引用本文： 卿勇, 王蓮, 夏登梅, 張然, 徐飛, 閆薇, 李薇. 32例活動期尋常型天皰瘡患者血清免疫球蛋白G4水平分析. 華西醫學, 2016, 31(11): 1822-1825. doi: 10.7507/1002-0179.201600500 復制
尋常型天皰瘡（PV）是天皰瘡最常見和最具有代表性的一種類型，目前認為它主要是由橋粒芯糖蛋白（Dsg）3自身免疫球蛋白（Ig）G所致的人類自身免疫性大皰病。致病性的IgG結合在Dsg3的胞外域，伴或不伴與Dsg1的胞外域結合，可導致橋粒解體，細胞間黏附缺失，組織學上出現基底層上方棘層細胞松解，形成裂隙或水皰，臨床上表現為口腔黏膜及皮膚的水皰、大皰，皰易破裂呈糜爛面[1]。按照疾病進程可將PV分為活動期及緩解期，Spaeth等[2]將活動期分為急性起始階段及慢性活動期，前者指在原先未受累的皮膚黏膜首次出現水皰和（或）糜爛，后者指皮膚黏膜現有的水皰和（或）糜爛持續存在和（或）不斷發展；緩解期指持續2個月及以上的皮膚黏膜無新發皮損。IgG4是IgG的一種亞型，其在自身免疫性疾病中逐漸受到重視，如自身免疫性胰腺炎等IgG4相關性疾病[3]，IgG4在PV的發病機制研究越來越得到專家們的重視。Ayatollahi等[4]通過檢測PV患者血清IgG4水平，發現其在活動期血清IgG4水平升高，而在緩解期血清IgG4水平降低，認為其可以作為疾病活動期的一個重要指標；但也有部分學者持否定觀點，認為血清IgG4水平與活動期PV患者無相關性，無明顯升高或降低規律。我們通過總結2014年4月－12月到四川大學華西醫院門診及住院部就診的活動期PV患者血清IgG4水平情況，尋找其可能存在的變化規律。現報告如下。
1 資料與方法
1.1 研究對象
選取2014年4月－12月就診于四川大學華西醫院皮膚科門診及住院部的患者。
納入標準：經過臨床表現、組織病理學及直接免疫熒光證實為PV，Dsg3檢測為陽性并且符合PV活動期診斷標準，臨床表現為黏膜伴或不伴皮膚反復新發的水皰、大皰和（或）鮮紅色糜爛面，新發皮損間隔時間最長不超過2個月，棘細胞松解征（尼氏征）陽性，符合疾病活動期[2]。
排除標準：① IgG4相關性疾病[3, 5]；② 使用利妥昔單抗等生物制劑[6-7]。
剔除標準：① 不符合納入標準而被誤納入的患者；② 治療過程中依從性差，配合不好的患者；③ 治療過程中，拒絕抽血者；④ 患者血樣不合格者；⑤ 試驗檢測不合格，對試驗結果有影響患者；⑥ 資料不全，影響有效性和安全性判斷患者。
1.2 試劑與儀器
1.2.1 主要試劑
普通試劑：磷酸鹽緩沖液（pH值7.2）、二甲苯（分析純）、乙醇（分析純）、枸櫞酸鈉（分析純）、過氧化氫（分析純）、磷酸氫二鈉（分析純）及磷酸二氫鉀（分析純）（重慶川東化工有限公司）。第一抗體：鼠抗人單克隆抗體（福州邁新生物技術開發有限公司）。第二抗體：兔鼠通用型抗體（福州邁新生物技術開發有限公司）。
1.2.2 主要儀器
離心機（Allegra X-12 Centrifuge，美國BECKMAN Coulter公司），BNⅡ全自動蛋白分析儀（德國SIEMENS公司），微量加樣槍，65℃烤箱，37℃恒溫箱。
1.3 血清IgG4檢測方法
所有研究對象均空腹采集外周血，采用離心機3 500 r/min離心10 min，分離血清。運用BNⅡ全自動蛋白分析儀測定血清IgG4濃度，所有步驟均由系統自動完成：① 將待測血清及IgG4試劑盒放入儀器指定卡槽；② 儀器自動將待測血清與磷酸鹽緩沖液（pH值7.2 ）按1：2 000的比例稀釋待測血清，稀釋液必須在4 h內測量；③ 自動吸取5 μL血清樣本與25 μL IgG4免疫試劑盒進行預試驗，自動分析抗原與抗體比例是否協調，若讀數超出檢測范圍（0.052～3.3 g/L），則使用更高或更低的稀釋倍數進行樣本的重復檢測，直到達到平衡；④ 自動吸取血清樣本50 μL與IgG4免疫試劑盒50 μL，37℃下孵育10 min；⑤ BNⅡ全自動蛋白分析儀根據已知參考曲線檢測出IgG4濃度。
1.4 觀察指標
觀察患者血清IgG4水平以及活動期類型，并與正常人群血清IgG4水平進行比較。正常人群血清IgG4水平參考范圍為0.035～1.500 g/L，平均值為0.768 g/L。并同時記錄患者的一般資料，如姓名、性別、年齡、既往史、家族史等。
1.5 統計學方法
所有數據均采用SPSS 20.0統計軟件進行處理。計量資料以均數±標準差表示，與實驗室正常血清IgG4水平差異分析采用單樣本t檢驗，急性起始階段與慢性活動期IgG4水平差異比較采用獨立樣本t檢驗。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 患者一般資料
共入選了32例PV患者。其中，男12例，女20例，男女性別比例為1︰1.7；年齡23～67歲，平均（44.7±10.0）歲；8例來自皮膚科門診，24例來自皮膚科住院部。所有患者均處于活動期，7例處于急性起始階段（男2例、女5例，均無糖皮質激素使用史），25例處于慢性活動期（男10例、女15例，均有糖皮質激素系統使用史）。所有患者既往史、家族史均無特殊，無剔除病例。
2.2 PV患者血清IgG4水平
32例患者血清IgG4濃度平均為（1.049± 1.061）g/L，其中血清IgG4在正常范圍內的患者22例（男8例、女14例），IgG4升高8例（男3例、女5例），血清IgG4水平下降2例（男女各1例）。
所檢測32例患者與正常人群血清IgG4水平平均值比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。急性起始階段[（44.3±8.2）歲]和慢性活動期[（44.8±10.6）歲]PV患者年齡比較差異無統計學意義（t=0.115，P=0.909），雖急性起始階段的血清IgG4水平[（1.015±0.825） g/L]較慢性活動期[（1.058±1.133）g/L]偏低，但兩組比較差異亦無統計學意義（t=0.093，P=0.927）。
3 討論
IgG4是IgG的一種較為罕見的亞型，對靶抗原的親和力差，不能結合C1q補體及激活經典補體途徑，不能活化補體，但能抑制其他亞型免疫復合物形成，從而發揮免疫調節作用[8-9]。有研究認為可以將其作為自身抗體介導疾病中針對自身抗原所致慢性免疫反應的抗體特殊標志物，尤其是在活動期PV中起重要作用[10]。然而，也有研究認為分泌IgG4的效應B細胞可以存在于任何炎性疾病中，因而PV患者IgG4的水平情況并無特異性[11]。本研究運用免疫散射比濁法探討了32例活動期PV患者血清IgG4水平，其在正常范圍內的患者共有22例，升高者8例，另2例患者血清IgG4水平下降。我們認為血清IgG4水平變化難以作為PV患者病情活躍的判斷指標。
IgG4屬于IgG中一種較為少見的亞型，主要在高劑量過敏原暴露情況下產生，如養蜂人或者接受脫敏治療的患者體內可以檢測到高水平的IgG4，起到抗過敏作用，其產生主要受到調節性B細胞的調節[12]。PV是具有遺傳易感性的個體在多種因素作用下，激發自身抗原抗體作用的器官特異性自身免疫病，其發病機制除抗Dsg3 IgG抗體與Dsg3相互作用，還可能涉及2型輔助T細胞（Th2）等細胞及相應細胞因子的參與[13]。Th2可以促進B細胞生長活化和分化，產生IgG抗體介導的體液免疫，促進其他亞型IgG向IgG4轉變，這可能是部分PV患者活動期IgG4水平升高的原因。但正如前文提及，目前關于IgG4在PV中的作用并未得到完全證實，其在疾病活動期的變化情況無特異性，可以表現為升高、降低或在正常范圍內。
此外，就急性起始階段和慢性活動期PV患者IgG4水平差異目前未見相關文獻提及，而我們的觀察表明了急性起始階段和慢性活動期PV患者IgG4水平比較差異無統計學意義（P＞0.05），可能非足量糖皮質激素等免疫抑制劑的干預對其無影響。
PV是自身免疫性抗體介導的水皰性疾病，該抗體主要為IgG型，它分為4個亞型，包括IgG1、IgG2、IgG3、IgG4，在正常人中含量分別為65%、23%、8%、4%[14]。其中IgG4被認為是PV最重要的致病性抗體并與患者疾病嚴重程度相關[4]。有學者將間接免疫熒光和酶聯免疫吸附測定IgG4進行對比，均證實IgG4是PV的主要致病性抗體[15]。對于血清IgG4升高的患者在經過Ig等治療后，隨著皮損好轉，血清中IgG4水平明顯下降[16]。PV患者與正常人口腔黏膜組織IgG4和IgG免疫組織化學顯示，在正常人的黏膜中有少量IgG在細胞周呈間斷性線狀陽性，未檢測到IgG4。而在PV患者黏膜組織中可見IgG4在細胞周線狀及點狀沉積，IgG在細胞周呈線狀沉積[11]，間接說明IgG4為PV的致病性抗體。直接免疫熒光作為PV診斷標準之一，它主要表現為角質形成細胞（復層鱗狀上皮細胞）間網狀沉積的IgG。IgG4作為其中的一個亞型，我們推測其在這些細胞間呈現的模式一致。可通過血清IgG4水平與組織IgG4表達進行比較驗證其相關性，這將是進一步研究的內容。
因此，我們認為尚不能將PV患者血清IgG4水平變化作為病情活躍的血清生物學標志。建議后續的研究中設置對照組、擴大樣本量并且長期隨訪這些患者的IgG4水平，以開展進一步的研究和探討。
尋常型天皰瘡（PV）是天皰瘡最常見和最具有代表性的一種類型，目前認為它主要是由橋粒芯糖蛋白（Dsg）3自身免疫球蛋白（Ig）G所致的人類自身免疫性大皰病。致病性的IgG結合在Dsg3的胞外域，伴或不伴與Dsg1的胞外域結合，可導致橋粒解體，細胞間黏附缺失，組織學上出現基底層上方棘層細胞松解，形成裂隙或水皰，臨床上表現為口腔黏膜及皮膚的水皰、大皰，皰易破裂呈糜爛面[1]。按照疾病進程可將PV分為活動期及緩解期，Spaeth等[2]將活動期分為急性起始階段及慢性活動期，前者指在原先未受累的皮膚黏膜首次出現水皰和（或）糜爛，后者指皮膚黏膜現有的水皰和（或）糜爛持續存在和（或）不斷發展；緩解期指持續2個月及以上的皮膚黏膜無新發皮損。IgG4是IgG的一種亞型，其在自身免疫性疾病中逐漸受到重視，如自身免疫性胰腺炎等IgG4相關性疾病[3]，IgG4在PV的發病機制研究越來越得到專家們的重視。Ayatollahi等[4]通過檢測PV患者血清IgG4水平，發現其在活動期血清IgG4水平升高，而在緩解期血清IgG4水平降低，認為其可以作為疾病活動期的一個重要指標；但也有部分學者持否定觀點，認為血清IgG4水平與活動期PV患者無相關性，無明顯升高或降低規律。我們通過總結2014年4月－12月到四川大學華西醫院門診及住院部就診的活動期PV患者血清IgG4水平情況，尋找其可能存在的變化規律。現報告如下。
1 資料與方法
1.1 研究對象
選取2014年4月－12月就診于四川大學華西醫院皮膚科門診及住院部的患者。
納入標準：經過臨床表現、組織病理學及直接免疫熒光證實為PV，Dsg3檢測為陽性并且符合PV活動期診斷標準，臨床表現為黏膜伴或不伴皮膚反復新發的水皰、大皰和（或）鮮紅色糜爛面，新發皮損間隔時間最長不超過2個月，棘細胞松解征（尼氏征）陽性，符合疾病活動期[2]。
排除標準：① IgG4相關性疾病[3, 5]；② 使用利妥昔單抗等生物制劑[6-7]。
剔除標準：① 不符合納入標準而被誤納入的患者；② 治療過程中依從性差，配合不好的患者；③ 治療過程中，拒絕抽血者；④ 患者血樣不合格者；⑤ 試驗檢測不合格，對試驗結果有影響患者；⑥ 資料不全，影響有效性和安全性判斷患者。
1.2 試劑與儀器
1.2.1 主要試劑
普通試劑：磷酸鹽緩沖液（pH值7.2）、二甲苯（分析純）、乙醇（分析純）、枸櫞酸鈉（分析純）、過氧化氫（分析純）、磷酸氫二鈉（分析純）及磷酸二氫鉀（分析純）（重慶川東化工有限公司）。第一抗體：鼠抗人單克隆抗體（福州邁新生物技術開發有限公司）。第二抗體：兔鼠通用型抗體（福州邁新生物技術開發有限公司）。
1.2.2 主要儀器
離心機（Allegra X-12 Centrifuge，美國BECKMAN Coulter公司），BNⅡ全自動蛋白分析儀（德國SIEMENS公司），微量加樣槍，65℃烤箱，37℃恒溫箱。
1.3 血清IgG4檢測方法
所有研究對象均空腹采集外周血，采用離心機3 500 r/min離心10 min，分離血清。運用BNⅡ全自動蛋白分析儀測定血清IgG4濃度，所有步驟均由系統自動完成：① 將待測血清及IgG4試劑盒放入儀器指定卡槽；② 儀器自動將待測血清與磷酸鹽緩沖液（pH值7.2 ）按1：2 000的比例稀釋待測血清，稀釋液必須在4 h內測量；③ 自動吸取5 μL血清樣本與25 μL IgG4免疫試劑盒進行預試驗，自動分析抗原與抗體比例是否協調，若讀數超出檢測范圍（0.052～3.3 g/L），則使用更高或更低的稀釋倍數進行樣本的重復檢測，直到達到平衡；④ 自動吸取血清樣本50 μL與IgG4免疫試劑盒50 μL，37℃下孵育10 min；⑤ BNⅡ全自動蛋白分析儀根據已知參考曲線檢測出IgG4濃度。
1.4 觀察指標
觀察患者血清IgG4水平以及活動期類型，并與正常人群血清IgG4水平進行比較。正常人群血清IgG4水平參考范圍為0.035～1.500 g/L，平均值為0.768 g/L。并同時記錄患者的一般資料，如姓名、性別、年齡、既往史、家族史等。
1.5 統計學方法
所有數據均采用SPSS 20.0統計軟件進行處理。計量資料以均數±標準差表示，與實驗室正常血清IgG4水平差異分析采用單樣本t檢驗，急性起始階段與慢性活動期IgG4水平差異比較采用獨立樣本t檢驗。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 患者一般資料
共入選了32例PV患者。其中，男12例，女20例，男女性別比例為1︰1.7；年齡23～67歲，平均（44.7±10.0）歲；8例來自皮膚科門診，24例來自皮膚科住院部。所有患者均處于活動期，7例處于急性起始階段（男2例、女5例，均無糖皮質激素使用史），25例處于慢性活動期（男10例、女15例，均有糖皮質激素系統使用史）。所有患者既往史、家族史均無特殊，無剔除病例。
2.2 PV患者血清IgG4水平
32例患者血清IgG4濃度平均為（1.049± 1.061）g/L，其中血清IgG4在正常范圍內的患者22例（男8例、女14例），IgG4升高8例（男3例、女5例），血清IgG4水平下降2例（男女各1例）。
所檢測32例患者與正常人群血清IgG4水平平均值比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。急性起始階段[（44.3±8.2）歲]和慢性活動期[（44.8±10.6）歲]PV患者年齡比較差異無統計學意義（t=0.115，P=0.909），雖急性起始階段的血清IgG4水平[（1.015±0.825） g/L]較慢性活動期[（1.058±1.133）g/L]偏低，但兩組比較差異亦無統計學意義（t=0.093，P=0.927）。
3 討論
IgG4是IgG的一種較為罕見的亞型，對靶抗原的親和力差，不能結合C1q補體及激活經典補體途徑，不能活化補體，但能抑制其他亞型免疫復合物形成，從而發揮免疫調節作用[8-9]。有研究認為可以將其作為自身抗體介導疾病中針對自身抗原所致慢性免疫反應的抗體特殊標志物，尤其是在活動期PV中起重要作用[10]。然而，也有研究認為分泌IgG4的效應B細胞可以存在于任何炎性疾病中，因而PV患者IgG4的水平情況并無特異性[11]。本研究運用免疫散射比濁法探討了32例活動期PV患者血清IgG4水平，其在正常范圍內的患者共有22例，升高者8例，另2例患者血清IgG4水平下降。我們認為血清IgG4水平變化難以作為PV患者病情活躍的判斷指標。
IgG4屬于IgG中一種較為少見的亞型，主要在高劑量過敏原暴露情況下產生，如養蜂人或者接受脫敏治療的患者體內可以檢測到高水平的IgG4，起到抗過敏作用，其產生主要受到調節性B細胞的調節[12]。PV是具有遺傳易感性的個體在多種因素作用下，激發自身抗原抗體作用的器官特異性自身免疫病，其發病機制除抗Dsg3 IgG抗體與Dsg3相互作用，還可能涉及2型輔助T細胞（Th2）等細胞及相應細胞因子的參與[13]。Th2可以促進B細胞生長活化和分化，產生IgG抗體介導的體液免疫，促進其他亞型IgG向IgG4轉變，這可能是部分PV患者活動期IgG4水平升高的原因。但正如前文提及，目前關于IgG4在PV中的作用并未得到完全證實，其在疾病活動期的變化情況無特異性，可以表現為升高、降低或在正常范圍內。
此外，就急性起始階段和慢性活動期PV患者IgG4水平差異目前未見相關文獻提及，而我們的觀察表明了急性起始階段和慢性活動期PV患者IgG4水平比較差異無統計學意義（P＞0.05），可能非足量糖皮質激素等免疫抑制劑的干預對其無影響。
PV是自身免疫性抗體介導的水皰性疾病，該抗體主要為IgG型，它分為4個亞型，包括IgG1、IgG2、IgG3、IgG4，在正常人中含量分別為65%、23%、8%、4%[14]。其中IgG4被認為是PV最重要的致病性抗體并與患者疾病嚴重程度相關[4]。有學者將間接免疫熒光和酶聯免疫吸附測定IgG4進行對比，均證實IgG4是PV的主要致病性抗體[15]。對于血清IgG4升高的患者在經過Ig等治療后，隨著皮損好轉，血清中IgG4水平明顯下降[16]。PV患者與正常人口腔黏膜組織IgG4和IgG免疫組織化學顯示，在正常人的黏膜中有少量IgG在細胞周呈間斷性線狀陽性，未檢測到IgG4。而在PV患者黏膜組織中可見IgG4在細胞周線狀及點狀沉積，IgG在細胞周呈線狀沉積[11]，間接說明IgG4為PV的致病性抗體。直接免疫熒光作為PV診斷標準之一，它主要表現為角質形成細胞（復層鱗狀上皮細胞）間網狀沉積的IgG。IgG4作為其中的一個亞型，我們推測其在這些細胞間呈現的模式一致。可通過血清IgG4水平與組織IgG4表達進行比較驗證其相關性，這將是進一步研究的內容。
因此，我們認為尚不能將PV患者血清IgG4水平變化作為病情活躍的血清生物學標志。建議后續的研究中設置對照組、擴大樣本量并且長期隨訪這些患者的IgG4水平，以開展進一步的研究和探討。