引用本文： 劉中均, 馮光富, 皮鳳娟, 涂禾, 朱力陽, 龐超平. 正交試驗優選紫蒲痛風合劑的提取工藝. 華西醫學, 2016, 31(10): 1693-1696. doi: 10.7507/1002-0179.201600466 復制
近年來，痛風的患病率呈逐年遞增趨勢，已成為風濕病領域的關注焦點[1]。中醫藥治療痛風在辨證論治和處方用藥上具有明顯的優勢，能有效減輕患者病痛，且不良反應少，價格低廉[2]。紫蒲痛風合劑由紫花地丁、蒲公英、野菊花、忍冬藤等中藥組成，具有清熱利濕、消腫止痛的功效，臨床用于治療濕熱蘊結型痛風。該藥作為我院協定處方已應用了10余年，療效確切，有較好的應用前景。臨床使用是以湯劑形式，因藥物量較大，煎煮后的藥液量多，患者服用困難，不便攜帶，故擬開發為合劑。為了制備安全、有效、經濟的紫蒲痛風合劑，我們對其藥物提取工藝進行了研究，以水提浸膏收得率和綠原酸總含量為考察指標，采用正交試驗進行優化，為后續的大量生產提供理論依據。現報告如下。
1 材料與方法
1.1 儀器與材料
1.1.1 儀器
Waters 1525 Binary高效液相色譜（HPLC）儀（美國Waters公司），Waters 2487紫外檢測儀（美國Waters公司）；XS105電子天平（瑞士Mettler Toledo公司）；SB3200超聲波提取器（上海必能信公司）；AYJ1-0501-U超純水機（重慶艾科浦公司）。
1.1.2 材料
紫花地丁、蒲公英、野菊花、忍冬藤等由四川省中藥飲片公司提供；綠原酸（中國食品藥品檢定研究院提供，批號：110753-201415）；乙腈、甲醇為色譜純，水為超純水，其余試劑為分析純。
1.2 正交試驗設計
根據該協定處方在臨床應用情況和該研究的目的，選擇以水為提取溶媒，對水的用量、提取次數和每次提取時間作為研究的主要影響因素，采用L9（34）正交表進行試驗設計。正交試驗因素及水平見表 1。
表1
L9（34）正交試驗因素及水平
1.3 藥材提取液的制備
按處方比例取飲片共100 g，9份，根據L9（34）正交表安排試驗[3-4]，按表 1條件進行加熱提取，過濾，收集提取液，準確測定其體積。
1.4 評價指標及其測定方法
1.4.1 浸膏收得率的測定
精密吸取1.3項下提取液50 mL，置已干燥至恒重的蒸發皿中，水浴上蒸干，105℃干燥3 h，置干燥器中冷卻至室溫，迅速稱量，得到浸膏質量。浸膏收得率=（浸膏質量/50）×藥液體積/藥物總質量×100%。
1.4.2 綠原酸轉移率的測定
①色譜條件：色譜柱為SymmetryShield RP18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相為乙腈?0.4%磷酸溶液（10:90）；檢測波長為327 nm；進樣量為10 μL；柱溫為25℃[5]。
②對照品溶液的制備：取綠原酸對照品4.8 mg，精密稱定，加100 mL 50%甲醇制成0.48 μg/mL的對照品溶液，備用[6]。
③供試品溶液的制備：精密吸取1.3項下提取液5 mL，置10 mL量瓶中，精密加入50%甲醇稀釋至刻度，超聲處理10 min，放冷，搖勻，濾過，取續濾液，即得。
④陰性樣品溶液的制備：按處方量稱取不含忍冬藤和野菊花的其余藥材，按③項下供試品溶液制備方法制備陰性樣品溶液。
⑤方法專屬性：分別精密吸取對照品溶液、供試品溶液、陰性樣品溶液各10 μL，注入HPLC儀，按①項下色譜條件進行檢測，記錄色譜峰。
⑥標準曲線的繪制：分別精密吸取對照品溶液2、4、6、8、10 μL。按①項下色譜條件依次進樣，測定其峰面積。以相應的峰面積為縱坐標，進行線性回歸[7-8]。
⑦精密度試驗：精密吸取混合對照品溶液10 μL，連續進樣5次，測定峰面積。
⑧加樣回收率試驗：精密吸取綠原酸對照品溶液（0.48 μg/mL）5 mL分別置于5個相同規格的10 mL容量瓶中，再分別吸取5個已知含量的供試品溶液1 mL，50%甲醇定容，按③項下方法制備加樣回收率實驗樣品。按①項下色譜條件進行檢測，記錄色譜峰及峰面積，計算回收率。
⑨穩定性試驗：精密吸取③項下供試品溶液10 μL，分別于0、2、4、6、8、12 h進樣測定6次，測定峰面積。
⑩綠原酸轉移率測定：將正交試驗各試驗組供試品溶液經0.45 μm微孔濾膜濾過，按①項下色譜條件進行檢測，分別進樣10 μL，測定峰面積，計算各供試品溶液中綠原酸的含量。原藥材中綠原酸含量按《中國藥典》2015年版中忍冬藤和野菊花項下方法測定。綠原酸轉移率=供試品中綠原酸含量/原藥材中綠原酸含量×100%。
1.4.3 綜合評分
以提取的浸膏收得率和綠原酸轉移率進行綜合評分[9-10]，綜合評分=綠原酸轉移率/最高綠原酸轉移率×60+浸膏收得率/最高浸膏收得率×40。根據綜合評分確定最佳提取條件。
1.5 提取工藝驗證試驗
取處方量藥材3份，按確定的最佳提取條件進行驗證試驗。
1.6 統計學方法
正交試驗設計采用正交設計軟件助手Ⅱ3.1。統計學分析應用SPSS 19.0軟件，組間比較采用方差分析。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 綠原酸含量測定的方法學評價
2.1.1 方法專屬性
各溶液方法專屬性HPLC色譜圖結果見圖 1，綠原酸的保留時間分別約為20 min，陰性對照無干擾，說明該方法專屬性符合測定要求。
圖1
專屬性實驗各溶液HPLC色譜圖????圖中1表示綠原酸的色譜峰??a.?陰性樣品溶液??b.?綠原酸對照品溶液??c.?野菊花藥材溶液??d.?忍冬藤藥材溶液??e.?供試品溶液
2.1.2 標準曲線
綠原酸標準曲線方程為y=3×10?7x+0.022（r=0.999 5），表明綠原酸在0.096～0.480 μg范圍內與峰面積呈良好的線性關系。
2.1.3 方法精密度
綠原酸峰面積相對標準偏差（RSD）為0.07%，表明儀器精密度良好。
2.1.4 加樣回收率
平均綠原酸回收率為102.19%，RSD為1.86%，本方法加樣回收率符合測定要求。
2.1.5 方法穩定性
綠原酸峰面積RSD為0.47%，供試品溶液在12 h內穩定性良好。
2.2 正交試驗及方差分析結果
正交試驗結果見表 2。根據綜合評分結果的直觀分析，極差R值大小顯示，各因素的影響順序為C＞B＞A；方差分析結果表明，A因素無統計學意義（P＞0.05），B、C因素都有統計學意義（P＜0.05）。故最佳工藝條件為A1B1C3，即藥材加8倍水，提取3次，每次煮沸30 min。
表2
L9（34）正交試驗結果
2.3 提取工藝驗證
平均浸膏收得率為28.12%（RSD=2.45%），綠原酸轉移率為49.40%（RSD=3.22%）。驗證試驗結果說明優選的提取工藝合理，試驗方法簡便、準確。
3 討論
該處方是我院臨床應用10余年的協定處方，有明確的臨床療效。按照新制劑申報相關規定，對該處方藥物進行藥劑學研究。該處方藥物一直以水煎煮服用，故在提取條件考察時，仍以水為提取溶劑進行提取條件的考察。這樣既保留了中藥湯劑的特點，又可以充分體現中藥的整體復方功效和調理作用，同時也避免了有機溶劑可能代入的污染和毒性，符合醫院制劑實際配制的情況，便于患者的使用和接受[11]。
選擇含量測定的考察指標時，我們發現多個指標性成分均不是該處方中單味藥材所含的特有成分，如含綠原酸的藥材有忍冬藤和野菊花，含馬錢苷的有秦艽和忍冬藤，含牡丹酚和芍藥苷的有芍藥和牡丹皮等[12]。該處方忍冬藤為君藥且用量較大，加上野菊花的用量，故綠原酸含量較高。綠原酸是一種有機酸，具有抗菌、抗病毒、清除自由基和興奮中樞神經系統等多種生物活性[13]，是紫蒲痛風合劑中發揮藥效作用的重要成分之一。因此選用綠原酸作為篩選紫蒲痛風合劑水提最佳工藝的主要含量檢測指標。
目前采用HPLC法測定綠原酸含量的報道較多[14-15]，其中以乙腈-0.4%磷酸溶液為流動相體系的反相液相色譜較為多見。本研究通過對含量測定方法的考察，從分離度、保留時間、理論塔板數等方面考慮，進行了流動相比例改變的考察，發現以乙腈-0.4%磷酸溶液（10:90）的分離效果較好，最終選用該流動相體系比例。
在進行綜合評分時，由于綠原酸為本組方合劑的主要藥理活性成分，本試驗將其所占的權重設置較大。考慮到中藥組方強調的是其復方功效，整體平衡原則、綜合辨證施治和協調調理作用的結果，因而也將浸膏收得率考慮在內，所占權重相對較小。
正交設計方法在藥學試驗研究中發揮著重要的作用。分析表 2數據可見，不同提取工藝條件下測得綠原酸轉移率為28.06%～43.89%，處方中主要藥效指標在優化條件下可以提高近1倍，充分說明對提取工藝篩選的必要性。本研究通過對加水量、提取次數、提取時間3個因素進行考察，優化了紫蒲痛風合劑的制備工藝，按照正交試驗優選的最佳工藝條件進行驗證試驗，結果表明，該工藝穩定可行，浸膏收得率和綠原酸轉移率均較滿意，可保證制劑質量。
綜上所述，本研究采用正交試驗方法對紫蒲痛風合劑的藥物提取工藝進行了研究，該工藝采用水為提取溶劑，對加水量、提取次數和提取時間3個主要影響因素進行了考察，最終確定最佳提取工藝為藥材8倍量的水，提取3次，每次提取30 min。在最優條件下，綠原酸轉移率可達43.89%，說明此方法具有較高的可行性以及較好的應用前景為實際生產提供了一定的理論依據。
近年來，痛風的患病率呈逐年遞增趨勢，已成為風濕病領域的關注焦點[1]。中醫藥治療痛風在辨證論治和處方用藥上具有明顯的優勢，能有效減輕患者病痛，且不良反應少，價格低廉[2]。紫蒲痛風合劑由紫花地丁、蒲公英、野菊花、忍冬藤等中藥組成，具有清熱利濕、消腫止痛的功效，臨床用于治療濕熱蘊結型痛風。該藥作為我院協定處方已應用了10余年，療效確切，有較好的應用前景。臨床使用是以湯劑形式，因藥物量較大，煎煮后的藥液量多，患者服用困難，不便攜帶，故擬開發為合劑。為了制備安全、有效、經濟的紫蒲痛風合劑，我們對其藥物提取工藝進行了研究，以水提浸膏收得率和綠原酸總含量為考察指標，采用正交試驗進行優化，為后續的大量生產提供理論依據。現報告如下。
1 材料與方法
1.1 儀器與材料
1.1.1 儀器
Waters 1525 Binary高效液相色譜（HPLC）儀（美國Waters公司），Waters 2487紫外檢測儀（美國Waters公司）；XS105電子天平（瑞士Mettler Toledo公司）；SB3200超聲波提取器（上海必能信公司）；AYJ1-0501-U超純水機（重慶艾科浦公司）。
1.1.2 材料
紫花地丁、蒲公英、野菊花、忍冬藤等由四川省中藥飲片公司提供；綠原酸（中國食品藥品檢定研究院提供，批號：110753-201415）；乙腈、甲醇為色譜純，水為超純水，其余試劑為分析純。
1.2 正交試驗設計
根據該協定處方在臨床應用情況和該研究的目的，選擇以水為提取溶媒，對水的用量、提取次數和每次提取時間作為研究的主要影響因素，采用L9（34）正交表進行試驗設計。正交試驗因素及水平見表 1。
表1
L9（34）正交試驗因素及水平
1.3 藥材提取液的制備
按處方比例取飲片共100 g，9份，根據L9（34）正交表安排試驗[3-4]，按表 1條件進行加熱提取，過濾，收集提取液，準確測定其體積。
1.4 評價指標及其測定方法
1.4.1 浸膏收得率的測定
精密吸取1.3項下提取液50 mL，置已干燥至恒重的蒸發皿中，水浴上蒸干，105℃干燥3 h，置干燥器中冷卻至室溫，迅速稱量，得到浸膏質量。浸膏收得率=（浸膏質量/50）×藥液體積/藥物總質量×100%。
1.4.2 綠原酸轉移率的測定
①色譜條件：色譜柱為SymmetryShield RP18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相為乙腈?0.4%磷酸溶液（10:90）；檢測波長為327 nm；進樣量為10 μL；柱溫為25℃[5]。
②對照品溶液的制備：取綠原酸對照品4.8 mg，精密稱定，加100 mL 50%甲醇制成0.48 μg/mL的對照品溶液，備用[6]。
③供試品溶液的制備：精密吸取1.3項下提取液5 mL，置10 mL量瓶中，精密加入50%甲醇稀釋至刻度，超聲處理10 min，放冷，搖勻，濾過，取續濾液，即得。
④陰性樣品溶液的制備：按處方量稱取不含忍冬藤和野菊花的其余藥材，按③項下供試品溶液制備方法制備陰性樣品溶液。
⑤方法專屬性：分別精密吸取對照品溶液、供試品溶液、陰性樣品溶液各10 μL，注入HPLC儀，按①項下色譜條件進行檢測，記錄色譜峰。
⑥標準曲線的繪制：分別精密吸取對照品溶液2、4、6、8、10 μL。按①項下色譜條件依次進樣，測定其峰面積。以相應的峰面積為縱坐標，進行線性回歸[7-8]。
⑦精密度試驗：精密吸取混合對照品溶液10 μL，連續進樣5次，測定峰面積。
⑧加樣回收率試驗：精密吸取綠原酸對照品溶液（0.48 μg/mL）5 mL分別置于5個相同規格的10 mL容量瓶中，再分別吸取5個已知含量的供試品溶液1 mL，50%甲醇定容，按③項下方法制備加樣回收率實驗樣品。按①項下色譜條件進行檢測，記錄色譜峰及峰面積，計算回收率。
⑨穩定性試驗：精密吸取③項下供試品溶液10 μL，分別于0、2、4、6、8、12 h進樣測定6次，測定峰面積。
⑩綠原酸轉移率測定：將正交試驗各試驗組供試品溶液經0.45 μm微孔濾膜濾過，按①項下色譜條件進行檢測，分別進樣10 μL，測定峰面積，計算各供試品溶液中綠原酸的含量。原藥材中綠原酸含量按《中國藥典》2015年版中忍冬藤和野菊花項下方法測定。綠原酸轉移率=供試品中綠原酸含量/原藥材中綠原酸含量×100%。
1.4.3 綜合評分
以提取的浸膏收得率和綠原酸轉移率進行綜合評分[9-10]，綜合評分=綠原酸轉移率/最高綠原酸轉移率×60+浸膏收得率/最高浸膏收得率×40。根據綜合評分確定最佳提取條件。
1.5 提取工藝驗證試驗
取處方量藥材3份，按確定的最佳提取條件進行驗證試驗。
1.6 統計學方法
正交試驗設計采用正交設計軟件助手Ⅱ3.1。統計學分析應用SPSS 19.0軟件，組間比較采用方差分析。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 綠原酸含量測定的方法學評價
2.1.1 方法專屬性
各溶液方法專屬性HPLC色譜圖結果見圖 1，綠原酸的保留時間分別約為20 min，陰性對照無干擾，說明該方法專屬性符合測定要求。
圖1
專屬性實驗各溶液HPLC色譜圖????圖中1表示綠原酸的色譜峰??a.?陰性樣品溶液??b.?綠原酸對照品溶液??c.?野菊花藥材溶液??d.?忍冬藤藥材溶液??e.?供試品溶液
2.1.2 標準曲線
綠原酸標準曲線方程為y=3×10?7x+0.022（r=0.999 5），表明綠原酸在0.096～0.480 μg范圍內與峰面積呈良好的線性關系。
2.1.3 方法精密度
綠原酸峰面積相對標準偏差（RSD）為0.07%，表明儀器精密度良好。
2.1.4 加樣回收率
平均綠原酸回收率為102.19%，RSD為1.86%，本方法加樣回收率符合測定要求。
2.1.5 方法穩定性
綠原酸峰面積RSD為0.47%，供試品溶液在12 h內穩定性良好。
2.2 正交試驗及方差分析結果
正交試驗結果見表 2。根據綜合評分結果的直觀分析，極差R值大小顯示，各因素的影響順序為C＞B＞A；方差分析結果表明，A因素無統計學意義（P＞0.05），B、C因素都有統計學意義（P＜0.05）。故最佳工藝條件為A1B1C3，即藥材加8倍水，提取3次，每次煮沸30 min。
表2
L9（34）正交試驗結果
2.3 提取工藝驗證
平均浸膏收得率為28.12%（RSD=2.45%），綠原酸轉移率為49.40%（RSD=3.22%）。驗證試驗結果說明優選的提取工藝合理，試驗方法簡便、準確。
3 討論
該處方是我院臨床應用10余年的協定處方，有明確的臨床療效。按照新制劑申報相關規定，對該處方藥物進行藥劑學研究。該處方藥物一直以水煎煮服用，故在提取條件考察時，仍以水為提取溶劑進行提取條件的考察。這樣既保留了中藥湯劑的特點，又可以充分體現中藥的整體復方功效和調理作用，同時也避免了有機溶劑可能代入的污染和毒性，符合醫院制劑實際配制的情況，便于患者的使用和接受[11]。
選擇含量測定的考察指標時，我們發現多個指標性成分均不是該處方中單味藥材所含的特有成分，如含綠原酸的藥材有忍冬藤和野菊花，含馬錢苷的有秦艽和忍冬藤，含牡丹酚和芍藥苷的有芍藥和牡丹皮等[12]。該處方忍冬藤為君藥且用量較大，加上野菊花的用量，故綠原酸含量較高。綠原酸是一種有機酸，具有抗菌、抗病毒、清除自由基和興奮中樞神經系統等多種生物活性[13]，是紫蒲痛風合劑中發揮藥效作用的重要成分之一。因此選用綠原酸作為篩選紫蒲痛風合劑水提最佳工藝的主要含量檢測指標。
目前采用HPLC法測定綠原酸含量的報道較多[14-15]，其中以乙腈-0.4%磷酸溶液為流動相體系的反相液相色譜較為多見。本研究通過對含量測定方法的考察，從分離度、保留時間、理論塔板數等方面考慮，進行了流動相比例改變的考察，發現以乙腈-0.4%磷酸溶液（10:90）的分離效果較好，最終選用該流動相體系比例。
在進行綜合評分時，由于綠原酸為本組方合劑的主要藥理活性成分，本試驗將其所占的權重設置較大。考慮到中藥組方強調的是其復方功效，整體平衡原則、綜合辨證施治和協調調理作用的結果，因而也將浸膏收得率考慮在內，所占權重相對較小。
正交設計方法在藥學試驗研究中發揮著重要的作用。分析表 2數據可見，不同提取工藝條件下測得綠原酸轉移率為28.06%～43.89%，處方中主要藥效指標在優化條件下可以提高近1倍，充分說明對提取工藝篩選的必要性。本研究通過對加水量、提取次數、提取時間3個因素進行考察，優化了紫蒲痛風合劑的制備工藝，按照正交試驗優選的最佳工藝條件進行驗證試驗，結果表明，該工藝穩定可行，浸膏收得率和綠原酸轉移率均較滿意，可保證制劑質量。
綜上所述，本研究采用正交試驗方法對紫蒲痛風合劑的藥物提取工藝進行了研究，該工藝采用水為提取溶劑，對加水量、提取次數和提取時間3個主要影響因素進行了考察，最終確定最佳提取工藝為藥材8倍量的水，提取3次，每次提取30 min。在最優條件下，綠原酸轉移率可達43.89%，說明此方法具有較高的可行性以及較好的應用前景為實際生產提供了一定的理論依據。
