引用本文： 晏江麗, 徐靜, 雷敏. 噬菌體生物擴增技術在結核病診斷中的臨床價值探討. 華西醫學, 2016, 31(2): 274-277. doi: 10.7507/1002-0179.20160074 復制
結核病是由結核分枝桿菌引起的嚴重威脅人類健康的傳染性疾病，1993年被世界衛生組織宣布為全球緊急狀態的唯一傳染病。近20年來，全球結核病疫情呈急劇惡化的態勢，結核病的發病數和死亡數持續增加。2000年第四次全國結核病流行病學抽樣調查顯示，我國活動性肺結核患病率為367/10萬，菌陽肺結核患病率為160/10萬，涂陽肺結核患病率為122/10萬，總耐藥率為27.8%[1]，說明我國的結核病形勢非常嚴峻。臨床常見的檢測方法如結核菌素皮膚試驗（TST）、抗酸染色、分枝桿菌培養、核酸檢測等方法由于其各自的局限性，已不能完全滿足臨床診斷的需求，一些新的檢測方法逐漸被學者所認識，如γ-干擾素釋放試驗（IGRA）、噬菌體生物擴增技術（PhaB）等。本研究旨在通過比較分析PhaB法、抗酸染色涂片顯微鏡檢查和分枝桿菌培養在結核病患者中的診斷性能，初步評價PhaB法用于結核病診斷的臨床價值。現報告如下。
1 資料與方法
1.1 研究對象
選取2014年1月－12月來我院就診，且根據我國《WS288－2008肺結核診斷標準》[2]確診為活動性肺結核患者112例、非活動性肺結核患者45例。其中男91例，女66例；年齡13～65歲，平均（34.7±28.4）歲。每位研究對象采集就診時的隨機痰和次日晨痰標本各1份，共計314份合格痰標本，其中干酪痰64份，血痰21份，泡沫痰116份，黏液痰96份，口水樣痰17份。
1.2 材料
結核分枝桿菌噬菌體生物擴增試劑盒（FASTPlaqueTB）購自英國Biotec公司；抗酸染色試劑盒購自珠海貝索生物技術有限公司；BACTEC MGIT 960TB system儀器及配套試劑均購自美國BD公司。
1.3 方法
1.3.1 抗酸染色涂片顯微鏡檢查法（涂片法）
對每位研究對象的晨痰和隨機痰標本，按《全國臨床檢驗操作規程》（第3版）[3]進行涂片、抗酸染色和顯微鏡檢查。在10×100倍油鏡下至少觀察100個視野，結核分枝桿菌呈紅色，其他細菌和細胞呈藍色。按照1984年國內統一標準[3]進行報告：全視野（或100個視野）未找到抗酸菌報告“-”；全視野發現1～2條時報告抗酸菌的個數；全視野發現3～9條報告“+”；全視野發現10～99條報告“++”；每視野發現1～9條報告“+++”；每視野發現10條以上報告“++++”。同一對象的晨痰和隨機痰，任一標本報告陽性，即認為該對象涂片法為陽性。
1.3.2 分枝桿菌培養法（BACTEC-960）
對每位研究對象的晨痰標本采用BACTEC MGIT 960全自動快速結核菌培養系統以及其配套試劑進行分枝桿菌培養試驗。操作步驟嚴格按照儀器說明書和實驗室標準的操作規程進行。儀器自動判斷報陽，而且經過抗酸染色確認為陽性，即為該標本分枝桿菌培養陽性；若經28 d培養儀器判斷為陰性，但抗酸染色確認為陽性時，也報告該標本分枝桿菌培養陽性；否則報告為陰性。
1.3.3 PhaB法
對每位研究對象的晨痰和隨機痰標本作PhaB檢測，嚴格按試劑盒說明書配制所需試劑，包括前處理液、培養基、噬菌體、敏感細胞、殺病毒劑、陰陽性對照等。① 痰標本前處理：挑取約1～3 mL痰液于50 mL無菌有蓋離心管中，加等體積N-乙酰-L-半胱氨酸氫氧化鈉溶液（NALC-NaOH）消化液，漩渦振蕩1 min，室溫孵育15 min，加磷酸鹽緩沖液（PBS）至45 mL，3 000 r/min離心15 min（離心半徑3 cm），棄去上清液，加15 mL C液（FASTPlaqueTB完全培養基）重懸下層沉淀，以離心半徑3 cm、3 000 r/min離心15 min，棄去上清液，再加1 mL C液重懸，轉移至反應管中，置于37℃培養18～24 h。② 噬菌體浸染：分別加100 μL試劑D（噬菌體）于陽性對照、陰性對照及標本中，輕輕搖晃，確保試管內容物位于試管底部，37℃孵育60 min。③ 中止浸染：分別加100 μL試劑F（殺病毒劑）于陽性對照、陰性對照及標本中，充分混勻，置于室溫5～6 min，然后加入5 mL培養液和1 mL試劑E（敏感細胞）。④ 澆注平皿及培養：將上述混合液與冷卻至（55±2）℃的試劑G（瓊脂培養基）于培養皿中快速混勻，置于室溫定型，平放于37℃培養18～24 h 判讀結果。⑤ 結果判讀：觀察培養皿中的噬菌斑個數，陽性對照應≥20個，陰性對照應＜10個；對臨床標本，噬菌斑≥20個判斷為陽性結果，噬菌斑＜20個為陰性結果。
1.4 統計學方法
采用SPSS 17.0統計軟件，計數資料的分析采用χ2檢驗，檢驗水準α=0.05。
2 結果
3種方法對結核病患者的檢測靈敏度從高到低依次為分枝桿菌培養法（89.8%）、PhaB法（68.2%）和涂片法（52.2%），差異有統計學意義（P＜0.05）。見表 1。
表1
3種方法對結核病檢測陽性率比較分析（n=157）
以分枝桿菌培養法結果為標準方法，PhaB法和抗酸染色法的陽性符合度分別為74.5%和57.4%，與培養法結果相比，差異有統計學意義（P＜0.05）；總體符合度為75.8%和60.5%，與培養法結果相比，差異有統計學意義（P＜0.05）。
在雙份痰標本抗酸染色涂片均為陰性的75個對象中，PhaB法的陽性檢出率為33.3%（25/75）。
抗酸染色法的檢測時間為1 h，PhaB法的檢測時間為46 h，分枝桿菌培養法的平均檢測時間為9.5 d。
3 討論
我國是全球22個結核病高負擔國家之一，也是全球27個耐多藥結核病流行嚴重的國家之一[4]。目前我國結核病年發病人數約為130萬，占全球發病數的14.3%，位居全球第2位，僅次于印度[1]。近年來結核病疫情日益惡化，究其原因，診斷不及時或誤診、漏診，傳染源未得到及時控制，特別是治療不規范導致結核菌的耐藥，尤其是耐多藥結核的出現是導致結核病疫情升高的最重要因素之一。
傳統的結核病實驗室檢測方法有TST、結核抗體檢測、抗酸染色涂片檢查、分枝桿菌培養、基因擴增等，但在臨床推廣中都有顯著的局限性。如TST存在皮內注射風險，觀察結果耗時長，無法鑒別結核病與卡介苗感染；抗酸染色陽性率低；培養法操作繁瑣，耗時長；分子生物學方法設備昂貴，操作復雜[5-8]。此外，臨床醫生為制定個體化的有針對性的用藥計劃或病情評估，常常需要確切知道患者的結核菌是死菌或活菌。常規的痰涂片抗酸染色和分子生物學方法均無法辨別死菌活菌，而培養法是鑒定死菌活菌的“金標準”，但耗時長（需2～8周）、敏感性低（涂陽標本約80%培養陽性）、特異性差（各種分枝桿菌均可生長，需進一步試驗才可確定是否為結核菌）。因此，臨床迫切需要一種新的診斷性能高、簡便快速的實驗室檢測方法。在這樣的背景下，PhaB法越來越受到臨床學者的親睞。
1997年，Wilson等[9]建立了以PhaB法來快速檢測結核分枝桿菌和藥物敏感度的技術平臺。其基本原理是，活的結核分枝桿菌可保護菌體內的噬菌體免受噬菌體殺滅劑的影響。先將結核分枝桿菌與噬菌體共同孵育浸染，使噬菌體將DNA注入細菌體內，然后用殺滅劑處理菌體外的噬菌體，而在菌體內的則不受影響，并利用菌體內的代謝酶系組裝子代噬菌體，最終裂解結核分枝桿菌并釋放噬菌體，開始新的增殖周期，子代噬菌體可感染隨后加入的指示細胞（敏感細胞）并將其裂解，最終在瓊脂平板上形成噬菌斑。若樣本中含有活的結核分枝桿菌，則噬菌體可在其體內完成增殖周期而形成清晰的噬菌斑；若樣本中不含有結核分枝桿菌，則不能形成噬菌斑[10]。因此，根據平板上噬菌斑的有無及其數量的多少，即可判斷待測樣本中是否含有活的結核分枝桿菌或其他少數幾種非結核分枝桿菌。
PhaB法自發現以來，受到眾多學者的研究[11-13]。Albert等[14]對853例結核病患者的研究中，PhaB法在培養陽性患者和所有患者中的檢測陽性率分別為75.2%和70.3%，與之對應的涂片法僅有63.4%和61.3%。Albay等[15]在對192份痰標本的檢測中，以培養陽性為金標準，涂片法、聚合酶鏈反應法和PhaB法的陽性符合率分別為57.8%、84.4%和87.5%。Butt等[16]對40例培養陽性樣本的檢測中，PhaB法的靈敏度和特異度分別為86%和73%，陽性和陰性預測值分別為0.89和0.67。在本研究中，對157例結核病患者的隨機痰和晨痰進行對比檢測，PhaB法在培養陽性患者和所有患者中的檢測陽性率分別為74.5%和68.2%，與之對應的涂片法僅有57.4%和52.2%，差異有統計學意義（P＜0.05），與國內外報道結果基本相符，表明PhaB法較之涂片法，具有更高的檢出靈敏度。本研究還發現，在雙份痰標本涂片均陰性的患者中，PhaB法的陽性檢出率為33.3%，也表現出比涂片法明顯的優勢。從檢出時間上來看，抗酸染色法的檢測時間為1 h，PhaB法的檢測時間為46 h，培養法的平均檢測時間為9.5 d，可見PhaB法比培養法可顯著縮短檢測時間，迅速提供檢測報告。
從PhaB法的原理上看，如果在浸染前加入抗結核類藥物，即可進行耐藥結核的篩選；若結核分枝桿菌敏感，則會被藥物殺滅而PhaB試驗為陰性；若為耐藥型結核分枝桿菌，其不受抗結核藥物的影響，PhaB試驗為陽性。因此，可用PhaB試驗作為耐藥結核分枝桿菌的篩選試驗。Watterson等[17]使用線形探針測試、基因錯配測試和PhaB法分別測試了16株耐利福平的菌株，并與培養法進行對比，線形探針測試、基因錯配測試和PhaB法的符合度分別為16/16（100.0%）、15/16（93.8%）和16/16（100.0%）。Albert等[18]使用PhaB法對191株結核分枝桿菌進行利福霉素的耐藥篩查試驗，并與傳統培養法進行對比，傳統培養法的結果是81株耐藥，110株敏感，而PhaB法的靈敏度、特異度和準確度分別為100%、97%和98%。可見，PhaB法檢測結核分枝桿菌的耐藥性，與傳統的培養法和分子生物學方法具有高度的吻合度。遺憾的是，本研究中未涉及到耐藥性試驗的研究，將在后續作進一步的研究。
綜上所述，PhaB法用于結核分枝桿菌的早期診斷和耐藥性篩查，具有高靈敏度、高特異度、快速、操作簡便、無需特殊儀器設備、可鑒定死菌與活菌等優點，具有較高的臨床實用價值，特別是在經濟欠發達地區，適用于作為結核病的初篩試驗或傳統方法的補充試驗。
結核病是由結核分枝桿菌引起的嚴重威脅人類健康的傳染性疾病，1993年被世界衛生組織宣布為全球緊急狀態的唯一傳染病。近20年來，全球結核病疫情呈急劇惡化的態勢，結核病的發病數和死亡數持續增加。2000年第四次全國結核病流行病學抽樣調查顯示，我國活動性肺結核患病率為367/10萬，菌陽肺結核患病率為160/10萬，涂陽肺結核患病率為122/10萬，總耐藥率為27.8%[1]，說明我國的結核病形勢非常嚴峻。臨床常見的檢測方法如結核菌素皮膚試驗（TST）、抗酸染色、分枝桿菌培養、核酸檢測等方法由于其各自的局限性，已不能完全滿足臨床診斷的需求，一些新的檢測方法逐漸被學者所認識，如γ-干擾素釋放試驗（IGRA）、噬菌體生物擴增技術（PhaB）等。本研究旨在通過比較分析PhaB法、抗酸染色涂片顯微鏡檢查和分枝桿菌培養在結核病患者中的診斷性能，初步評價PhaB法用于結核病診斷的臨床價值。現報告如下。
1 資料與方法
1.1 研究對象
選取2014年1月－12月來我院就診，且根據我國《WS288－2008肺結核診斷標準》[2]確診為活動性肺結核患者112例、非活動性肺結核患者45例。其中男91例，女66例；年齡13～65歲，平均（34.7±28.4）歲。每位研究對象采集就診時的隨機痰和次日晨痰標本各1份，共計314份合格痰標本，其中干酪痰64份，血痰21份，泡沫痰116份，黏液痰96份，口水樣痰17份。
1.2 材料
結核分枝桿菌噬菌體生物擴增試劑盒（FASTPlaqueTB）購自英國Biotec公司；抗酸染色試劑盒購自珠海貝索生物技術有限公司；BACTEC MGIT 960TB system儀器及配套試劑均購自美國BD公司。
1.3 方法
1.3.1 抗酸染色涂片顯微鏡檢查法（涂片法）
對每位研究對象的晨痰和隨機痰標本，按《全國臨床檢驗操作規程》（第3版）[3]進行涂片、抗酸染色和顯微鏡檢查。在10×100倍油鏡下至少觀察100個視野，結核分枝桿菌呈紅色，其他細菌和細胞呈藍色。按照1984年國內統一標準[3]進行報告：全視野（或100個視野）未找到抗酸菌報告“-”；全視野發現1～2條時報告抗酸菌的個數；全視野發現3～9條報告“+”；全視野發現10～99條報告“++”；每視野發現1～9條報告“+++”；每視野發現10條以上報告“++++”。同一對象的晨痰和隨機痰，任一標本報告陽性，即認為該對象涂片法為陽性。
1.3.2 分枝桿菌培養法（BACTEC-960）
對每位研究對象的晨痰標本采用BACTEC MGIT 960全自動快速結核菌培養系統以及其配套試劑進行分枝桿菌培養試驗。操作步驟嚴格按照儀器說明書和實驗室標準的操作規程進行。儀器自動判斷報陽，而且經過抗酸染色確認為陽性，即為該標本分枝桿菌培養陽性；若經28 d培養儀器判斷為陰性，但抗酸染色確認為陽性時，也報告該標本分枝桿菌培養陽性；否則報告為陰性。
1.3.3 PhaB法
對每位研究對象的晨痰和隨機痰標本作PhaB檢測，嚴格按試劑盒說明書配制所需試劑，包括前處理液、培養基、噬菌體、敏感細胞、殺病毒劑、陰陽性對照等。① 痰標本前處理：挑取約1～3 mL痰液于50 mL無菌有蓋離心管中，加等體積N-乙酰-L-半胱氨酸氫氧化鈉溶液（NALC-NaOH）消化液，漩渦振蕩1 min，室溫孵育15 min，加磷酸鹽緩沖液（PBS）至45 mL，3 000 r/min離心15 min（離心半徑3 cm），棄去上清液，加15 mL C液（FASTPlaqueTB完全培養基）重懸下層沉淀，以離心半徑3 cm、3 000 r/min離心15 min，棄去上清液，再加1 mL C液重懸，轉移至反應管中，置于37℃培養18～24 h。② 噬菌體浸染：分別加100 μL試劑D（噬菌體）于陽性對照、陰性對照及標本中，輕輕搖晃，確保試管內容物位于試管底部，37℃孵育60 min。③ 中止浸染：分別加100 μL試劑F（殺病毒劑）于陽性對照、陰性對照及標本中，充分混勻，置于室溫5～6 min，然后加入5 mL培養液和1 mL試劑E（敏感細胞）。④ 澆注平皿及培養：將上述混合液與冷卻至（55±2）℃的試劑G（瓊脂培養基）于培養皿中快速混勻，置于室溫定型，平放于37℃培養18～24 h 判讀結果。⑤ 結果判讀：觀察培養皿中的噬菌斑個數，陽性對照應≥20個，陰性對照應＜10個；對臨床標本，噬菌斑≥20個判斷為陽性結果，噬菌斑＜20個為陰性結果。
1.4 統計學方法
采用SPSS 17.0統計軟件，計數資料的分析采用χ2檢驗，檢驗水準α=0.05。
2 結果
3種方法對結核病患者的檢測靈敏度從高到低依次為分枝桿菌培養法（89.8%）、PhaB法（68.2%）和涂片法（52.2%），差異有統計學意義（P＜0.05）。見表 1。
表1
3種方法對結核病檢測陽性率比較分析（n=157）
以分枝桿菌培養法結果為標準方法，PhaB法和抗酸染色法的陽性符合度分別為74.5%和57.4%，與培養法結果相比，差異有統計學意義（P＜0.05）；總體符合度為75.8%和60.5%，與培養法結果相比，差異有統計學意義（P＜0.05）。
在雙份痰標本抗酸染色涂片均為陰性的75個對象中，PhaB法的陽性檢出率為33.3%（25/75）。
抗酸染色法的檢測時間為1 h，PhaB法的檢測時間為46 h，分枝桿菌培養法的平均檢測時間為9.5 d。
3 討論
我國是全球22個結核病高負擔國家之一，也是全球27個耐多藥結核病流行嚴重的國家之一[4]。目前我國結核病年發病人數約為130萬，占全球發病數的14.3%，位居全球第2位，僅次于印度[1]。近年來結核病疫情日益惡化，究其原因，診斷不及時或誤診、漏診，傳染源未得到及時控制，特別是治療不規范導致結核菌的耐藥，尤其是耐多藥結核的出現是導致結核病疫情升高的最重要因素之一。
傳統的結核病實驗室檢測方法有TST、結核抗體檢測、抗酸染色涂片檢查、分枝桿菌培養、基因擴增等，但在臨床推廣中都有顯著的局限性。如TST存在皮內注射風險，觀察結果耗時長，無法鑒別結核病與卡介苗感染；抗酸染色陽性率低；培養法操作繁瑣，耗時長；分子生物學方法設備昂貴，操作復雜[5-8]。此外，臨床醫生為制定個體化的有針對性的用藥計劃或病情評估，常常需要確切知道患者的結核菌是死菌或活菌。常規的痰涂片抗酸染色和分子生物學方法均無法辨別死菌活菌，而培養法是鑒定死菌活菌的“金標準”，但耗時長（需2～8周）、敏感性低（涂陽標本約80%培養陽性）、特異性差（各種分枝桿菌均可生長，需進一步試驗才可確定是否為結核菌）。因此，臨床迫切需要一種新的診斷性能高、簡便快速的實驗室檢測方法。在這樣的背景下，PhaB法越來越受到臨床學者的親睞。
1997年，Wilson等[9]建立了以PhaB法來快速檢測結核分枝桿菌和藥物敏感度的技術平臺。其基本原理是，活的結核分枝桿菌可保護菌體內的噬菌體免受噬菌體殺滅劑的影響。先將結核分枝桿菌與噬菌體共同孵育浸染，使噬菌體將DNA注入細菌體內，然后用殺滅劑處理菌體外的噬菌體，而在菌體內的則不受影響，并利用菌體內的代謝酶系組裝子代噬菌體，最終裂解結核分枝桿菌并釋放噬菌體，開始新的增殖周期，子代噬菌體可感染隨后加入的指示細胞（敏感細胞）并將其裂解，最終在瓊脂平板上形成噬菌斑。若樣本中含有活的結核分枝桿菌，則噬菌體可在其體內完成增殖周期而形成清晰的噬菌斑；若樣本中不含有結核分枝桿菌，則不能形成噬菌斑[10]。因此，根據平板上噬菌斑的有無及其數量的多少，即可判斷待測樣本中是否含有活的結核分枝桿菌或其他少數幾種非結核分枝桿菌。
PhaB法自發現以來，受到眾多學者的研究[11-13]。Albert等[14]對853例結核病患者的研究中，PhaB法在培養陽性患者和所有患者中的檢測陽性率分別為75.2%和70.3%，與之對應的涂片法僅有63.4%和61.3%。Albay等[15]在對192份痰標本的檢測中，以培養陽性為金標準，涂片法、聚合酶鏈反應法和PhaB法的陽性符合率分別為57.8%、84.4%和87.5%。Butt等[16]對40例培養陽性樣本的檢測中，PhaB法的靈敏度和特異度分別為86%和73%，陽性和陰性預測值分別為0.89和0.67。在本研究中，對157例結核病患者的隨機痰和晨痰進行對比檢測，PhaB法在培養陽性患者和所有患者中的檢測陽性率分別為74.5%和68.2%，與之對應的涂片法僅有57.4%和52.2%，差異有統計學意義（P＜0.05），與國內外報道結果基本相符，表明PhaB法較之涂片法，具有更高的檢出靈敏度。本研究還發現，在雙份痰標本涂片均陰性的患者中，PhaB法的陽性檢出率為33.3%，也表現出比涂片法明顯的優勢。從檢出時間上來看，抗酸染色法的檢測時間為1 h，PhaB法的檢測時間為46 h，培養法的平均檢測時間為9.5 d，可見PhaB法比培養法可顯著縮短檢測時間，迅速提供檢測報告。
從PhaB法的原理上看，如果在浸染前加入抗結核類藥物，即可進行耐藥結核的篩選；若結核分枝桿菌敏感，則會被藥物殺滅而PhaB試驗為陰性；若為耐藥型結核分枝桿菌，其不受抗結核藥物的影響，PhaB試驗為陽性。因此，可用PhaB試驗作為耐藥結核分枝桿菌的篩選試驗。Watterson等[17]使用線形探針測試、基因錯配測試和PhaB法分別測試了16株耐利福平的菌株，并與培養法進行對比，線形探針測試、基因錯配測試和PhaB法的符合度分別為16/16（100.0%）、15/16（93.8%）和16/16（100.0%）。Albert等[18]使用PhaB法對191株結核分枝桿菌進行利福霉素的耐藥篩查試驗，并與傳統培養法進行對比，傳統培養法的結果是81株耐藥，110株敏感，而PhaB法的靈敏度、特異度和準確度分別為100%、97%和98%。可見，PhaB法檢測結核分枝桿菌的耐藥性，與傳統的培養法和分子生物學方法具有高度的吻合度。遺憾的是，本研究中未涉及到耐藥性試驗的研究，將在后續作進一步的研究。
綜上所述，PhaB法用于結核分枝桿菌的早期診斷和耐藥性篩查，具有高靈敏度、高特異度、快速、操作簡便、無需特殊儀器設備、可鑒定死菌與活菌等優點，具有較高的臨床實用價值，特別是在經濟欠發達地區，適用于作為結核病的初篩試驗或傳統方法的補充試驗。
