引用本文： 蔣莎莎, 譚春路, 張浩, 羅峰, 李可洲. 小鼠早期胚胎與腫瘤細胞共培養下的相互作用. 華西醫學, 2016, 31(9): 1525-1529. doi: 10.7507/1002-0179.201600416 復制
19世紀20年代，法國生物學家Lobstein和Recamier提出腫瘤的胚胎性起源學說，認為腫瘤的發生是由于持續存在于成體內的胚胎細胞的增殖，該理論雖具局限性，但引導人們從發育生物學的全新角度去認識腫瘤的發生。近年來，眾多研究表明早期胚胎細胞與腫瘤細胞的分化狀態相似，腫瘤細胞有胚胎性基因的表達[1]，且腫瘤細胞生長與胚胎發育有不少相似的細胞信號調節因子及信號轉導通路[2-3]；研究還發現，胚胎發育過程中的基因甲基化與去甲基化、侵襲行為及相關基因表達、細胞凋亡、免疫逃避及新生血管生成等方面均與腫瘤細胞的生物學行為具有相通性[4-7]。然而，雖然腫瘤細胞與早期胚胎細胞之間存在眾多的生物學相似性，但腫瘤的生長不受機體的調控，威脅生命，而胚胎細胞可在機體多因素調控下有序增殖分化形成新的個體。另有研究表明，腫瘤細胞也可在胚胎微環境中實現“程序重排”，逆轉惡性表型，并參與正常的生理過程[8-10]。
另外，胚胎與細胞的共培養是提高胚胎體外發育成功率和質量的一種可靠手段[11]。參與共培養的細胞主要有子宮內膜細胞、輸卵管上皮細胞等生殖系統來源的細胞，旨在模擬胚胎發育的體內環境，而腫瘤細胞也是一種共培養的選擇，雖然腫瘤細胞多經絲裂霉素或放射線處理失活后作為胚胎發育的飼養層細胞，但仍可促進胚胎的發育[12]。
基于胚胎細胞與腫瘤細胞的相似性及胚胎體外培養的必要性，本研究采用了未經任何處理的非生殖系統來源的腫瘤細胞與小鼠早期胚胎體外共培養，旨在觀測共同微環境中兩者生物學行為的變化及相互作用，以此進一步認識胚胎-腫瘤的關聯性，也期望為胚胎體外培養和腫瘤研究提供新的思路與方法。現報告如下。
1 材料與方法
1.1 材料
246只無特定病原體級昆明種小鼠[生產許可證號：scxk（川）2009-09；使用許可證號：syxk（川）2009-045，購于四川大學實驗動物中心]，雄性46只，8 ～ 10周齡；雌性200只，6 ～ 8周齡。小鼠結腸癌細胞株C26及小鼠胚胎成纖維細胞株NIH3T3購自美國模式菌種收集中心，于本實驗室傳代、保種。
1.2 實驗方法
1.2.1 小鼠胚胎2-細胞胚胎的獲取
參照文獻[13]的實驗方法獲取1.5 dpc （days postcoitum），小鼠2-細胞胚胎：在雌鼠腹腔注射10 U孕馬血清促性腺激素，48 h后再次注射10 U人絨毛膜促性腺激素，4 h后隨機將雌雄小鼠按1∶1合籠；在1.5 dpc時脊椎脫臼法處死雌鼠，無菌條件下，近輸卵管端截掉子宮，轉移至無菌細胞培養皿中，杜氏磷酸鹽緩沖溶液（D-PBS）沖出2-細胞胚胎，于顯微鏡下挑選發育良好的胚胎用于共培養。
1.2.2 實驗分組
A組：C26細胞與小鼠2-細胞胚胎共培養；B組：NIH3T3細胞與小鼠2-細胞胚胎共培養，作為陽性對照；C組：單純培養小鼠2-細胞胚胎，作為陰性對照；D組：單純培養C26細胞。
1.2.3 檢測方法
噻唑藍（MTT）法檢測細胞增殖力：消化細胞收集于離心管中，用改良Eagle培養基（DMEM）制成單細胞懸液5 mL；96孔板中每孔加入150 μL培養基及50 μL的已制備的單細胞懸液，混勻，放入孵箱中孵育3 h；96孔板中每孔加入20 μL MTT液，37℃孵育4 h；小心吸棄上清液，每孔加入150 μL二甲基亞砜，震蕩30 min，于酶標儀490 nm波長處測吸光度（A）值。
① 流式細胞術檢測細胞凋亡率：消化細胞并用磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌3次，制備單細胞懸液于200 μL的PBS液中，上流式細胞儀檢測C26細胞凋亡率。
② 碘化丙啶（PI）染色：A組共培養3 d后，囊胚已充分擴展，吸棄培養基，用生理鹽水洗滌2遍后，加入1 ～ 2滴PI染料，在熒光顯微鏡下進行觀察 細胞。
③ 細胞爬片免疫組織化學染色：A組共培養3 d后，吸棄培養基，用生理鹽水洗滌2遍后，用4%多聚甲醛固定15 ～ 20 min，吸棄多聚甲醛，再用生理鹽水洗滌2遍，準備行免疫組織化學染色，包括增殖細胞核抗原（PCNA）、B細胞淋巴瘤/白血病-2（BCL-2）。
1.3 觀察指標
1.3.1 共培養對小鼠2-細胞胚胎發育的影響
觀察在體外單一環境下，以及與其他細胞共培養后小鼠2-細胞胚胎的發育狀況，包括胚胎體外發育各階段的完整性，以及4-細胞胚胎、桑葚胚、囊胚的形成率，分別于共培養24、48、72 h觀察計數。
1.3.2 共培養下腫瘤細胞生物學行為的觀測
與 D組比較，A組24、48、72 h后細胞增殖、凋亡情況的變化。
1.3.3 共培養微環境下擴展囊胚與腫瘤細胞的關系
共培養微環境下，隨著囊胚滋養層細胞的生長擴展，會推擠開周圍腫瘤細胞，形成“無瘤圈”，觀察囊胚滋養層細胞與周圍腫瘤細胞交界處細胞凋亡情況及抗原PCNA、BCL-2的表達情況。
1.4 統計學方法
采用SPSS 10.0軟件進行統計分析。胚胎形成率、凋亡率組間比較采用χ2檢驗；增殖A值采用均數±標準差表示，組間比較采用t檢驗。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 共培養對小鼠2-細胞胚胎發育的影響
2.1.1 小鼠2-細胞胚胎體外發育狀況
獲取的1.5 dpc小鼠胚胎已發育至2-細胞胚胎（圖 1），A、B、C組胚胎在體外均繼續卵裂，依次發育為4-細胞胚胎（圖 2）、8-細胞胚胎（圖 3）、桑葚胚、囊胚，囊胚期開始出現內細胞團和滋養外胚層的分化，形成囊胚腔（圖 4）。隨后，囊胚孵化脫去透明帶，這是囊胚黏附的必要準備（圖 5）。脫去透明帶的囊胚開始變大，黏附培養皿，與鋪底的細胞開始接觸。貼壁后囊胚滋養層細胞開始擴展，可“侵襲”周圍腫瘤細胞區域，搶占腫瘤細胞生長空間，并形成類似青霉菌抑菌圈樣的無腫瘤細胞生長空白帶，而被囊胚滋養層細胞推開的腫瘤細胞呈圓形或橢圓形堆積在其周圍，形成隆起的細胞帶，而其他部位的腫瘤細胞增殖分裂旺盛（圖 6）。
圖1
1.5 dpc小鼠胚胎2-細胞階段倒置相差顯微鏡像（×200） 可見胚胎由2個細胞組成，在細胞外圍見一圈清晰的透明帶（黑箭）。胚胎透光度好，折光性好，細胞飽滿，胚胎發育良好 ? ?2.1.2 共培養后4-細胞、桑葚胚及囊胚形成率
A、B、C組共收集2-細胞胚胎309枚，A組各發育階段胚胎形成率均最高，與B、C組形成率比較差異有統計學意義（P＜0.05）。見表 1。
表1
共培養后4-細胞胚胎、桑葚胚及囊胚的形成率
2.2 共培養微環境中腫瘤細胞生物學行為
2.2.1 共培養對腫瘤細胞增殖活力的影響
共培養后，A、D組各檢測點細胞增殖A值差異無統計學意義（P＞0.05）。見表 2。
表2
A、D組C26細胞增殖A值（2.2.2 共培養對腫瘤細胞凋亡的影響
隨著共培養時間推移腫瘤細胞凋亡增加，A、D兩組比較，各時間點細胞凋亡率差異無統計學意義（P＞0.05）。見表 3。
表3
A、D組C26細胞凋亡率（2.3 共培養時囊胚擴張及對腫瘤細胞的影響
囊胚孵化脫帶后開始變大（圖 5），黏附生長，且滋養層細胞開始擴展，“侵襲”周圍腫瘤細胞并使之隆起堆積，形成“無瘤區”（圖 6）；PI染色顯示，胚胎胞核及腫瘤胞核均顯示紅色熒光，其中內細胞團紅色熒光亮度較強，滋養層巨細胞熒光亮度較弱，堆積的腫瘤細胞熒光較強，生長緊密（圖 7a、7b）。免疫組織化學結果顯示，“無瘤圈”周圍腫瘤細胞PCNA（圖 8a、8b）及BCL-2（圖 8c、8d）的表達與其他區域比較未見差異。
圖7
小鼠胚胎與腫瘤細胞共培養階段倒置熒光顯微鏡像 可見與胚胎交界處腫瘤細胞密集，熒光亮度較其他區域腫瘤細胞明顯增強 7a. 白箭示“無瘤圈”（PI染色×100） 7b. 白箭示“無瘤圈”周圍熒光亮度增強的腫瘤細胞（PI染色×200） ? ?3 討論
20世紀70年代，有學者提出“腫瘤是一個發育生物學問題”的理論[14]。因此，從發育生物學角度看，腫瘤細胞是未分化或分化異常的細胞，是內外調節因素紊亂導致細胞分化信息程序發生錯誤編碼表達的結果。有研究表明，具有惡性突變基因的腫瘤細胞在胚胎組織中卻表現出正常分化程序的恢復[15-16]，提示在胚胎的微環境中可能存在調控腫瘤細胞向正常細胞分化的因素，而這種調控作用在早期的2-細胞胚胎環境中尤為顯著，另外具有全能性的早期2-細胞胚胎還是小鼠胚胎發育中十分關鍵的階段之一。但在體外培養條件下，氧自由基損傷、培養液成分不平衡等外界因素都可能導致合子基因無法激活啟動，引起2-細胞阻滯，從而不能完成達到囊胚的后續發育。因此，小鼠2-細胞胚胎體外培養是一個難點。鑒于此，建立胚胎與腫瘤細胞的體外共培養模型將為解決胚胎體外培養難題及研究兩者的相互關系提供新的思路和方法。
本研究中選擇了2-細胞胚胎作為研究起點，同時采用非生殖系統來源且未經任何處理的鼠源性腫瘤細胞與小鼠胚胎共培養，在同一體系中探討二者的相互影響。研究發現胚胎的發育未受到周圍腫瘤細胞的阻礙，無發育阻滯現象，且與對照組相比胚胎的發育時程加快，4-細胞胚胎、桑葚胚、囊胚形成率均有提高（P＜0.05）。因此，共培養環境顯示了早期生命現象的高適應性，即發育過程由胚胎型的轉錄產物控制，腫瘤環境并沒有對卵裂形成干擾信號；另外，腫瘤細胞旺盛的分裂增殖消耗氧、減少活性氧對胚胎的損害及大量胚胎發育所必需的細胞因子、生長因子的分泌[17]，都可能是胚胎體外發育良好的原因。本研究還發現，共培養時腫瘤細胞生長良好，與對照組相比，各檢測點細胞的增殖和凋亡均無明顯變化。這可能是由共培養體系是以腫瘤性環境為主所造成的，致使數量較少的胚胎難以對腫瘤細胞產生影響。
共培養實驗中，胚胎滋養層細胞可“侵襲”腫瘤細胞的生存空間，形成“無瘤圈”。其可能提示滋養層細胞的侵襲性強于腫瘤細胞，且這與以往研究中滋養層細胞存在大量表達的侵襲轉移相關基因及基質金屬蛋白酶的報道結果[18-20]相符，但體外共培養的“侵襲”現象是否表示胚胎滋養層細胞與腫瘤細胞之間也存在類似于母胎之間的對話？為此，我們通過PI染色來觀察這一特殊現象，結果發現，“無瘤圈”周圍的腫瘤細胞熒光亮度較其他區域明顯增強，細胞生長緊密，堆積隆起；而為驗證胚胎是否影響周圍腫瘤細胞的凋亡或增殖，我們還進行了細胞增殖相關的PCNA及凋亡相關的BCL-2的免疫組織化學實驗，結果發現周圍腫瘤細胞PCNA及BCL-2的表達量較其他區域未見明顯差異。可見“無瘤圈”的形成并非是胚胎與接觸的腫瘤細胞之間發生了信息交流而誘導腫瘤細胞凋亡所引起的，也表明了“無瘤圈”周圍的腫瘤細胞隆起只是簡單的堆積而并非增殖所致，造成這種現象的原因可能是由于滋養層細胞的運動作用致使黏附性較低的腫瘤細胞從培養板上推起的結果，當然，這也離不開滋養層細胞分泌的基質金屬蛋白酶的水解作用，其可將腫瘤細胞的黏附性偽足從培養板上消化下來，形成細胞界限。
綜上所述，腫瘤細胞可能是一種很好的可提高胚胎培養成功率的體外胚胎培養介質。當然，離開正常母體內環境的調控，胚胎在體外的生物學行為是否發生變化及與腫瘤細胞相互作用的具體途徑及機制還有待進一步的研究。
19世紀20年代，法國生物學家Lobstein和Recamier提出腫瘤的胚胎性起源學說，認為腫瘤的發生是由于持續存在于成體內的胚胎細胞的增殖，該理論雖具局限性，但引導人們從發育生物學的全新角度去認識腫瘤的發生。近年來，眾多研究表明早期胚胎細胞與腫瘤細胞的分化狀態相似，腫瘤細胞有胚胎性基因的表達[1]，且腫瘤細胞生長與胚胎發育有不少相似的細胞信號調節因子及信號轉導通路[2-3]；研究還發現，胚胎發育過程中的基因甲基化與去甲基化、侵襲行為及相關基因表達、細胞凋亡、免疫逃避及新生血管生成等方面均與腫瘤細胞的生物學行為具有相通性[4-7]。然而，雖然腫瘤細胞與早期胚胎細胞之間存在眾多的生物學相似性，但腫瘤的生長不受機體的調控，威脅生命，而胚胎細胞可在機體多因素調控下有序增殖分化形成新的個體。另有研究表明，腫瘤細胞也可在胚胎微環境中實現“程序重排”，逆轉惡性表型，并參與正常的生理過程[8-10]。
另外，胚胎與細胞的共培養是提高胚胎體外發育成功率和質量的一種可靠手段[11]。參與共培養的細胞主要有子宮內膜細胞、輸卵管上皮細胞等生殖系統來源的細胞，旨在模擬胚胎發育的體內環境，而腫瘤細胞也是一種共培養的選擇，雖然腫瘤細胞多經絲裂霉素或放射線處理失活后作為胚胎發育的飼養層細胞，但仍可促進胚胎的發育[12]。
基于胚胎細胞與腫瘤細胞的相似性及胚胎體外培養的必要性，本研究采用了未經任何處理的非生殖系統來源的腫瘤細胞與小鼠早期胚胎體外共培養，旨在觀測共同微環境中兩者生物學行為的變化及相互作用，以此進一步認識胚胎-腫瘤的關聯性，也期望為胚胎體外培養和腫瘤研究提供新的思路與方法。現報告如下。
1 材料與方法
1.1 材料
246只無特定病原體級昆明種小鼠[生產許可證號：scxk（川）2009-09；使用許可證號：syxk（川）2009-045，購于四川大學實驗動物中心]，雄性46只，8 ～ 10周齡；雌性200只，6 ～ 8周齡。小鼠結腸癌細胞株C26及小鼠胚胎成纖維細胞株NIH3T3購自美國模式菌種收集中心，于本實驗室傳代、保種。
1.2 實驗方法
1.2.1 小鼠胚胎2-細胞胚胎的獲取
參照文獻[13]的實驗方法獲取1.5 dpc （days postcoitum），小鼠2-細胞胚胎：在雌鼠腹腔注射10 U孕馬血清促性腺激素，48 h后再次注射10 U人絨毛膜促性腺激素，4 h后隨機將雌雄小鼠按1∶1合籠；在1.5 dpc時脊椎脫臼法處死雌鼠，無菌條件下，近輸卵管端截掉子宮，轉移至無菌細胞培養皿中，杜氏磷酸鹽緩沖溶液（D-PBS）沖出2-細胞胚胎，于顯微鏡下挑選發育良好的胚胎用于共培養。
1.2.2 實驗分組
A組：C26細胞與小鼠2-細胞胚胎共培養；B組：NIH3T3細胞與小鼠2-細胞胚胎共培養，作為陽性對照；C組：單純培養小鼠2-細胞胚胎，作為陰性對照；D組：單純培養C26細胞。
1.2.3 檢測方法
噻唑藍（MTT）法檢測細胞增殖力：消化細胞收集于離心管中，用改良Eagle培養基（DMEM）制成單細胞懸液5 mL；96孔板中每孔加入150 μL培養基及50 μL的已制備的單細胞懸液，混勻，放入孵箱中孵育3 h；96孔板中每孔加入20 μL MTT液，37℃孵育4 h；小心吸棄上清液，每孔加入150 μL二甲基亞砜，震蕩30 min，于酶標儀490 nm波長處測吸光度（A）值。
① 流式細胞術檢測細胞凋亡率：消化細胞并用磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌3次，制備單細胞懸液于200 μL的PBS液中，上流式細胞儀檢測C26細胞凋亡率。
② 碘化丙啶（PI）染色：A組共培養3 d后，囊胚已充分擴展，吸棄培養基，用生理鹽水洗滌2遍后，加入1 ～ 2滴PI染料，在熒光顯微鏡下進行觀察 細胞。
③ 細胞爬片免疫組織化學染色：A組共培養3 d后，吸棄培養基，用生理鹽水洗滌2遍后，用4%多聚甲醛固定15 ～ 20 min，吸棄多聚甲醛，再用生理鹽水洗滌2遍，準備行免疫組織化學染色，包括增殖細胞核抗原（PCNA）、B細胞淋巴瘤/白血病-2（BCL-2）。
1.3 觀察指標
1.3.1 共培養對小鼠2-細胞胚胎發育的影響
觀察在體外單一環境下，以及與其他細胞共培養后小鼠2-細胞胚胎的發育狀況，包括胚胎體外發育各階段的完整性，以及4-細胞胚胎、桑葚胚、囊胚的形成率，分別于共培養24、48、72 h觀察計數。
1.3.2 共培養下腫瘤細胞生物學行為的觀測
與 D組比較，A組24、48、72 h后細胞增殖、凋亡情況的變化。
1.3.3 共培養微環境下擴展囊胚與腫瘤細胞的關系
共培養微環境下，隨著囊胚滋養層細胞的生長擴展，會推擠開周圍腫瘤細胞，形成“無瘤圈”，觀察囊胚滋養層細胞與周圍腫瘤細胞交界處細胞凋亡情況及抗原PCNA、BCL-2的表達情況。
1.4 統計學方法
采用SPSS 10.0軟件進行統計分析。胚胎形成率、凋亡率組間比較采用χ2檢驗；增殖A值采用均數±標準差表示，組間比較采用t檢驗。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 共培養對小鼠2-細胞胚胎發育的影響
2.1.1 小鼠2-細胞胚胎體外發育狀況
獲取的1.5 dpc小鼠胚胎已發育至2-細胞胚胎（圖 1），A、B、C組胚胎在體外均繼續卵裂，依次發育為4-細胞胚胎（圖 2）、8-細胞胚胎（圖 3）、桑葚胚、囊胚，囊胚期開始出現內細胞團和滋養外胚層的分化，形成囊胚腔（圖 4）。隨后，囊胚孵化脫去透明帶，這是囊胚黏附的必要準備（圖 5）。脫去透明帶的囊胚開始變大，黏附培養皿，與鋪底的細胞開始接觸。貼壁后囊胚滋養層細胞開始擴展，可“侵襲”周圍腫瘤細胞區域，搶占腫瘤細胞生長空間，并形成類似青霉菌抑菌圈樣的無腫瘤細胞生長空白帶，而被囊胚滋養層細胞推開的腫瘤細胞呈圓形或橢圓形堆積在其周圍，形成隆起的細胞帶，而其他部位的腫瘤細胞增殖分裂旺盛（圖 6）。
圖1
1.5 dpc小鼠胚胎2-細胞階段倒置相差顯微鏡像（×200） 可見胚胎由2個細胞組成，在細胞外圍見一圈清晰的透明帶（黑箭）。胚胎透光度好，折光性好，細胞飽滿，胚胎發育良好 ? ?2.1.2 共培養后4-細胞、桑葚胚及囊胚形成率
A、B、C組共收集2-細胞胚胎309枚，A組各發育階段胚胎形成率均最高，與B、C組形成率比較差異有統計學意義（P＜0.05）。見表 1。
表1
共培養后4-細胞胚胎、桑葚胚及囊胚的形成率
2.2 共培養微環境中腫瘤細胞生物學行為
2.2.1 共培養對腫瘤細胞增殖活力的影響
共培養后，A、D組各檢測點細胞增殖A值差異無統計學意義（P＞0.05）。見表 2。
表2
A、D組C26細胞增殖A值（2.2.2 共培養對腫瘤細胞凋亡的影響
隨著共培養時間推移腫瘤細胞凋亡增加，A、D兩組比較，各時間點細胞凋亡率差異無統計學意義（P＞0.05）。見表 3。
表3
A、D組C26細胞凋亡率（2.3 共培養時囊胚擴張及對腫瘤細胞的影響
囊胚孵化脫帶后開始變大（圖 5），黏附生長，且滋養層細胞開始擴展，“侵襲”周圍腫瘤細胞并使之隆起堆積，形成“無瘤區”（圖 6）；PI染色顯示，胚胎胞核及腫瘤胞核均顯示紅色熒光，其中內細胞團紅色熒光亮度較強，滋養層巨細胞熒光亮度較弱，堆積的腫瘤細胞熒光較強，生長緊密（圖 7a、7b）。免疫組織化學結果顯示，“無瘤圈”周圍腫瘤細胞PCNA（圖 8a、8b）及BCL-2（圖 8c、8d）的表達與其他區域比較未見差異。
圖7
小鼠胚胎與腫瘤細胞共培養階段倒置熒光顯微鏡像 可見與胚胎交界處腫瘤細胞密集，熒光亮度較其他區域腫瘤細胞明顯增強 7a. 白箭示“無瘤圈”（PI染色×100） 7b. 白箭示“無瘤圈”周圍熒光亮度增強的腫瘤細胞（PI染色×200） ? ?3 討論
20世紀70年代，有學者提出“腫瘤是一個發育生物學問題”的理論[14]。因此，從發育生物學角度看，腫瘤細胞是未分化或分化異常的細胞，是內外調節因素紊亂導致細胞分化信息程序發生錯誤編碼表達的結果。有研究表明，具有惡性突變基因的腫瘤細胞在胚胎組織中卻表現出正常分化程序的恢復[15-16]，提示在胚胎的微環境中可能存在調控腫瘤細胞向正常細胞分化的因素，而這種調控作用在早期的2-細胞胚胎環境中尤為顯著，另外具有全能性的早期2-細胞胚胎還是小鼠胚胎發育中十分關鍵的階段之一。但在體外培養條件下，氧自由基損傷、培養液成分不平衡等外界因素都可能導致合子基因無法激活啟動，引起2-細胞阻滯，從而不能完成達到囊胚的后續發育。因此，小鼠2-細胞胚胎體外培養是一個難點。鑒于此，建立胚胎與腫瘤細胞的體外共培養模型將為解決胚胎體外培養難題及研究兩者的相互關系提供新的思路和方法。
本研究中選擇了2-細胞胚胎作為研究起點，同時采用非生殖系統來源且未經任何處理的鼠源性腫瘤細胞與小鼠胚胎共培養，在同一體系中探討二者的相互影響。研究發現胚胎的發育未受到周圍腫瘤細胞的阻礙，無發育阻滯現象，且與對照組相比胚胎的發育時程加快，4-細胞胚胎、桑葚胚、囊胚形成率均有提高（P＜0.05）。因此，共培養環境顯示了早期生命現象的高適應性，即發育過程由胚胎型的轉錄產物控制，腫瘤環境并沒有對卵裂形成干擾信號；另外，腫瘤細胞旺盛的分裂增殖消耗氧、減少活性氧對胚胎的損害及大量胚胎發育所必需的細胞因子、生長因子的分泌[17]，都可能是胚胎體外發育良好的原因。本研究還發現，共培養時腫瘤細胞生長良好，與對照組相比，各檢測點細胞的增殖和凋亡均無明顯變化。這可能是由共培養體系是以腫瘤性環境為主所造成的，致使數量較少的胚胎難以對腫瘤細胞產生影響。
共培養實驗中，胚胎滋養層細胞可“侵襲”腫瘤細胞的生存空間，形成“無瘤圈”。其可能提示滋養層細胞的侵襲性強于腫瘤細胞，且這與以往研究中滋養層細胞存在大量表達的侵襲轉移相關基因及基質金屬蛋白酶的報道結果[18-20]相符，但體外共培養的“侵襲”現象是否表示胚胎滋養層細胞與腫瘤細胞之間也存在類似于母胎之間的對話？為此，我們通過PI染色來觀察這一特殊現象，結果發現，“無瘤圈”周圍的腫瘤細胞熒光亮度較其他區域明顯增強，細胞生長緊密，堆積隆起；而為驗證胚胎是否影響周圍腫瘤細胞的凋亡或增殖，我們還進行了細胞增殖相關的PCNA及凋亡相關的BCL-2的免疫組織化學實驗，結果發現周圍腫瘤細胞PCNA及BCL-2的表達量較其他區域未見明顯差異。可見“無瘤圈”的形成并非是胚胎與接觸的腫瘤細胞之間發生了信息交流而誘導腫瘤細胞凋亡所引起的，也表明了“無瘤圈”周圍的腫瘤細胞隆起只是簡單的堆積而并非增殖所致，造成這種現象的原因可能是由于滋養層細胞的運動作用致使黏附性較低的腫瘤細胞從培養板上推起的結果，當然，這也離不開滋養層細胞分泌的基質金屬蛋白酶的水解作用，其可將腫瘤細胞的黏附性偽足從培養板上消化下來，形成細胞界限。
綜上所述，腫瘤細胞可能是一種很好的可提高胚胎培養成功率的體外胚胎培養介質。當然，離開正常母體內環境的調控，胚胎在體外的生物學行為是否發生變化及與腫瘤細胞相互作用的具體途徑及機制還有待進一步的研究。
