引用本文： 舒玲, 鄧勁, 吳思穎, 康梅. 替加環素體外抗菌活性檢測方法的分析評價. 華西醫學, 2016, 31(10): 1697-1700. doi: 10.7507/1002-0179.201600467 復制
近年來多重耐藥菌已經逐漸成為醫院感染的重要病原菌，此類細菌引起的感染常呈現出復雜性、難治性等特點，目前已經成為嚴重危及醫療安全和患者生命的危險因素之一[1-3]。替加環素作為新一代超廣譜抗生素，于2005年6月得到美國食品和藥物管理局（FDA）批準用于治療成人復雜的腹腔內感染和皮膚及軟組織感染，是第一個被批準應用于臨床的甘氨酰環素類抗菌藥物，于2012年在中國上市。目前，美國臨床和實驗室標準化協會（CLSI）還未推薦適合臨床實驗室常規使用的檢測替加環素敏感性的方法。國內臨床微生物實驗室細菌耐藥性分析多采用紙片擴散（KB）法及全自動藥物敏感（藥敏）儀。因此，我們同時采用KB法、Vitek 2法和最小抑菌濃度（MIC）檢測試紙條（MTS）檢測鮑曼不動桿菌及腸桿菌科菌對替加環素的敏感性，用MTS法做標準評價KB法、Vitek 2法的一致率及可靠性。現報告如下。
1 資料與方法
1.1 一般資料
收集2014年1月－2015年3月從四川大學華西醫院140例住院患者的不同標本中分離的140株臨床常見多重耐藥病原菌，其中非發酵菌鮑曼不動桿菌（亞胺培南與美羅培南均耐藥）119株及腸桿菌科21株（肺炎克雷伯菌10株，陰溝腸桿菌6株，費勞地枸櫞酸桿菌2株，黏質沙雷菌1株，產堿菌1株，產氣腸桿菌1株）。由于銅綠假單胞菌對替加環素天然耐藥，故本次試驗未選擇銅綠假單胞菌。其中痰標本90例，分泌物15例，尿標本8例，血液標本12例，其他部位標本15例。質量控制（質控）菌株為大腸埃希菌ATCC25922。
1.2 儀器與試劑
Vitek 2 Compact全自動鑒定儀及配套GN鑒定卡、AST-GN16藥敏卡（法國生物梅里埃公司）。替加環素紙片（15 μg/片，英國Oxoid公司）；替加環素MTS（0.016～256 μg/mL，意大利Liofilchem公司）。藥敏試驗培養基為水解酪蛋白（Mueller-Hinton瓊脂，法國生物梅里埃公司）。
1.3 試驗方法
1.3.1 KB法
按照美國CLSI推薦的操作[4]進行。取0.5麥氏濁度單位的菌液涂布于M-H平板上，室溫放置15 min，待表面干后，將紙片貼在瓊脂表面。35℃培養16～18 h，測量出完整抑菌圈直徑。
1.3.2 Vitek 2法
用Vitek 2 Compact全自動鑒定儀及配套GN鑒定卡、AST-GN16藥敏卡進行藥敏試驗，具體操作參照說明書，儀器自動給出MIC值。
1.3.3 MTS法
培養基、接種物制備、接種和培養條件同KB法，將MTS試條標有刻度的一面向上貼于瓊脂表面。讀取結果時，在80%抑菌圈處讀取MIC值，通過肉眼觀察，判斷明顯的抑菌點，而忽略可能蔓延到終點的菌斑或細小的微菌落。
1.4 判讀標準
目前美國CLSI尚無替加環素的藥敏結果判讀標準，替加環素的折點參照美國FDA的標準及文獻[5]判讀結果。對于鮑曼不動桿菌，MIC≤2 μg/mL為敏感，3～7 μg/mL為中介，≥8 μg/mL為耐藥；抑菌圈直徑≥16 mm為敏感，13～15 mm為中介，≤12 mm為耐藥。對于腸桿菌科，MIC≤2 μg/mL為敏感，3～7 μg/mL為中介，≥8 μg/mL為耐藥；抑菌圈直徑≥19 mm為敏感，15～18 mm為中介，≤14 mm為耐藥。以MTS法為參考標準，分析KB法和Vitek 2法與MTS法測試結果的一致率。MTS法藥敏結果為耐藥，而KB法為敏感，則判為極重要誤差。MTS法藥敏結果為敏感，而KB法為耐藥，則判為重要誤差。MTS法藥敏結果為耐藥或敏感，而KB法為中介；或者MTS法藥敏結果為中介，而KB法為耐藥或敏感，則為次要誤差。
1.5 統計學方法
采用SPSS 21.0軟件進行統計學分析。計數資料采用百分比表示，組間比較采用χ2檢驗。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 3種方法檢測的藥敏結果比較
替加環素對鮑曼不動桿菌和腸桿菌科均有較好的抗菌活性，抑制50%受試菌所需MIC（MIC50）均在敏感范圍內（0.5～2.0 μg/mL），MIC90范圍為1～4 μg/mL。對于鮑曼不動桿菌，MTS法檢測敏感率高于KB法和Vitek 2法，差異無統計學意義（P > 0.05）；中介率低于KB法和Vitek 2法，差異有統計學意義（P < 0.05）；耐藥率MTS法和Vitek 2法均高于KB法，差異無統計學意義（P > 0.05）。對于腸桿菌科，MTS法和Vitek 2法檢測敏感率均高于KB法，差異無統計學意義（P > 0.05）；3種方法檢測的中介率相同；MTS法和Vitek 2法未發現耐藥菌株，KB法發現1株耐藥菌。見表 1。
表1
3種方法檢測鮑曼不動桿菌和腸桿菌科對替加環素的藥敏結果[株（%）]
2.2 KB法與Vitek 2法檢測結果比較
Vitek 2法檢測鮑曼不動桿菌結果的一致率低于KB法，差異無統計學意義（P > 0.05）；Vitek 2法檢測腸桿菌科的一致率高于KB法，差異無統計學意義（P > 0.05）。見表 2。
表2
KB法和Vitek 2法結果與MTS法結果的一致性比較[株（%）]
3 討論
隨著抗菌藥物廣泛及不規范使用，臨床抗菌藥物的耐藥狀況日趨嚴峻，尤其是碳青霉烯類耐藥革蘭陰性桿菌對目前臨床上用于治療革蘭陰性桿菌最強效的抗菌藥物——碳青霉烯類抗生素不敏感，導致臨床在治療此類細菌感染中舉步艱難。多重耐藥菌導致的醫院內感染已成為延長患者住院時間、增加醫療費用和導致患者死亡的重要原因之一[6]。合理選擇抗菌藥物對于避免出現治療失敗至關重要。替加環素作為一種半合成的四環素類藥物，第一個被批準應用于臨床的甘氨酰環素類抗菌藥物，對其他的體外檢測方法及判定結果是非常重要的。準確的藥敏結果是臨床使用抗菌藥物的重要依據。美國FDA和歐洲藥敏試驗委員會（EUCAST）分別制定了替加環素藥敏結果的判讀標準和操作指南。研究表明，FDA判定折點優于EUCAST折點[7-10]。美國CLSI尚未公布替加環素藥敏方案和判讀標準。根據王輝等[5]制定的替加環素體外藥敏試驗操作規程，替加環素體外藥敏試驗可采用包括瓊脂擴散法、稀釋法、自動化儀器法和E-test，但是不同方法及不同瓊脂介質之間的藥敏結果存在差別[11-15]。其中以MTS法與微量肉湯稀釋法的相關性最好[16]，但是由于微量肉湯稀釋法需要采用新鮮配置的MH肉湯作為藥敏用培養基，且不適用于厭氧菌MIC的檢測。而MTS法與E-test試驗原理相同，在Tejero等[17]對38株鮑曼不動桿菌研究發現，MTS法的檢測結果比E-test更接近微量肉湯稀釋法。但是MTS法檢測價格較貴，不適于臨床常規細菌耐藥分析，從而KB法成為了目前臨床使用最廣泛的藥敏方法之一，操作簡單且成本較低，但易受多種因素的影響，如接種菌量、預溫育時間、抗生素含量及擴散能力、瓊脂厚度等。Hope等[18]用KB法檢測150株臨床常見細菌對替加環素的敏感性時發現，4%的菌株對替加環素耐藥；而用瓊脂稀釋法檢測發現，耐藥菌株均對替加環素敏感。因此KB法可能高估替加環素的中介率和耐藥率。本研究結果表明，KB法檢測鮑曼不動桿菌對替加環素的敏感率為88.2%，與MTS法的符合率為94.1%，未發現重要誤差及極重要誤差。而KB法檢測鮑曼不動桿菌對替加環素的中介率為5.9%，明顯高于MTS法，次要誤差率為6.9%。因此，對于KB法檢測為中介的菌株應通過定量試驗再次檢測其藥敏結果。
同時由于替加環素理化性質活潑，容易受到外界因素的影響，導致該藥物的體外藥物敏感性檢測存在較多的難點和操作誤區，在臨床實驗室檢測不易標準化，因此在進行替加環素體外抗菌活性檢測時需注意替加環素紙片的保存，無論采用何種方法，只有當質控菌株對替加環素的藥敏結果在可接受的質控范圍時，待測菌株的結果才真實、有效。
由于本研究中的菌株數量及種類有限，因此對替加環素體外藥敏試驗方法還需進行更大樣本量的評估。
近年來多重耐藥菌已經逐漸成為醫院感染的重要病原菌，此類細菌引起的感染常呈現出復雜性、難治性等特點，目前已經成為嚴重危及醫療安全和患者生命的危險因素之一[1-3]。替加環素作為新一代超廣譜抗生素，于2005年6月得到美國食品和藥物管理局（FDA）批準用于治療成人復雜的腹腔內感染和皮膚及軟組織感染，是第一個被批準應用于臨床的甘氨酰環素類抗菌藥物，于2012年在中國上市。目前，美國臨床和實驗室標準化協會（CLSI）還未推薦適合臨床實驗室常規使用的檢測替加環素敏感性的方法。國內臨床微生物實驗室細菌耐藥性分析多采用紙片擴散（KB）法及全自動藥物敏感（藥敏）儀。因此，我們同時采用KB法、Vitek 2法和最小抑菌濃度（MIC）檢測試紙條（MTS）檢測鮑曼不動桿菌及腸桿菌科菌對替加環素的敏感性，用MTS法做標準評價KB法、Vitek 2法的一致率及可靠性。現報告如下。
1 資料與方法
1.1 一般資料
收集2014年1月－2015年3月從四川大學華西醫院140例住院患者的不同標本中分離的140株臨床常見多重耐藥病原菌，其中非發酵菌鮑曼不動桿菌（亞胺培南與美羅培南均耐藥）119株及腸桿菌科21株（肺炎克雷伯菌10株，陰溝腸桿菌6株，費勞地枸櫞酸桿菌2株，黏質沙雷菌1株，產堿菌1株，產氣腸桿菌1株）。由于銅綠假單胞菌對替加環素天然耐藥，故本次試驗未選擇銅綠假單胞菌。其中痰標本90例，分泌物15例，尿標本8例，血液標本12例，其他部位標本15例。質量控制（質控）菌株為大腸埃希菌ATCC25922。
1.2 儀器與試劑
Vitek 2 Compact全自動鑒定儀及配套GN鑒定卡、AST-GN16藥敏卡（法國生物梅里埃公司）。替加環素紙片（15 μg/片，英國Oxoid公司）；替加環素MTS（0.016～256 μg/mL，意大利Liofilchem公司）。藥敏試驗培養基為水解酪蛋白（Mueller-Hinton瓊脂，法國生物梅里埃公司）。
1.3 試驗方法
1.3.1 KB法
按照美國CLSI推薦的操作[4]進行。取0.5麥氏濁度單位的菌液涂布于M-H平板上，室溫放置15 min，待表面干后，將紙片貼在瓊脂表面。35℃培養16～18 h，測量出完整抑菌圈直徑。
1.3.2 Vitek 2法
用Vitek 2 Compact全自動鑒定儀及配套GN鑒定卡、AST-GN16藥敏卡進行藥敏試驗，具體操作參照說明書，儀器自動給出MIC值。
1.3.3 MTS法
培養基、接種物制備、接種和培養條件同KB法，將MTS試條標有刻度的一面向上貼于瓊脂表面。讀取結果時，在80%抑菌圈處讀取MIC值，通過肉眼觀察，判斷明顯的抑菌點，而忽略可能蔓延到終點的菌斑或細小的微菌落。
1.4 判讀標準
目前美國CLSI尚無替加環素的藥敏結果判讀標準，替加環素的折點參照美國FDA的標準及文獻[5]判讀結果。對于鮑曼不動桿菌，MIC≤2 μg/mL為敏感，3～7 μg/mL為中介，≥8 μg/mL為耐藥；抑菌圈直徑≥16 mm為敏感，13～15 mm為中介，≤12 mm為耐藥。對于腸桿菌科，MIC≤2 μg/mL為敏感，3～7 μg/mL為中介，≥8 μg/mL為耐藥；抑菌圈直徑≥19 mm為敏感，15～18 mm為中介，≤14 mm為耐藥。以MTS法為參考標準，分析KB法和Vitek 2法與MTS法測試結果的一致率。MTS法藥敏結果為耐藥，而KB法為敏感，則判為極重要誤差。MTS法藥敏結果為敏感，而KB法為耐藥，則判為重要誤差。MTS法藥敏結果為耐藥或敏感，而KB法為中介；或者MTS法藥敏結果為中介，而KB法為耐藥或敏感，則為次要誤差。
1.5 統計學方法
采用SPSS 21.0軟件進行統計學分析。計數資料采用百分比表示，組間比較采用χ2檢驗。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 3種方法檢測的藥敏結果比較
替加環素對鮑曼不動桿菌和腸桿菌科均有較好的抗菌活性，抑制50%受試菌所需MIC（MIC50）均在敏感范圍內（0.5～2.0 μg/mL），MIC90范圍為1～4 μg/mL。對于鮑曼不動桿菌，MTS法檢測敏感率高于KB法和Vitek 2法，差異無統計學意義（P > 0.05）；中介率低于KB法和Vitek 2法，差異有統計學意義（P < 0.05）；耐藥率MTS法和Vitek 2法均高于KB法，差異無統計學意義（P > 0.05）。對于腸桿菌科，MTS法和Vitek 2法檢測敏感率均高于KB法，差異無統計學意義（P > 0.05）；3種方法檢測的中介率相同；MTS法和Vitek 2法未發現耐藥菌株，KB法發現1株耐藥菌。見表 1。
表1
3種方法檢測鮑曼不動桿菌和腸桿菌科對替加環素的藥敏結果[株（%）]
2.2 KB法與Vitek 2法檢測結果比較
Vitek 2法檢測鮑曼不動桿菌結果的一致率低于KB法，差異無統計學意義（P > 0.05）；Vitek 2法檢測腸桿菌科的一致率高于KB法，差異無統計學意義（P > 0.05）。見表 2。
表2
KB法和Vitek 2法結果與MTS法結果的一致性比較[株（%）]
3 討論
隨著抗菌藥物廣泛及不規范使用，臨床抗菌藥物的耐藥狀況日趨嚴峻，尤其是碳青霉烯類耐藥革蘭陰性桿菌對目前臨床上用于治療革蘭陰性桿菌最強效的抗菌藥物——碳青霉烯類抗生素不敏感，導致臨床在治療此類細菌感染中舉步艱難。多重耐藥菌導致的醫院內感染已成為延長患者住院時間、增加醫療費用和導致患者死亡的重要原因之一[6]。合理選擇抗菌藥物對于避免出現治療失敗至關重要。替加環素作為一種半合成的四環素類藥物，第一個被批準應用于臨床的甘氨酰環素類抗菌藥物，對其他的體外檢測方法及判定結果是非常重要的。準確的藥敏結果是臨床使用抗菌藥物的重要依據。美國FDA和歐洲藥敏試驗委員會（EUCAST）分別制定了替加環素藥敏結果的判讀標準和操作指南。研究表明，FDA判定折點優于EUCAST折點[7-10]。美國CLSI尚未公布替加環素藥敏方案和判讀標準。根據王輝等[5]制定的替加環素體外藥敏試驗操作規程，替加環素體外藥敏試驗可采用包括瓊脂擴散法、稀釋法、自動化儀器法和E-test，但是不同方法及不同瓊脂介質之間的藥敏結果存在差別[11-15]。其中以MTS法與微量肉湯稀釋法的相關性最好[16]，但是由于微量肉湯稀釋法需要采用新鮮配置的MH肉湯作為藥敏用培養基，且不適用于厭氧菌MIC的檢測。而MTS法與E-test試驗原理相同，在Tejero等[17]對38株鮑曼不動桿菌研究發現，MTS法的檢測結果比E-test更接近微量肉湯稀釋法。但是MTS法檢測價格較貴，不適于臨床常規細菌耐藥分析，從而KB法成為了目前臨床使用最廣泛的藥敏方法之一，操作簡單且成本較低，但易受多種因素的影響，如接種菌量、預溫育時間、抗生素含量及擴散能力、瓊脂厚度等。Hope等[18]用KB法檢測150株臨床常見細菌對替加環素的敏感性時發現，4%的菌株對替加環素耐藥；而用瓊脂稀釋法檢測發現，耐藥菌株均對替加環素敏感。因此KB法可能高估替加環素的中介率和耐藥率。本研究結果表明，KB法檢測鮑曼不動桿菌對替加環素的敏感率為88.2%，與MTS法的符合率為94.1%，未發現重要誤差及極重要誤差。而KB法檢測鮑曼不動桿菌對替加環素的中介率為5.9%，明顯高于MTS法，次要誤差率為6.9%。因此，對于KB法檢測為中介的菌株應通過定量試驗再次檢測其藥敏結果。
同時由于替加環素理化性質活潑，容易受到外界因素的影響，導致該藥物的體外藥物敏感性檢測存在較多的難點和操作誤區，在臨床實驗室檢測不易標準化，因此在進行替加環素體外抗菌活性檢測時需注意替加環素紙片的保存，無論采用何種方法，只有當質控菌株對替加環素的藥敏結果在可接受的質控范圍時，待測菌株的結果才真實、有效。
由于本研究中的菌株數量及種類有限，因此對替加環素體外藥敏試驗方法還需進行更大樣本量的評估。
