內標色譜峰面積，以二者峰面積之比（y）對SHA和M2代謝物血清濃度（x）進行加權（1/c2）（c指權重系數）線性回歸。
1.3.6 精密度和方法回收率考察
取空白血清加SHA和M2工作液配制成低（2和4 ng/mL）、中（100和200 ng/mL）、高（800和1 600 ng/mL）3個濃度樣品，于同日內連續測定5次，計算其方法回收率和批內相對標準偏差（RSD）。于1周內同法測定3批每批5次，計算其批間RSD。
1.3.7 萃取回收率及基質效應考察
取空白血清加SHA和M2工作液配制成低、中和高3個濃度樣品，每種濃度3份，按前述血清樣品預處理方法中的自“加入50%甲醇100 μL”起同法操作后進樣。分別得到SHA和M2的峰面積A，同時分別取與血清樣品高、中和低3個濃度相同量的SHA和M2標準工作液于尖底管揮干，流動相復溶，先直接進樣得SHA和M2的峰面積B，再將溶液復溶加入預處理后的空白血清管，充分混合后進樣得SHA和M2的峰面積C。將所得峰面積A與峰面積C比較，計算低、中和高濃度SHA和M2的預處理回收率，公式為：預處理回收率=A/C×100%；將所得峰面積C與峰面積B比較，計算SHA和M2的基質效應，公式為：基質效應=（C-B）/B×100%。
1.3.8 穩定性考察
取空白血清加SHA和M2工作液配制成低、中和高3個濃度樣品，根據實際樣品測定過程中可能涉及到的樣品穩定性，分別對比考察樣品在-35℃冰箱中放置0、42、62 d，室溫放置0、2、6 h，反復凍融0、1、2、3次取樣測定，萃取物在4℃冰箱放置0、12、24、36 h，樣品處理后立即溶解進樣，然后同一樣品重復進樣1次和2次，樣品經處理后進樣室（8℃）放置0、8、16 h后進樣的穩定性。
1.4 方法應用
將本法用于2例CTCL患者餐后單次口服SHA 200 mg的藥物代謝動力學預試驗，繪制其SHA和M2代謝物的血藥濃度-時間曲線（藥時曲線）。
2 結果
2.1 方法專屬性
SHA、M2和內標的保留時間分別為4.31、3.22、4.23 min。測定了6個不同個體的空白血清，血清中雜質均不干擾SHA、M2和d5-SHA的測定。空白血清、對照品、空白血清加對照品及樣品的色譜圖見圖 1～4。
圖1
空白血清色譜圖 1a. SHA 1b. M2 1c. 內標? ?圖 2對照品色譜圖 2a. SHA 2b. M2 2c. 內標? ?圖 3空白血清+對照品色譜圖 3a. SHA 3b. M2 3c. 內標? ?圖 4受試者血清樣本色譜圖 4a. SHA 4b. M2 4c. 內標
2.2 線性關系及最低定量限
SHA和M2的血清標準曲線回歸方程分別為y=0.005 06x+0.000 11（r=0.999 7）和y=0.006 33x+0.011 6（r=0.997 8）。結果顯示，SHA和M2分別在1～1 000 μg/L和2～2 000 μg/L范圍標準曲線線性良好。最低定量限分別為1和2 ng/mL，其準確度及精密度均符合相關規定。
2.3 精密度和方法回收率
SHA及M2低、中、高濃度的方法回收率均合格，批內RSD及批間RSD均＜15%，符合要求。見表1。
2.4 萃取回收率及基質效應
SHA和M2低、中、高濃度的預處理回收率分別為56.77%～73.96%、72.51%～79.75%。SHA和M2的基質效應分別為-7.08%～-1.95%和-8.72%～-0.33%。
2.5 血清樣品穩定性
血清樣品在冰箱冷凍保存63 d，反復凍融3次，在室溫放置6 h后測定與未保存、未凍融和未放置樣品測定結果無明顯差異，處理后的樣品在進樣室（8℃）放置16 h進樣、萃取物在冰箱（4℃）中放置36 h，重復進樣測定2次與0時刻值比較變化率 均＜15%，穩定性符合要求。
2.6 方法應用
2例患者SHA和M2代謝物的藥時曲線見圖 5、6。可見二者的藥時曲線差異較大，原因可能是受試者為CTCL患者，自身的個體差異較大所致。
圖5
1號受試者給藥后SHA及M2代謝物藥時曲線圖
圖6
2號受試者給藥后SHA和M2的藥時曲線圖
3 討論
3.1 流動相的選擇
本次試驗分別考察了甲醇和乙腈的流動相，結果顯示甲醇為流動相時，藥物及其代謝物響應值顯著高于乙腈為流動相，但在單獨使用甲醇有機相時，M2代謝物出峰前有一明顯的雜質峰且不能完全分開，加入少量乙腈，M2代謝物出峰處沒有雜質峰的干擾，經考察不同甲醇、乙腈比例發現25%甲醇-15%乙腈作為有機相比例，基質效應合格且優于單用甲醇或乙腈作為有機相的流動相。試驗中還發現若流動相中不加甲酸，M2代謝物在10 min中內未出峰。考察加入不同量甲酸情況，選擇加入0.05%甲酸效果較好。同時在流動相中加入少量氨水可以改善峰形及響應，最終確定本研究所用流動相。
3.2 預處理條件的選擇
文獻多采用直接沉淀蛋白進樣，杜曉瑯等[16]和Parise等[18]報道分別采用甲醇和乙腈直接沉淀蛋白法，該法稀釋了樣品不利于提高檢測靈敏度，同時水溶性不揮發成分多不利于色譜柱、質譜離子源的保護，且基質效應難以達標。從SHA及M2代謝物的結構可以看出兩個成分的極性差不大，均呈弱酸性，因此可以在一定酸性環境下采用有機溶劑將藥物及其代謝物進行萃取濃集。經考察血樣加入不同濃度的鹽酸，用不同的有機溶劑萃取，發現加入0.5 mol/L鹽酸，用含3%異丙醇重蒸乙醚萃取的SHA及M2代謝物萃取回收率均達到較為滿意的效果。
3.3 同位素標記的藥物作內標
本試驗用同位素標記的藥物d5-SHA作內標，由于其理化性質和SHA幾乎完全一致，能較好地消除預處理和質譜檢測器響應引起的誤差，使SHA測定的精密度良好，優于文獻采用的其他結構類似的藥物做內標[4]。反之，由于內標和代謝物之間理化性質存在差異，精密度略差于SHA。
本研究建立的方法預處理簡便、靈敏準確，適用于SHA及M2代謝物血藥濃度的測定及藥物代謝動力學研究。2例受試者餐后單次口服SHA 200 mg后SHA及M2代謝物的藥物代謝動力學參數和文獻結果[1, 4]相比基本一致。
組蛋白去乙酰化酶（HDAC）抑制劑可以允許蛋白質的重新表達，促進細胞凋亡和細胞分化而抑制細胞循環和細胞分裂[1-5]。因其具有廣譜低毒和靶向性的特點成為近年來抗腫瘤藥物研究領域中的熱點之一[6-8]。伏立諾他（SHA）用于治療加重、持續和復發或2種全身性用藥治療后無效的皮膚T細胞淋巴瘤（CTCL），是德國Merck公司開發的世界上第一個抑制HDAC的新型抗腫瘤藥物[9-11]，2006年10月被美國食品和藥物管理局（FDA）批準上市。有研究顯示，SHA可通過誘導細胞凋亡、分化和抑制細胞周期以及增加腫瘤抑制基因的表達來抑制胰腺癌細胞的增長[12]。此外，還發現SHA治療慢性B細胞復發性淋巴瘤[13]、抑制HCT-116結腸癌細胞增殖和誘導組蛋白高度乙酰化從而治療結腸癌[14]、治療轉移性頭頸癌[15]。有關生物樣品中SHA及其代謝物的測定方法國外文獻報道較多而國內較少。杜曉瑯等[16]采用高效液相色譜-串聯質譜法（HPLC-MS/MS），對血清樣品采用甲醇直接沉淀蛋白法，尿液直接稀釋進樣，測定了血清及尿液中SHA和M2代謝物的濃度。Du等[17]采用HPLC-MS/MS法實行在線萃取SHA及代謝物。Parise等[18]用HPLC-MS/MS法乙腈沉淀蛋白、梯度洗脫方法測定SHA及代謝物濃度。本文液-液萃取法建立了靈敏、準確的測定血清中SHA及其主要代謝物M2的HPLC-MS/MS分析方法，已用于其人體藥物代謝動力學研究預實驗。現報告如下。
1 材料與方法
1.1 儀器
日本島津公司SL-HTC系列高效液相色譜儀（HPLC，含系統控制器，全自動進樣器）；美國ABI公司API 3000型LC-MS/MS液質聯用系統（含 Analyst1.4色譜工作站）；德國Eppendorf公司 Centrifuge 5810R 型臺式低溫離心機。
1.2 試劑
SHA對照品（北京福瑞康正醫藥技術研究所，含量：＞99.5%，批號：20130318）；M2代謝物對照品（中國食品藥品檢定研究所，含量：98%，批號：100095-201205）；d5-SHA對照品（加拿大TRC公司，含量：98.6%，批號：6-PTR-92-2）；乙腈、甲醇、異丙醇為色譜純；其余試劑為分析純，其中乙醚在用前景重蒸餾后使用，實驗用純水由美國Millipore公司Milli-Q型超純水器制備所得。
1.3 方法
1.3.1 色譜與質譜條件
采用Gemini C18（50 mm×3.0 mm，3 μm）分析柱，流動相為甲醇︰乙腈︰水︰1 mol/L氨水︰甲酸（25︰15︰60︰0.1︰0.05），流速0.23 mL/min，柱溫為40 ℃。質譜檢測采用電噴霧離子源，多反應離子監測模式檢測，噴霧電壓為5 000 V；干燥氣流速7 L/min、溫度為450℃，碰撞氣為7 psi，霧化氣為8 psi，氣簾氣為7 psi；離子去簇電壓為20 V；環形聚焦電壓為57 V；SHA、M2和內標d5-SHA 的監測離子對m/z分別為265.2/232.2、194.1/176.1和270.3/237.3，碰撞室射出電壓分別為5、9和5 V，碰撞誘導解離電壓分別為17、16和18 V，入口電壓分別為7、5和7 V。
1.3.2 溶液配制
① SHA儲備液配制。精密稱取SHA對照品10.0 mg于50 mL容量瓶中，用50%甲醇定容至刻度，即得SHA儲備液（200 μg/mL），置4℃冰箱保存。
② M2代謝物儲備液配制。精密稱量M2對照品10.2 mg（相當于M2為10 mg）于50 mL容量瓶中，用純水定容至刻度，即得M2儲備液（200 μg/mL），置4 ℃冰箱保存。
③ d5-SHA儲備液（內標）及工作液配制。用十萬分之一電子分析天平采用減重稱量法精密稱量d5-SHA對照品1.0 mg，置100 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻即得d5-SHA儲備液（10 μg/mL），置4℃冰箱保存。臨用前用流動相稀釋至400 μg/L使用。
④ SHA及M2標準曲線工作液配制。取1.0 mL SHA儲備液（200 μg/mL）和2.0 mL M2儲備液（200 μg/mL）于100 mL容量瓶，加入50%甲醇定容至刻度即得標準曲線最高管工作液（SHA 2 000 ng/mL，M2 4 000 ng/mL），以后各濃度管用50%甲醇依次稀釋即得。
1.3.3 血清樣品的預處理
取配制好的血清樣品200 μL，加入50%甲醇100 μL、內標工作液（400 ng/mL）100 μL、0.5 mol/L鹽酸溶液100 μL，混勻后加3.5 mL含3%異丙醇的重蒸乙醚渦旋混合5 min，4 ℃離心8 min（3 000 r/min），轉上層液于尖底管中，置40 ℃水浴通空氣流揮干。殘渣用50 μL流動相復溶，進樣10 μL。記錄SHA、M2及內標色譜峰面積，以SHA、M2與內標的峰面積之比（y）帶入相應的標準曲線上求算血清濃度。
1.3.4 方法專屬性考察
分別取6個不同個體的空白血清各200 μL，加入100 μL 50%甲醇、100 μL流動相后按前述血清樣品的預處理中的“加入0.5 mol/L鹽酸溶液100 μL”起，同法操作，進樣10 μL；進樣對照品溶液10 μL；按前述血清樣品的預處理方法處理空白血清加對照品溶液以及受試者血清樣品，觀察空白血清中的雜質是否干擾樣品的測定。
1.3.5 線性關系及最低定量限考察
分別取空白血清200 μL 9份，依次加入SHA及M2標準系列工作液各100 μL，使SHA血漿濃度分別為1 000、500、250、100、50、25、10、2.5、1 μg/L，M2血漿濃度分別為2 000、1 000、500、200、100、50、20、5、2 μg/L，加入內標工作液100 μL，再加入50%甲醇 100 μL，按前述血清樣品的預處理中的“加入0.5 mol/L鹽酸溶液100 μL”起，同法操作，進樣10 μL。記錄藥物及內標色譜峰面積，以二者峰面積之比（y）對SHA和M2代謝物血清濃度（x）進行加權（1/c2）（c指權重系數）線性回歸。
1.3.6 精密度和方法回收率考察
取空白血清加SHA和M2工作液配制成低（2和4 ng/mL）、中（100和200 ng/mL）、高（800和1 600 ng/mL）3個濃度樣品，于同日內連續測定5次，計算其方法回收率和批內相對標準偏差（RSD）。于1周內同法測定3批每批5次，計算其批間RSD。
1.3.7 萃取回收率及基質效應考察
取空白血清加SHA和M2工作液配制成低、中和高3個濃度樣品，每種濃度3份，按前述血清樣品預處理方法中的自“加入50%甲醇100 μL”起同法操作后進樣。分別得到SHA和M2的峰面積A，同時分別取與血清樣品高、中和低3個濃度相同量的SHA和M2標準工作液于尖底管揮干，流動相復溶，先直接進樣得SHA和M2的峰面積B，再將溶液復溶加入預處理后的空白血清管，充分混合后進樣得SHA和M2的峰面積C。將所得峰面積A與峰面積C比較，計算低、中和高濃度SHA和M2的預處理回收率，公式為：預處理回收率=A/C×100%；將所得峰面積C與峰面積B比較，計算SHA和M2的基質效應，公式為：基質效應=（C-B）/B×100%。
1.3.8 穩定性考察
取空白血清加SHA和M2工作液配制成低、中和高3個濃度樣品，根據實際樣品測定過程中可能涉及到的樣品穩定性，分別對比考察樣品在-35℃冰箱中放置0、42、62 d，室溫放置0、2、6 h，反復凍融0、1、2、3次取樣測定，萃取物在4℃冰箱放置0、12、24、36 h，樣品處理后立即溶解進樣，然后同一樣品重復進樣1次和2次，樣品經處理后進樣室（8℃）放置0、8、16 h后進樣的穩定性。
1.4 方法應用
將本法用于2例CTCL患者餐后單次口服SHA 200 mg的藥物代謝動力學預試驗，繪制其SHA和M2代謝物的血藥濃度-時間曲線（藥時曲線）。
2 結果
2.1 方法專屬性
SHA、M2和內標的保留時間分別為4.31、3.22、4.23 min。測定了6個不同個體的空白血清，血清中雜質均不干擾SHA、M2和d5-SHA的測定。空白血清、對照品、空白血清加對照品及樣品的色譜圖見圖 1～4。
圖1
空白血清色譜圖 1a. SHA 1b. M2 1c. 內標? ?圖 2對照品色譜圖 2a. SHA 2b. M2 2c. 內標? ?圖 3空白血清+對照品色譜圖 3a. SHA 3b. M2 3c. 內標? ?圖 4受試者血清樣本色譜圖 4a. SHA 4b. M2 4c. 內標
2.2 線性關系及最低定量限
SHA和M2的血清標準曲線回歸方程分別為y=0.005 06x+0.000 11（r=0.999 7）和y=0.006 33x+0.011 6（r=0.997 8）。結果顯示，SHA和M2分別在1～1 000 μg/L和2～2 000 μg/L范圍標準曲線線性良好。最低定量限分別為1和2 ng/mL，其準確度及精密度均符合相關規定。
2.3 精密度和方法回收率
SHA及M2低、中、高濃度的方法回收率均合格，批內RSD及批間RSD均＜15%，符合要求。見表1。
2.4 萃取回收率及基質效應
SHA和M2低、中、高濃度的預處理回收率分別為56.77%～73.96%、72.51%～79.75%。SHA和M2的基質效應分別為-7.08%～-1.95%和-8.72%～-0.33%。
2.5 血清樣品穩定性
血清樣品在冰箱冷凍保存63 d，反復凍融3次，在室溫放置6 h后測定與未保存、未凍融和未放置樣品測定結果無明顯差異，處理后的樣品在進樣室（8℃）放置16 h進樣、萃取物在冰箱（4℃）中放置36 h，重復進樣測定2次與0時刻值比較變化率 均＜15%，穩定性符合要求。
2.6 方法應用
2例患者SHA和M2代謝物的藥時曲線見圖 5、6。可見二者的藥時曲線差異較大，原因可能是受試者為CTCL患者，自身的個體差異較大所致。
圖5
1號受試者給藥后SHA及M2代謝物藥時曲線圖
圖6
2號受試者給藥后SHA和M2的藥時曲線圖
3 討論
3.1 流動相的選擇
本次試驗分別考察了甲醇和乙腈的流動相，結果顯示甲醇為流動相時，藥物及其代謝物響應值顯著高于乙腈為流動相，但在單獨使用甲醇有機相時，M2代謝物出峰前有一明顯的雜質峰且不能完全分開，加入少量乙腈，M2代謝物出峰處沒有雜質峰的干擾，經考察不同甲醇、乙腈比例發現25%甲醇-15%乙腈作為有機相比例，基質效應合格且優于單用甲醇或乙腈作為有機相的流動相。試驗中還發現若流動相中不加甲酸，M2代謝物在10 min中內未出峰。考察加入不同量甲酸情況，選擇加入0.05%甲酸效果較好。同時在流動相中加入少量氨水可以改善峰形及響應，最終確定本研究所用流動相。
3.2 預處理條件的選擇
文獻多采用直接沉淀蛋白進樣，杜曉瑯等[16]和Parise等[18]報道分別采用甲醇和乙腈直接沉淀蛋白法，該法稀釋了樣品不利于提高檢測靈敏度，同時水溶性不揮發成分多不利于色譜柱、質譜離子源的保護，且基質效應難以達標。從SHA及M2代謝物的結構可以看出兩個成分的極性差不大，均呈弱酸性，因此可以在一定酸性環境下采用有機溶劑將藥物及其代謝物進行萃取濃集。經考察血樣加入不同濃度的鹽酸，用不同的有機溶劑萃取，發現加入0.5 mol/L鹽酸，用含3%異丙醇重蒸乙醚萃取的SHA及M2代謝物萃取回收率均達到較為滿意的效果。
3.3 同位素標記的藥物作內標
本試驗用同位素標記的藥物d5-SHA作內標，由于其理化性質和SHA幾乎完全一致，能較好地消除預處理和質譜檢測器響應引起的誤差，使SHA測定的精密度良好，優于文獻采用的其他結構類似的藥物做內標[4]。反之，由于內標和代謝物之間理化性質存在差異，精密度略差于SHA。
本研究建立的方法預處理簡便、靈敏準確，適用于SHA及M2代謝物血藥濃度的測定及藥物代謝動力學研究。2例受試者餐后單次口服SHA 200 mg后SHA及M2代謝物的藥物代謝動力學參數和文獻結果[1, 4]相比基本一致。
