引用本文： 肖準, 張曜曜, 李尚為. 抗凋亡劑在人卵巢組織新型玻璃化冷凍法中的應用研究. 華西醫學, 2016, 31(11): 1829-1832. doi: 10.7507/1002-0179.201600502 復制
自2004年首例人卵巢組織凍融后自體移植分娩健康女嬰以來，卵巢冷凍已成為近年生殖醫學工程研究的熱點。迄今為止，國外已報道約有30多例卵巢凍存移植后出生的嬰兒[1-4]。隨著冷凍生物學的發展，在人卵巢組織深低溫保存中，玻璃化冷凍已逐漸取代慢速冷凍成為首選冷凍方法，但對于構建理想的人卵巢組織玻璃化冷凍體系尚需深入研究。我們前期研究中，首創了一種新型玻璃化冷凍方法（NIV法），取得了較好的冷凍保存效果[5-6]。在此基礎上，本研究將通過在玻璃化冷凍保護液中添加抗凋亡劑，探討抗凋亡劑是否能進一步改善NIV法冷凍保存效果。現報告如下。
1 資料與方法
1.1 一般資料
收集2012年10月－2013年8月在我院行婦科手術的患者卵巢組織，共10例，年齡22 ～ 33歲，平均27歲；其中5例因卵巢巧克力囊腫行囊腫剝除術，3例因卵巢漿液性囊腺瘤行囊腫剝除術，2例因卵巢畸胎瘤行囊腫剝除術。本研究涉及的人體標本收集過程以及知情同意書經四川大學倫理委員會專家審核批準。
1.2 標本制備
收集送病理檢查后剩余的卵巢皮質組織標本，置于4℃預冷的含10%胎牛血清的L-15培養液中，送至超凈工作臺內。室溫下，用眼科剪快速剔除壞死組織及卵巢髓質后，將卵巢皮質片分割成面積約為2 ～ 3 mm2的組織塊，每例患者標本隨機等量分配到實驗組及對照組。
1.3 NIV法
對照組平衡液采用7.5%（V/V）二甲基亞砜（DMSO）+7.5%（V/V）乙二醇，冷凍液采用15% DMSO +15%乙二醇+0.5 mol/L蔗糖；實驗組平衡液采用7.5%（V/V）DMSO + 7.5%（V/V）乙二醇+100 mg/L 維生素C；冷凍液采用15% DMSO + 15%乙二醇+0.5 mol/L蔗糖+ 100 mg/L維生素C。
采用我們前期已報道的操作方法，在實驗組和對照組中，均采用超細針灸針作為載體[5, 7]。室溫下，在標本收集液中，每根針體上穿入3 ～ 4片卵巢皮質片，用鑷子鉗夾針臂端放入平衡液中10 min；再放入冷凍液中2 min。組織經過充分脫水后，用消毒紗布吸去組織周圍多余的冷凍保護劑，再將針體快速浸入裝有液氮的玻璃化冷凍盒，并在液氮中將穿有皮質片的針灸針裝入充有液氮預冷的冷凍小管中，放入液氮罐中保存。
解凍時，從液氮中快速取出冷凍管，在空氣中晃動10 s后，將針灸針從冷凍管里取出，立即浸于37℃預熱的1 mol/L蔗糖液中，將組織片從針體取下，放置1 mol/L蔗糖液中5 min，使卵巢皮質表面的玻璃化液完全溶解。再將組織片依次放入0.5 mol/L蔗糖液和0.25 mol/L蔗糖液中各5 min。最后，解凍的卵巢組織在基礎液中漂洗3次，在37℃培養箱孵育15 ～ 20 min后備用。
1.4 超微結構透射電子顯微鏡（電鏡）檢測
實驗組和對照組解凍復蘇后的卵巢皮質片放入3%的中性戊二醛中預固定，再放入1%四氧化鋨中固定，經梯度丙醇脫水后由Epon812環氧樹脂浸透包埋，修塊，半薄切片用1%甲苯胺藍染色。選片后，超薄切片行醋酸雙氧鈾-枸櫞酸鉛雙重染色，在透射電鏡（型號H-600IV，日本日立公司生產）上對始基卵泡的卵母細胞、顆粒細胞分別進行檢測、評價。卵母細胞和顆粒細胞細胞膜完整，細胞質密度和線粒體基質密度適中，受損細胞器＜30%被記錄為形態正常[7]。
1.5 原位末端轉移酶標記技術（TUNEL）檢測凋亡
實驗組和對照組解凍復蘇后的卵巢組織經常規TUNEL染色前處理，包括脫水、二甲苯透明、石蠟包埋。按5 μm連續切片，間隔10張進行TUNEL染色。實驗室步驟嚴格按Enzo Life Sciences公司TUNEL檢測試劑盒說明書操作。
光學顯微鏡（光鏡）下對始基卵泡和卵巢間質進行凋亡分析，凋亡判斷標準：① 凋亡陽性始基卵泡：參照Raffaella等[8]所述標準，當一個始基卵泡中卵母細胞染色陽性和（或）卵泡周圍＞50%顆粒細胞染色陽性，則記錄為凋亡陽性始基卵泡，其中以細胞核呈棕黃色染色為陽性細胞的判定標準。始基卵泡凋亡百分率＝凋亡始基卵泡數/總始基卵泡數×100%。② 參照Kim等[9]所述方法，評判間質細胞凋亡面積時，用圖像分析軟件（MMed 6.0）半定量測定：間質凋亡陽性率＝染色陽性的間質細胞面積/組織總面積×100%。
1.6 統計學方法
采用SPSS 13.0軟件進行統計分析。采用P檢驗分析實驗組和對照組超微結構正常的卵母細胞、顆粒細胞和凋亡始基卵泡百分率；凋亡間質細胞百分率采用均數±標準差表示，組間比較采用方差分析。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 實驗組與對照組電鏡形態學比較
對于卵母細胞和顆粒細胞的保存，對照組較實驗組更容易發現細胞質內局部較大區域細胞器消失、空泡出現、線粒體和內質網缺失等現象（圖 1）。與對照組相比，實驗組正常卵母細胞和顆粒細胞百分率均增加，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表 1。
圖1
實驗組和對照組電鏡下卵母細胞和顆粒細胞超微結構分析 a. 實驗組中保存完好的始基卵泡卵母細胞、周圍顆粒細胞和間質。卵母細胞生殖泡核膜清晰，顆粒細胞細胞膜完整清晰，細胞核染色質分布均勻；間質細胞細胞核染色質無明顯凝聚（×8 000） b. 對照組中保存效果不佳的顆粒細胞細胞質內出現空泡，細胞質內局部區域細胞器部分消失，染色質輕度固縮（×6 000）
表1
實驗組和對照組中卵母細胞和顆粒細胞超微結構分析
2.2 實驗組與對照組中始基卵泡和間質凋亡發生率比較
實驗組中，始基卵泡凋亡發生率為21.6%（49/227），對照組中凋亡發生率為38.6%（91/236），對照組中凋亡發生率較實驗組明顯增加，差異有統計學意義（χ2=15.803，P＜0.001）。對于兩組卵巢間質凋亡分析，實驗組中凋亡發生率為（21.33±3.41）%，對照組中凋亡發生率為（33.46±3.09）%，差異有統計學意義（P＜0.001）。見圖 2。
圖2
實驗組和對照組光鏡下始基卵泡和間質凋亡情況（TUNEL法×400） a. 實驗組中未發生凋亡始基卵泡，表現為卵泡中卵母細胞和顆粒細胞未見陽性棕色染色 b. 對照組中發生凋亡始基卵泡，表現為卵母細胞和卵泡周圍顆粒細胞見陽性棕色染色
3 討論
在人卵巢組織深低溫保存中，玻璃化冷凍法同傳統的程序化冷凍法相比，更為經濟、簡便，尤其是其避免了細胞內冰晶對細胞造成的損傷，具有取代程序化冷凍的趨勢。因此，玻璃化冷凍已成為卵巢組織保存研究的新熱點，但對于如何構建理想的玻璃化冷凍體系、如何改善玻璃化冷凍效果已成為亟待解決的關鍵問題。
我們首創了一種高效便捷的玻璃化冷凍方法，即NIV法，采用超細針灸針作為載體，大幅提高了冷凍速率，在小鼠和人卵巢組織深低溫保存中，通過形態學、超微結構、活性檢測、體外培養和激素測定等指標的評價，發現該方法較傳統慢速冷凍和滴入法玻璃化冷凍保存效果更好[5-7, 10-12]。為了進一步改善NIV法效果，減少高濃度冷凍保護劑對組織的細胞毒性損傷，優化冷凍保護劑配伍是一種有益的嘗試。近年來，有報道為了提高冷凍保護劑的保護效果，通過在冷凍保護劑中添加小牛血清、人體白蛋白和聚乙烯吡咯烷酮等成分均取得了較好的卵巢組織保存效果[13]。Abir等[14]報道在人卵巢組織異種移植時，給予宿主抗凋亡劑維生素E預處理，或者將準備移植的人卵巢皮質片用含維生素E的培養液預培養，均能提高卵巢組織移植后效果，提示維生素E的抗凋亡作用有助于卵巢組織保護。以上研究給我們啟示，在人卵巢組織冷凍中，通過在冷凍保護液中添加抗凋亡劑可能會改善冷凍保存效果。
在前期研究中，我們將抗氧化劑維生素C添加到慢速冷凍保護劑中，利用其抗氧化作用，阻止死亡受體介導的凋亡過程的發生，取得了較好的冷凍保護效果[15]。本研究中，在人卵巢組織NIV法中，保護劑中添加抗凋亡劑維生素C，探討維生素C是否能通過抗凋亡作用進一步提高玻璃化冷凍對人卵巢組織保護作用。通過透射電鏡下觀察卵母細胞和顆粒細胞保存效果發現，未添加維生素C的對照組中更容易發現細胞質內局部較大區域細胞器消失、空泡出現、線粒體和內質網缺失等現象。與對照組相比，添加維生素C的實驗組正常卵母細胞和顆粒細胞百分率均增加（P＜0.05）。而在凋亡發生率檢測中，與對照組相比較，實驗組始基卵泡和間質細胞凋亡發生率均降低（P＜0.05），提示添加維生素C可能更好地保護卵巢組織及始基卵泡的發育潛能。以上研究結果提示，添加抗凋亡劑能通過抗凋亡作用促進始基卵泡及周圍間質細胞的保存效果，進一步提高了新型玻璃化冷凍保護效果。
總之，在構建理想的玻璃化冷凍體系中，冷凍保護劑中使用凋亡抑制劑干預凋亡的發生，能通過抗凋亡作用改善卵巢組織保存效果。這為我們建立理想的玻璃化冷凍體系，解決改善玻璃化冷凍效果這一亟待解決的關鍵問題提供了重要思路和實驗依據。
自2004年首例人卵巢組織凍融后自體移植分娩健康女嬰以來，卵巢冷凍已成為近年生殖醫學工程研究的熱點。迄今為止，國外已報道約有30多例卵巢凍存移植后出生的嬰兒[1-4]。隨著冷凍生物學的發展，在人卵巢組織深低溫保存中，玻璃化冷凍已逐漸取代慢速冷凍成為首選冷凍方法，但對于構建理想的人卵巢組織玻璃化冷凍體系尚需深入研究。我們前期研究中，首創了一種新型玻璃化冷凍方法（NIV法），取得了較好的冷凍保存效果[5-6]。在此基礎上，本研究將通過在玻璃化冷凍保護液中添加抗凋亡劑，探討抗凋亡劑是否能進一步改善NIV法冷凍保存效果。現報告如下。
1 資料與方法
1.1 一般資料
收集2012年10月－2013年8月在我院行婦科手術的患者卵巢組織，共10例，年齡22 ～ 33歲，平均27歲；其中5例因卵巢巧克力囊腫行囊腫剝除術，3例因卵巢漿液性囊腺瘤行囊腫剝除術，2例因卵巢畸胎瘤行囊腫剝除術。本研究涉及的人體標本收集過程以及知情同意書經四川大學倫理委員會專家審核批準。
1.2 標本制備
收集送病理檢查后剩余的卵巢皮質組織標本，置于4℃預冷的含10%胎牛血清的L-15培養液中，送至超凈工作臺內。室溫下，用眼科剪快速剔除壞死組織及卵巢髓質后，將卵巢皮質片分割成面積約為2 ～ 3 mm2的組織塊，每例患者標本隨機等量分配到實驗組及對照組。
1.3 NIV法
對照組平衡液采用7.5%（V/V）二甲基亞砜（DMSO）+7.5%（V/V）乙二醇，冷凍液采用15% DMSO +15%乙二醇+0.5 mol/L蔗糖；實驗組平衡液采用7.5%（V/V）DMSO + 7.5%（V/V）乙二醇+100 mg/L 維生素C；冷凍液采用15% DMSO + 15%乙二醇+0.5 mol/L蔗糖+ 100 mg/L維生素C。
采用我們前期已報道的操作方法，在實驗組和對照組中，均采用超細針灸針作為載體[5, 7]。室溫下，在標本收集液中，每根針體上穿入3 ～ 4片卵巢皮質片，用鑷子鉗夾針臂端放入平衡液中10 min；再放入冷凍液中2 min。組織經過充分脫水后，用消毒紗布吸去組織周圍多余的冷凍保護劑，再將針體快速浸入裝有液氮的玻璃化冷凍盒，并在液氮中將穿有皮質片的針灸針裝入充有液氮預冷的冷凍小管中，放入液氮罐中保存。
解凍時，從液氮中快速取出冷凍管，在空氣中晃動10 s后，將針灸針從冷凍管里取出，立即浸于37℃預熱的1 mol/L蔗糖液中，將組織片從針體取下，放置1 mol/L蔗糖液中5 min，使卵巢皮質表面的玻璃化液完全溶解。再將組織片依次放入0.5 mol/L蔗糖液和0.25 mol/L蔗糖液中各5 min。最后，解凍的卵巢組織在基礎液中漂洗3次，在37℃培養箱孵育15 ～ 20 min后備用。
1.4 超微結構透射電子顯微鏡（電鏡）檢測
實驗組和對照組解凍復蘇后的卵巢皮質片放入3%的中性戊二醛中預固定，再放入1%四氧化鋨中固定，經梯度丙醇脫水后由Epon812環氧樹脂浸透包埋，修塊，半薄切片用1%甲苯胺藍染色。選片后，超薄切片行醋酸雙氧鈾-枸櫞酸鉛雙重染色，在透射電鏡（型號H-600IV，日本日立公司生產）上對始基卵泡的卵母細胞、顆粒細胞分別進行檢測、評價。卵母細胞和顆粒細胞細胞膜完整，細胞質密度和線粒體基質密度適中，受損細胞器＜30%被記錄為形態正常[7]。
1.5 原位末端轉移酶標記技術（TUNEL）檢測凋亡
實驗組和對照組解凍復蘇后的卵巢組織經常規TUNEL染色前處理，包括脫水、二甲苯透明、石蠟包埋。按5 μm連續切片，間隔10張進行TUNEL染色。實驗室步驟嚴格按Enzo Life Sciences公司TUNEL檢測試劑盒說明書操作。
光學顯微鏡（光鏡）下對始基卵泡和卵巢間質進行凋亡分析，凋亡判斷標準：① 凋亡陽性始基卵泡：參照Raffaella等[8]所述標準，當一個始基卵泡中卵母細胞染色陽性和（或）卵泡周圍＞50%顆粒細胞染色陽性，則記錄為凋亡陽性始基卵泡，其中以細胞核呈棕黃色染色為陽性細胞的判定標準。始基卵泡凋亡百分率＝凋亡始基卵泡數/總始基卵泡數×100%。② 參照Kim等[9]所述方法，評判間質細胞凋亡面積時，用圖像分析軟件（MMed 6.0）半定量測定：間質凋亡陽性率＝染色陽性的間質細胞面積/組織總面積×100%。
1.6 統計學方法
采用SPSS 13.0軟件進行統計分析。采用P檢驗分析實驗組和對照組超微結構正常的卵母細胞、顆粒細胞和凋亡始基卵泡百分率；凋亡間質細胞百分率采用均數±標準差表示，組間比較采用方差分析。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 實驗組與對照組電鏡形態學比較
對于卵母細胞和顆粒細胞的保存，對照組較實驗組更容易發現細胞質內局部較大區域細胞器消失、空泡出現、線粒體和內質網缺失等現象（圖 1）。與對照組相比，實驗組正常卵母細胞和顆粒細胞百分率均增加，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表 1。
圖1
實驗組和對照組電鏡下卵母細胞和顆粒細胞超微結構分析 a. 實驗組中保存完好的始基卵泡卵母細胞、周圍顆粒細胞和間質。卵母細胞生殖泡核膜清晰，顆粒細胞細胞膜完整清晰，細胞核染色質分布均勻；間質細胞細胞核染色質無明顯凝聚（×8 000） b. 對照組中保存效果不佳的顆粒細胞細胞質內出現空泡，細胞質內局部區域細胞器部分消失，染色質輕度固縮（×6 000）
表1
實驗組和對照組中卵母細胞和顆粒細胞超微結構分析
2.2 實驗組與對照組中始基卵泡和間質凋亡發生率比較
實驗組中，始基卵泡凋亡發生率為21.6%（49/227），對照組中凋亡發生率為38.6%（91/236），對照組中凋亡發生率較實驗組明顯增加，差異有統計學意義（χ2=15.803，P＜0.001）。對于兩組卵巢間質凋亡分析，實驗組中凋亡發生率為（21.33±3.41）%，對照組中凋亡發生率為（33.46±3.09）%，差異有統計學意義（P＜0.001）。見圖 2。
圖2
實驗組和對照組光鏡下始基卵泡和間質凋亡情況（TUNEL法×400） a. 實驗組中未發生凋亡始基卵泡，表現為卵泡中卵母細胞和顆粒細胞未見陽性棕色染色 b. 對照組中發生凋亡始基卵泡，表現為卵母細胞和卵泡周圍顆粒細胞見陽性棕色染色
3 討論
在人卵巢組織深低溫保存中，玻璃化冷凍法同傳統的程序化冷凍法相比，更為經濟、簡便，尤其是其避免了細胞內冰晶對細胞造成的損傷，具有取代程序化冷凍的趨勢。因此，玻璃化冷凍已成為卵巢組織保存研究的新熱點，但對于如何構建理想的玻璃化冷凍體系、如何改善玻璃化冷凍效果已成為亟待解決的關鍵問題。
我們首創了一種高效便捷的玻璃化冷凍方法，即NIV法，采用超細針灸針作為載體，大幅提高了冷凍速率，在小鼠和人卵巢組織深低溫保存中，通過形態學、超微結構、活性檢測、體外培養和激素測定等指標的評價，發現該方法較傳統慢速冷凍和滴入法玻璃化冷凍保存效果更好[5-7, 10-12]。為了進一步改善NIV法效果，減少高濃度冷凍保護劑對組織的細胞毒性損傷，優化冷凍保護劑配伍是一種有益的嘗試。近年來，有報道為了提高冷凍保護劑的保護效果，通過在冷凍保護劑中添加小牛血清、人體白蛋白和聚乙烯吡咯烷酮等成分均取得了較好的卵巢組織保存效果[13]。Abir等[14]報道在人卵巢組織異種移植時，給予宿主抗凋亡劑維生素E預處理，或者將準備移植的人卵巢皮質片用含維生素E的培養液預培養，均能提高卵巢組織移植后效果，提示維生素E的抗凋亡作用有助于卵巢組織保護。以上研究給我們啟示，在人卵巢組織冷凍中，通過在冷凍保護液中添加抗凋亡劑可能會改善冷凍保存效果。
在前期研究中，我們將抗氧化劑維生素C添加到慢速冷凍保護劑中，利用其抗氧化作用，阻止死亡受體介導的凋亡過程的發生，取得了較好的冷凍保護效果[15]。本研究中，在人卵巢組織NIV法中，保護劑中添加抗凋亡劑維生素C，探討維生素C是否能通過抗凋亡作用進一步提高玻璃化冷凍對人卵巢組織保護作用。通過透射電鏡下觀察卵母細胞和顆粒細胞保存效果發現，未添加維生素C的對照組中更容易發現細胞質內局部較大區域細胞器消失、空泡出現、線粒體和內質網缺失等現象。與對照組相比，添加維生素C的實驗組正常卵母細胞和顆粒細胞百分率均增加（P＜0.05）。而在凋亡發生率檢測中，與對照組相比較，實驗組始基卵泡和間質細胞凋亡發生率均降低（P＜0.05），提示添加維生素C可能更好地保護卵巢組織及始基卵泡的發育潛能。以上研究結果提示，添加抗凋亡劑能通過抗凋亡作用促進始基卵泡及周圍間質細胞的保存效果，進一步提高了新型玻璃化冷凍保護效果。
總之，在構建理想的玻璃化冷凍體系中，冷凍保護劑中使用凋亡抑制劑干預凋亡的發生，能通過抗凋亡作用改善卵巢組織保存效果。這為我們建立理想的玻璃化冷凍體系，解決改善玻璃化冷凍效果這一亟待解決的關鍵問題提供了重要思路和實驗依據。
