引用本文： 姜花, 何成奇, 歐禹萍, 袁菊蓮, 楊揚, 孫增春, 賈雪, 周雪. 鹿茸血酒對去勢大鼠骨密度與T細胞亞群的影響. 華西醫學, 2016, 31(2): 283-286. doi: 10.7507/1002-0179.20160076 復制
絕經后婦女易發生骨質疏松癥、免疫力低下等疾患。骨質疏松癥是以骨量減少、骨組織顯微結構破壞、骨脆性下降、骨痛、骨密度降低、易于發生骨折為主要病理改變和臨床表現的代謝性、全身性骨骼疾病[1]。是引發病理性骨折的主要原因，在現代社會中已成為一種嚴重影響生活質量的疾病[2]。隨著人類壽命的延長和人口的老齡化，骨質疏松癥發生率逐漸上升，其防治已成為世界性重要問題之一[3]。《本草綱目》記載，鹿茸具有“生精補髓，養血益陰，強筋壯骨”之功效。鹿茸血是傳統的名貴中藥，具有抗衰老、抗疲勞、抗輻射等作用[4]。鹿茸血酒的前期研究發現，鹿茸血酒對絕經后婦女有升雌激素和抗氧化的作用[5]，但對絕經后婦女的骨質疏松癥和免疫功能的作用尚不明確。最近研究發現，骨轉化受免疫系統影響，其中T淋巴細胞起重要的調節作用[6]。本研究采用去勢雌性Sprague Dawley（SD）大鼠建立骨質疏松模型，觀察不同劑量的鹿茸血酒對雌性去勢SD大鼠骨密度與免疫功能的影響。現報告如下。
1 材料與方法
1.1 實驗動物
健康清潔級雌性SD大鼠60只，鼠齡2個月，體質量（200±10） g，由成都達碩生物科技有限公司提供，由四川省實驗動物中心檢測，動物合格證號XK（川）2008-24。
1.2 主要材料與儀器
1.2.1 主要材料
10%水合氯醛、青霉素、10%甲醛、乙醇含量為39%的白酒。鹿茸血酒由鹿茸血、山楂、枸杞、丁香等名貴中藥及乙醇含量為39%的白酒組成，鹿茸血的濃度是0.115 μL/kg，由四川金皇樂爽鹿業有限公司提供。CD3、CD4、CD8三色抗體試劑，購自美國Biolegend公司。抗大鼠CD4-PE、抗大鼠CD8-APC、抗大鼠CD3-FIT和紅細胞裂解液，購自國內碧云天公司。
1.2.2 測定儀器
Lunar雙能X線骨密度儀iDXA機（美國GE Healthcare公司生產）；FACSAria BD流式細胞儀及FACSDiVa BD分析軟件（美國BD Biosciences公司生產）；LDZ522醫用離心機（北京醫用離心機廠生產）。
1.3 實驗方法
1.3.1 動物分組與模型的建立
按隨機數字表法將60只大鼠分為6組，分別為正常對照組、骨質疏松模型組、單純乙醇干預組、高劑量組鹿茸血酒、中劑量鹿茸血酒組和低劑量鹿茸血酒組。每組10只。
去卵巢大鼠模型是目前最常用的絕經后骨質疏松動物模型。用10%水合氯醛0.6 mL腹腔注射麻醉，取俯臥位固定，備皮，消毒。自肋脊角處切開皮膚和肌肉進入腹腔，分離脂肪團，暴露卵巢。止血鉗夾住卵巢下輸卵管（包括脂肪團）用絲線結扎，摘除卵巢，縫合肌層及皮膚，消毒手術切口。同法摘除另一側卵巢。自手術當天起連續3 d給予青霉素0.1 mL，1次/d，肌肉注射，以預防感染。骨質疏松模型組、單純乙醇干預組、高劑量組鹿茸血酒、中劑量鹿茸血酒組和低劑量鹿茸血酒組均造模。
1.3.2 干預方法
根據日常飲酒習慣及相關研究[7-9]，本實驗以成人每日飲入含39%乙醇的白酒150、100、50 g為高、中、低劑量依據對大鼠進行等效劑量轉換，根據人與動物體型系數換算公式計算藥物劑量[10]，經過換算，本課題對應劑量為：高劑量13.6 g/kg、中劑量9.1 g/kg、低劑量4.5 g/kg。
自術后第4天起，使用灌胃器對實驗動物進行灌喂，1次/d。正常對照組：正常飼養，每日灌喂生理鹽水9.1 g/kg；骨質疏松模型組：去勢大鼠每日灌喂生理鹽水9.1 g/kg；單純乙醇干預組：去勢大鼠每日灌喂含39%乙醇的白酒9.1 g/kg；低、中、高劑量鹿茸血酒組，去勢大鼠每日分別灌喂鹿茸血酒4.5、9.1、13.6 g/（kg·d）。干預30 d，每周秤重1次，以調整灌胃劑量。
干預第31天，取頸動脈全血1 mL至抗凝采血管中，脫頸椎處死大鼠。避光操作將抗大鼠CD4-PE和CD8-ACP、CD3-FITC克隆抗體共12 μL加入抗凝采血管中混勻，冰敷30 min，加入100 μL紅細胞裂解液，待紅細胞裂解充分，放入離心機，以1 200 r/min，離心5 min后取出，取上清液棄去，再加入1 mL磷酸鹽緩沖液洗細胞，再放入離心機以1 200 r/min，離心5 min后取出，取上清液棄去，再加300 μL磷酸鹽緩沖液使細胞重懸，后送流式細胞儀檢測外周淋巴細胞T細胞亞群：CD3+、CD4+、CD8+指標。各組動物在處死后分離右側股骨，剔除軟組織取右側股骨，浸泡于4%甲醛溶液中。運用小動物測定軟件對股骨進行掃描，測定SD大鼠右側股骨骨密度（g/cm2）。
1.4 統計學方法
使用SPSS 16.0軟件進行統計學分析。檢測指標以均數±標準差表示，各檢測指標組間均數比較采用單因素方差分析，再使用最小顯著差法（LSD法）進行組間兩兩比較。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 各組骨密度比較
骨質疏松模型組骨密度明顯低于正常對照組骨密度（P＜0.05），說明已經形成骨質疏松模型。單純乙醇干預組與骨質疏松模型組的骨密度差異無統計學意義（P＞0.05）；高、中、低劑量鹿茸血酒組骨密度均高于骨質疏松模型組和單純乙醇干預組，差異有統計學意義（P＜0.05）。中、低劑量組骨密度高于高劑量組，差異有統計學意義（P＜0.05）；低劑量組與中劑量組骨密度差異無統計學意義（P＞0.05）。見表 1。
表1
各組骨密度與T細胞亞群水平（n=10，2.2 各組T細胞亞群水平比較
各組T細胞亞群水平比較結果見表 1。
2.2.1 CD3+百分比
各組CD3+百分比差異無統計學意義（P＞0.05）。
2.2.2 CD4+百分比
與正常對照組比較，所有造模組CD4+百分比均降低，差異有統計學意義（P＜0.05）；與骨質疏松模型組比較，單純乙醇干預組和所有鹿茸血酒干預組CD4+百分比均升高，差異有統計學意義（P＜0.05）；中劑量鹿茸血酒組CD4+百分比高于單純乙醇干預組和低、高劑量鹿茸血酒組，差異有統計學意義（P＜0.05），后3組間差異無統計學意義（P＞0.05）。
2.2.3 CD8+百分比
與正常對照組比較，除低劑量鹿茸血酒干預組外，所有造模組CD8+百分比均升高，差異有統計學意義（P＜0.05）；與骨質疏松模型組比較，單純乙醇干預組和所有鹿茸血酒干預組CD8+百分比均降低（P＜0.05）；單純乙醇干預組與高劑量鹿茸血酒組差異無統計學意義（P＞0.05），低、高劑量鹿茸血酒組差異有統計學意義（P＜0.05），前兩組高于后兩組，差異有統計學意義（P＜0.05）。
2.2.4 CD4+/CD8+百分比
與正常對照組比較，所有造模組CD4+/CD8+比值均降低，差異有統計學意義（P＜0.05）；與骨質疏松模型組比較，單純乙醇干預組和所有鹿茸血酒干預組CD4+/CD8+比值均升高，差異有統計學意義（P＜0.05）；與單純乙醇干預組比較，低、中劑量鹿茸血酒組CD4+/CD8+比值均升高，差異有統計學意義（P＜0.05）；低、中劑量組CD4+/CD8+比值差異無統計學意義（P＞0.05）。
3 討論
骨質疏松癥是一種以骨量減少，骨組織顯微結構受損，繼而引起骨骼脆性增加和骨折危險性增高的系統性骨骼疾病[11]。骨密度下降是骨質疏松的主要病理表現[2]。骨密度測定是診斷骨質疏松、評價骨質疏松程度及骨質疏松治療效果的重要指標[12]。雙能X線骨密度測定能夠迅速、精確地測定骨密度。雌激素與骨質疏松有關，不僅具有抑制骨吸收的作用，同時可促進骨生長。雌激素水平降低后，破骨細胞功能增強，骨代謝轉化功能亢進，骨吸收的速度大于骨形成的速度，從而導致骨量減少。中醫認為，腎藏精，主骨生髓，主生長發育及生殖功能的盛衰。研究發現，腎在骨的生長和重建中起重要作用，骨密度與腎的盛衰程度有一定關系[13]。
鹿角所含膠原蛋白為補腎方劑“龜鹿二仙方”等常用藥物，鹿茸為梅花鹿或馬鹿的雄鹿末骨化密生絨毛的幼角[14]，為補腎常用中藥，能改善骨密度，具有抗骨質疏松作用[15]。鹿茸中含有天門冬氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、谷氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸、組氨酸、精氨酸、脯氨酸等20多種氨基酸[16]，還含有硫酸軟骨素A等多糖類物質、促雄激素樣物質、雌二醇，具有促PC12細胞增殖活性的蛋白組成分、無機元素以及5種人體必需的常量元素鈣、鈉、鉀、磷、鎂和11種人體必需的微量元素鐵、鋅、銅、鉻、鍶、鎳、鉬、鈷、錳、釩、錫[17]。鹿茸血是取自梅花鹿或馬鹿幼角的新鮮血液經過干燥而成，它與鹿茸成分相似[18]。其改善骨密度、抗骨質疏松作用可能與其所含成分有關。Kishi等[19]研究認為，鹿茸血可以通過改善骨組織鎂元素的含量達到抗骨質疏松的作用。
本研究中，在干預1個月時，低、中、高低劑量鹿茸血酒與骨質疏松模型組比較，骨密度差異均有統計學意義（P＜0.05），表明鹿茸血酒有提高去勢大鼠骨密度的功效，并且低中劑量的作用優于高劑量組，以低劑量組更有優勢。本研究的局限之處，在干預 1個月骨密度達到一定改善后，繼續干預更長時間，是否使骨密度繼續增高，還有待進一步研究。
T淋巴細胞亞群的檢測對疾病的發生、發展過程的研究有著極為重要的意義。Pacifici[20]及Nomura等[21]認為，在正常機體中各種T淋巴細胞亞群通過相互作用來維持正常的免疫功能，尤其是CD4+/CD8+比值保持動態平衡是維持機體免疫自穩的中心環節。董萬超等[22]及邱學敏等[23]研究顯示，CD4+細胞數量的減少使B淋巴細胞易被抗原致敏，使血液中的抗體隨之減少。本研究結果表明，鹿茸血酒可使CD4+百分比及CD4+/CD8+比值均升高，可見鹿茸血酒可提高T細胞介導的細胞免疫功能。可能是由于促進了CD4+的分化、發育及成熟過程，增強細胞間的黏附功能，并加強信號傳遞和T淋巴細胞的活化，從而提高機體細胞免疫功能。
綜上所述，本實驗復制了圍絕經期大鼠的動物模型，手術去除雙側卵巢后，灌飼一定劑量的鹿茸血酒進行干預實驗，用雙能X線進行骨密度測定，用流式細胞儀進行淋巴細胞亞群檢測，結果顯示中、低劑量的鹿茸血酒有提高骨密度及正向調節免疫的作用，表明適宜劑量鹿茸血酒可增強去勢大鼠細胞免疫功能，提高其非特異性免疫能力，并增強骨密度。本研究顯示，日常適當飲鹿茸血酒對絕經后骨質疏松有一定的防治作用，并可調節免疫能力。但本研究樣本量較小，本實驗研究周期僅1個月，后期的持久效應未觀察，因此在有條件的情況下，可做進一步研究。
絕經后婦女易發生骨質疏松癥、免疫力低下等疾患。骨質疏松癥是以骨量減少、骨組織顯微結構破壞、骨脆性下降、骨痛、骨密度降低、易于發生骨折為主要病理改變和臨床表現的代謝性、全身性骨骼疾病[1]。是引發病理性骨折的主要原因，在現代社會中已成為一種嚴重影響生活質量的疾病[2]。隨著人類壽命的延長和人口的老齡化，骨質疏松癥發生率逐漸上升，其防治已成為世界性重要問題之一[3]。《本草綱目》記載，鹿茸具有“生精補髓，養血益陰，強筋壯骨”之功效。鹿茸血是傳統的名貴中藥，具有抗衰老、抗疲勞、抗輻射等作用[4]。鹿茸血酒的前期研究發現，鹿茸血酒對絕經后婦女有升雌激素和抗氧化的作用[5]，但對絕經后婦女的骨質疏松癥和免疫功能的作用尚不明確。最近研究發現，骨轉化受免疫系統影響，其中T淋巴細胞起重要的調節作用[6]。本研究采用去勢雌性Sprague Dawley（SD）大鼠建立骨質疏松模型，觀察不同劑量的鹿茸血酒對雌性去勢SD大鼠骨密度與免疫功能的影響。現報告如下。
1 材料與方法
1.1 實驗動物
健康清潔級雌性SD大鼠60只，鼠齡2個月，體質量（200±10） g，由成都達碩生物科技有限公司提供，由四川省實驗動物中心檢測，動物合格證號XK（川）2008-24。
1.2 主要材料與儀器
1.2.1 主要材料
10%水合氯醛、青霉素、10%甲醛、乙醇含量為39%的白酒。鹿茸血酒由鹿茸血、山楂、枸杞、丁香等名貴中藥及乙醇含量為39%的白酒組成，鹿茸血的濃度是0.115 μL/kg，由四川金皇樂爽鹿業有限公司提供。CD3、CD4、CD8三色抗體試劑，購自美國Biolegend公司。抗大鼠CD4-PE、抗大鼠CD8-APC、抗大鼠CD3-FIT和紅細胞裂解液，購自國內碧云天公司。
1.2.2 測定儀器
Lunar雙能X線骨密度儀iDXA機（美國GE Healthcare公司生產）；FACSAria BD流式細胞儀及FACSDiVa BD分析軟件（美國BD Biosciences公司生產）；LDZ522醫用離心機（北京醫用離心機廠生產）。
1.3 實驗方法
1.3.1 動物分組與模型的建立
按隨機數字表法將60只大鼠分為6組，分別為正常對照組、骨質疏松模型組、單純乙醇干預組、高劑量組鹿茸血酒、中劑量鹿茸血酒組和低劑量鹿茸血酒組。每組10只。
去卵巢大鼠模型是目前最常用的絕經后骨質疏松動物模型。用10%水合氯醛0.6 mL腹腔注射麻醉，取俯臥位固定，備皮，消毒。自肋脊角處切開皮膚和肌肉進入腹腔，分離脂肪團，暴露卵巢。止血鉗夾住卵巢下輸卵管（包括脂肪團）用絲線結扎，摘除卵巢，縫合肌層及皮膚，消毒手術切口。同法摘除另一側卵巢。自手術當天起連續3 d給予青霉素0.1 mL，1次/d，肌肉注射，以預防感染。骨質疏松模型組、單純乙醇干預組、高劑量組鹿茸血酒、中劑量鹿茸血酒組和低劑量鹿茸血酒組均造模。
1.3.2 干預方法
根據日常飲酒習慣及相關研究[7-9]，本實驗以成人每日飲入含39%乙醇的白酒150、100、50 g為高、中、低劑量依據對大鼠進行等效劑量轉換，根據人與動物體型系數換算公式計算藥物劑量[10]，經過換算，本課題對應劑量為：高劑量13.6 g/kg、中劑量9.1 g/kg、低劑量4.5 g/kg。
自術后第4天起，使用灌胃器對實驗動物進行灌喂，1次/d。正常對照組：正常飼養，每日灌喂生理鹽水9.1 g/kg；骨質疏松模型組：去勢大鼠每日灌喂生理鹽水9.1 g/kg；單純乙醇干預組：去勢大鼠每日灌喂含39%乙醇的白酒9.1 g/kg；低、中、高劑量鹿茸血酒組，去勢大鼠每日分別灌喂鹿茸血酒4.5、9.1、13.6 g/（kg·d）。干預30 d，每周秤重1次，以調整灌胃劑量。
干預第31天，取頸動脈全血1 mL至抗凝采血管中，脫頸椎處死大鼠。避光操作將抗大鼠CD4-PE和CD8-ACP、CD3-FITC克隆抗體共12 μL加入抗凝采血管中混勻，冰敷30 min，加入100 μL紅細胞裂解液，待紅細胞裂解充分，放入離心機，以1 200 r/min，離心5 min后取出，取上清液棄去，再加入1 mL磷酸鹽緩沖液洗細胞，再放入離心機以1 200 r/min，離心5 min后取出，取上清液棄去，再加300 μL磷酸鹽緩沖液使細胞重懸，后送流式細胞儀檢測外周淋巴細胞T細胞亞群：CD3+、CD4+、CD8+指標。各組動物在處死后分離右側股骨，剔除軟組織取右側股骨，浸泡于4%甲醛溶液中。運用小動物測定軟件對股骨進行掃描，測定SD大鼠右側股骨骨密度（g/cm2）。
1.4 統計學方法
使用SPSS 16.0軟件進行統計學分析。檢測指標以均數±標準差表示，各檢測指標組間均數比較采用單因素方差分析，再使用最小顯著差法（LSD法）進行組間兩兩比較。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 各組骨密度比較
骨質疏松模型組骨密度明顯低于正常對照組骨密度（P＜0.05），說明已經形成骨質疏松模型。單純乙醇干預組與骨質疏松模型組的骨密度差異無統計學意義（P＞0.05）；高、中、低劑量鹿茸血酒組骨密度均高于骨質疏松模型組和單純乙醇干預組，差異有統計學意義（P＜0.05）。中、低劑量組骨密度高于高劑量組，差異有統計學意義（P＜0.05）；低劑量組與中劑量組骨密度差異無統計學意義（P＞0.05）。見表 1。
表1
各組骨密度與T細胞亞群水平（n=10，2.2 各組T細胞亞群水平比較
各組T細胞亞群水平比較結果見表 1。
2.2.1 CD3+百分比
各組CD3+百分比差異無統計學意義（P＞0.05）。
2.2.2 CD4+百分比
與正常對照組比較，所有造模組CD4+百分比均降低，差異有統計學意義（P＜0.05）；與骨質疏松模型組比較，單純乙醇干預組和所有鹿茸血酒干預組CD4+百分比均升高，差異有統計學意義（P＜0.05）；中劑量鹿茸血酒組CD4+百分比高于單純乙醇干預組和低、高劑量鹿茸血酒組，差異有統計學意義（P＜0.05），后3組間差異無統計學意義（P＞0.05）。
2.2.3 CD8+百分比
與正常對照組比較，除低劑量鹿茸血酒干預組外，所有造模組CD8+百分比均升高，差異有統計學意義（P＜0.05）；與骨質疏松模型組比較，單純乙醇干預組和所有鹿茸血酒干預組CD8+百分比均降低（P＜0.05）；單純乙醇干預組與高劑量鹿茸血酒組差異無統計學意義（P＞0.05），低、高劑量鹿茸血酒組差異有統計學意義（P＜0.05），前兩組高于后兩組，差異有統計學意義（P＜0.05）。
2.2.4 CD4+/CD8+百分比
與正常對照組比較，所有造模組CD4+/CD8+比值均降低，差異有統計學意義（P＜0.05）；與骨質疏松模型組比較，單純乙醇干預組和所有鹿茸血酒干預組CD4+/CD8+比值均升高，差異有統計學意義（P＜0.05）；與單純乙醇干預組比較，低、中劑量鹿茸血酒組CD4+/CD8+比值均升高，差異有統計學意義（P＜0.05）；低、中劑量組CD4+/CD8+比值差異無統計學意義（P＞0.05）。
3 討論
骨質疏松癥是一種以骨量減少，骨組織顯微結構受損，繼而引起骨骼脆性增加和骨折危險性增高的系統性骨骼疾病[11]。骨密度下降是骨質疏松的主要病理表現[2]。骨密度測定是診斷骨質疏松、評價骨質疏松程度及骨質疏松治療效果的重要指標[12]。雙能X線骨密度測定能夠迅速、精確地測定骨密度。雌激素與骨質疏松有關，不僅具有抑制骨吸收的作用，同時可促進骨生長。雌激素水平降低后，破骨細胞功能增強，骨代謝轉化功能亢進，骨吸收的速度大于骨形成的速度，從而導致骨量減少。中醫認為，腎藏精，主骨生髓，主生長發育及生殖功能的盛衰。研究發現，腎在骨的生長和重建中起重要作用，骨密度與腎的盛衰程度有一定關系[13]。
鹿角所含膠原蛋白為補腎方劑“龜鹿二仙方”等常用藥物，鹿茸為梅花鹿或馬鹿的雄鹿末骨化密生絨毛的幼角[14]，為補腎常用中藥，能改善骨密度，具有抗骨質疏松作用[15]。鹿茸中含有天門冬氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、谷氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸、組氨酸、精氨酸、脯氨酸等20多種氨基酸[16]，還含有硫酸軟骨素A等多糖類物質、促雄激素樣物質、雌二醇，具有促PC12細胞增殖活性的蛋白組成分、無機元素以及5種人體必需的常量元素鈣、鈉、鉀、磷、鎂和11種人體必需的微量元素鐵、鋅、銅、鉻、鍶、鎳、鉬、鈷、錳、釩、錫[17]。鹿茸血是取自梅花鹿或馬鹿幼角的新鮮血液經過干燥而成，它與鹿茸成分相似[18]。其改善骨密度、抗骨質疏松作用可能與其所含成分有關。Kishi等[19]研究認為，鹿茸血可以通過改善骨組織鎂元素的含量達到抗骨質疏松的作用。
本研究中，在干預1個月時，低、中、高低劑量鹿茸血酒與骨質疏松模型組比較，骨密度差異均有統計學意義（P＜0.05），表明鹿茸血酒有提高去勢大鼠骨密度的功效，并且低中劑量的作用優于高劑量組，以低劑量組更有優勢。本研究的局限之處，在干預 1個月骨密度達到一定改善后，繼續干預更長時間，是否使骨密度繼續增高，還有待進一步研究。
T淋巴細胞亞群的檢測對疾病的發生、發展過程的研究有著極為重要的意義。Pacifici[20]及Nomura等[21]認為，在正常機體中各種T淋巴細胞亞群通過相互作用來維持正常的免疫功能，尤其是CD4+/CD8+比值保持動態平衡是維持機體免疫自穩的中心環節。董萬超等[22]及邱學敏等[23]研究顯示，CD4+細胞數量的減少使B淋巴細胞易被抗原致敏，使血液中的抗體隨之減少。本研究結果表明，鹿茸血酒可使CD4+百分比及CD4+/CD8+比值均升高，可見鹿茸血酒可提高T細胞介導的細胞免疫功能。可能是由于促進了CD4+的分化、發育及成熟過程，增強細胞間的黏附功能，并加強信號傳遞和T淋巴細胞的活化，從而提高機體細胞免疫功能。
綜上所述，本實驗復制了圍絕經期大鼠的動物模型，手術去除雙側卵巢后，灌飼一定劑量的鹿茸血酒進行干預實驗，用雙能X線進行骨密度測定，用流式細胞儀進行淋巴細胞亞群檢測，結果顯示中、低劑量的鹿茸血酒有提高骨密度及正向調節免疫的作用，表明適宜劑量鹿茸血酒可增強去勢大鼠細胞免疫功能，提高其非特異性免疫能力，并增強骨密度。本研究顯示，日常適當飲鹿茸血酒對絕經后骨質疏松有一定的防治作用，并可調節免疫能力。但本研究樣本量較小，本實驗研究周期僅1個月，后期的持久效應未觀察，因此在有條件的情況下，可做進一步研究。
