引用本文： 段瑞岐, 郄明蓉. p53基因突變與上皮性卵巢癌發病分型關系初探. 華西醫學, 2016, 31(8): 1389-1393. doi: 10.7507/1002-0179.201600378 復制
卵巢癌是目前死亡率最高的女性生殖系統腫瘤[1]，其中上皮性卵巢癌（EOC）占卵巢癌發病的大多數，在所有卵巢癌中致死率最高[2]。EOC起病隱匿，難以早期發現[3]，大部分患者臨床發現已屬晚期，目前國際上雖采用了綜合治療的方案，但晚期患者長期生存率仍不容樂觀[4]。EOC病因學復雜，目前具體發病機制尚不清楚[5-6]。近來有研究提出可將EOC分為Ⅰ、Ⅱ兩種類型的“二元論”發病分型[6-9]，Ⅱ型EOC起病隱匿，惡性程度高，進展迅速，病死率高。p53基因是迄今發現與人類腫瘤相關性最高的基因，p53突變是EOC中常被描述的基因事件[5]，但目前關于p53基因在EOC發病中的具體作用仍有不同看法[10-12]。p53基因多數突變發生于保守區內的5-8外顯子上，目前p53基因5-8外顯子突變與EOC發病分型的相關性研究較少，本研究通過研究45例中國西部漢族人群原發EOC患者p53基因5-8外顯子區域突變情況，分析p53基因突變與EOC發病分型間的相關性。現報告如下。
1 資料與方法
1.1 一般資料
選取2011年8月－2012年12月在四川大學華西第二醫院手術并病理確診的四川省漢族原發性EOC患者45例，納入標準為術前未接受物理或手術治療，無全身或局部化學療法（化療）藥物使用史者。病理診斷由醫院婦科病理專家復核、確診。具體病理診斷標準為卵巢上皮細胞增生活躍及核異型，核分裂象增加，上皮細胞層次增加，如無間質浸潤，則為交界性卵巢癌（BOT）；如伴間質浸潤，則為EOC。
卵巢癌的臨床分期采用國際婦產科盟聯2000年制定的標準，卵巢癌病理組織學分級根據世界衛生組織分級標準并參照細胞分化程度進行組織學分級。所選EOC患者依據Shih等[7]提出的“二元論”發病分型，EOC患者可分為Ⅰ型（29例）、Ⅱ型（16例）2組，Ⅰ型腫瘤中包括8例BOT及21例低度惡性EOC；Ⅱ型包括高度惡性漿液性腺癌14例，混合性上皮癌及未分化癌各1例。
1.2 方法
應用聚合酶鏈反應（PCR）、PCR產物純化后DNA測序技術，分析45例原發性EOC患者p53基因第5、6、7、8外顯子突變情況，并結合研究對象的臨床病理參數進行統計分析。
1.2.1 樣本DNA的提取
取抗凝靜脈血200μL，使用離心柱型全血基因組DNA快速提取試劑盒（北京百泰克公司）提取外周血有核細胞基因組DNA，具體操作步驟嚴格按試劑盒說明書進行。用紫外分光檢測儀（美國Beckman公司）檢測提取后的DNA的濃度和純度，并記錄結果，?20℃保存。
1.2.2 目標片段體外擴增及DNA測序
p53基因第5-8外顯子區域共分成5-6、7、8外顯子3個DNA片段，使用表 1中的引物對各片段進行PCR擴增，經36個循環的PCR擴增后，對PCR擴增產物進行DNA測序。測序前先用PCR純化試劑盒純化PCR產物。純化后的PCR產物交由上海華津生物有限公司采用ABI 3730XL測序儀進行測序，具體操作嚴格按照Big Dye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit（ABI）試劑盒說明書進行。
表1
p53基因第5-8外顯子PCR擴增引物
1.2.3 觀察指標
在凝膠成像儀上觀察PCR擴增產物電泳條帶位置，若條帶清晰均勻且無雜帶，則表明該PCR擴增產物合格，并與核酸相對分子質量標準Marker比較擴增產物大小，判斷PCR擴增產物片段大小是否與目標片段相符合。將PCR擴增產物測序結果與人p53標準序列進行人工比對，并結合美國國立生物技術信息中心（NCBI）網站BLAST分析軟件，來判定突變情況，并根據其是否突變分為p53突變型和p53野生型。每組p53突變率=突變例數/每組總例數。
1.3 統計學方法
運用SPSS 17.0統計學軟件對數據進行統計學分析。計算各組患者樣本基因突變頻率及類型。計量資料采用均數±標準差表示，組間比較行成組設計兩樣本t檢驗；計數資料采用百分比表示，組間比較行χ2檢驗或Fisher確切概率法。檢驗水準α=0.05（雙側）。
2 結果
2.1 p53基因5-8外顯子區域突變檢測結果
分析45例EOC患者目標片段突變情況，共有9例患者在p53基因5-8外顯子區域發生了基因突變，其余36例EOC患者在目標區域未檢測到突變，突變患者檢測結果見表 2，突變位點測序圖見圖 1。其中29號患者發生了2處突變，其他8例患者各有1處突變。從突變類型來看，點突變有8處，均為單堿基替換突變，G:C→A:T型置換最多，占1/2；C:G→A:T型占1/4；A:T→C:G型及C: G→G:C型各占1/8。插入突變有2處，且均為G插入突變。按突變影響分類，有7例錯義突變，1例同義突變，2例插入突變。從突變區域來看，第5、6、7、8外顯子突變各有5、2、1、2處，發生于第5外顯子的突變明顯高于其他外顯子區域，但差異無統計學意義（P > 0.05）。
表2
突變病例p53基因5-8外顯子的檢測結果
圖1
患者突變位點測序圖可見突變位點（藍箭）a. p53基因第5外顯子175密碼子突變（CGC→CAC）b. p53基因第6外顯子223密碼子突變（CCT→CAT）c. p53基因第6外顯子224密碼子突變（GAG→GAA）d. p53基因第7外顯子230密碼子突變（ACC→CCC）e. p53基因第8外顯子264、265密碼子突變（CTA→ATA，CTG→GTG）f. p53基因第5外顯子138密碼子插入突變（GCC→GGCC）g. p53基因第5外顯子164密碼子插入突變（AAG→AAGG）
分析Ⅰ、Ⅱ型患者中目標片段突變情況，發現Ⅰ型患者中p53基因突變僅1例（1/29）；而Ⅱ型患者p53基因突變8例（8/16），發生率明顯高于Ⅰ型患者，差異有統計學意義（P < 0.05）。分析各型EOC患者p53基因突變，發現Ⅰ型患者中僅24號患者的p53基因目標區域發生了突變，為同義突變，發生于第6外顯子，對應224位密碼子，編碼的氨基酸并未改變。而Ⅱ型突變患者中均為有效突變（6例錯義突變、2例插入突變）。可見Ⅱ型患者p53基因突變頻率和效率均明顯高于Ⅰ型患者。同時發現在Ⅱ型患者中p53基因第5外顯子突變率明顯高于其他外顯子，有3例患者在此區域檢測出175密碼子發生了錯義突變。
2.2 EOC患者臨床病理參數的比較
分析對比Ⅰ、Ⅱ型EOC患者臨床病理情況，發現Ⅰ型患者中淋巴結轉移1例（1/29）；而Ⅱ型患者中有7例（7/16），發生率明顯高于Ⅰ型患者，二者差異有統計學意義（P < 0.05）。Ⅱ型患者中累及輸卵管者有6例（6/16），組織學類型均為低分化漿液性腺癌；而Ⅰ型患者中累及輸卵管僅有1例（1/29），發生率明顯低于Ⅱ型患者，差異有統計學意義（P < 0.05）。Ⅰ型患者合并卵巢良性病變者有8例（8/29），而Ⅱ型患者中未發現有合并卵巢良性病變者，二者差異有統計學意義（P < 0.05）。Ⅱ型患者盆腹腔彌漫播散有8例（8/16），而Ⅰ型患者中僅發現有2例（2/29），二者差異有統計學意義（P < 0.05）。
在組織學分化差、淋巴結轉移、輸卵管受累、腹腔彌漫播散患者中p53突變率顯著升高，差異有統計學意義（P < 0.01）。臨床分期越晚、卵巢雙側受累及未合并良性病變患者中p53突變率也有升高趨勢，但與對照組比較差異無統計學意義（P > 0.05）。EOC患者病理參數間p53基因突變情況分析，見表 3。
表3
p53基因突變與EOC各病理參數的關系
3 討論
EOC患者中有9例在p53基因第5-8外顯子區域發生基因突變。對比Ⅰ、Ⅱ類型患者p53基因突變情況，發現Ⅱ型EOC突變率顯著高于Ⅰ型，提示p53突變在Ⅰ、Ⅱ型EOC分型中可能具有重要意義。有研究發現p53突變類型可影響p53抗體產生[13]，只有發生在基因中央部位的錯義突變才可誘導抗體的產生，而后者與宿主免疫狀態、惡性腫瘤發生等方面聯系密切[14]。本研究對比兩種類型EOC患者p53突變類型，發現只有Ⅱ型EOC在5-8外顯子區域發生錯義突變，而Ⅰ型患者中僅有1例同義突變。Ⅱ型EOC患者7處錯義突變中有3處發生于第175密碼子，而對應的3例患者均為高級別漿液性癌，推測175位密碼子突變可能與Ⅱ型EOC，尤其是高級別漿液性癌發生可能關系密切。
本研究分析p53基因突變與EOC組織學分級、淋巴轉移、卵巢受累、腹腔播散參數關系發現，在腫瘤惡性程度高，即組織學分化差、有淋巴結轉移、彌漫腹腔播散、雙側卵巢受累的患者中p53基因突變率顯著升高，而相應對照組突變率明顯降低，差異有統計學意義（P < 0.05）。同時結合Ⅰ、Ⅱ類型患者臨床病理分析，Ⅱ型EOC患者臨床病理與Ⅰ型明顯不同，其惡性程度更高，進展更迅速。本研究結果支持將EOC“二元論”學說，并佐證了Ⅱ型EOC惡性程度更高，預后更差的觀點。
關于Ⅰ、Ⅱ型EOC具體發病機制，有研究認為Ⅰ型腫瘤起源于卵巢生發上皮，有促進生長功能的激素可誘導皮質包涵囊腫上皮增生[15]，逐漸引發癌變。本研究對比了Ⅰ、Ⅱ型EOC患者合并良性病變（卵巢良性囊腫）情況，發現Ⅰ型患者中合并有良性病變率較高；而Ⅱ型患者未發現有此現象。因此，本研究結果支持Ⅰ型腫瘤由前體病變發展逐漸致癌的觀點。Ⅱ型EOC的發病機制目前尚不清楚，有研究發現高級別漿液性癌來源于輸卵管傘部[16-18]，p53突變可促使輸卵管上皮細胞增生，促發前體病變[19]，致癌因子可促使其獲得增生能力，發生輸卵管上皮內癌。由于輸卵管傘部在盆腔的位置特殊，在進展早期癌細胞即可脫落至卵巢表面或直接播散至盆腹腔。本研究對比了Ⅰ、Ⅱ型EOC患者切除的輸卵管組織病理結果，發現6例Ⅱ型患者輸卵管組織內發現有上皮癌灶，且組織學類型均為低分化漿液性腺癌，并伴有盆腹腔廣泛播散。Ⅰ型腫瘤患者中僅1例累及輸卵管，發生率明顯低于Ⅱ型，因此本研究結果亦支持Ⅱ型腫瘤可能來源于輸卵管的觀點，起病隱匿，腫瘤侵犯卵巢時已為轉移癌，故腫瘤迅速彌漫播散，預后極差。p53基因突變在Ⅱ型腫瘤發生中可能發揮至關重要作用[20]。
綜上所述，本研究結果支持EOC分為Ⅰ、Ⅱ兩型的構想，Ⅱ型EOC起病隱匿，惡性程度高，進展迅速，p53基因突變與EOC發病分型間可能有密切關系。p53基因突變在Ⅱ型EOC發生發展過程中可能發揮重要作用，其中175位密碼子有可能是Ⅱ型EOC的突變熱點。臨床有望通過檢測p53基因突變情況，對EOC高危人群進行篩查。對p53突變陽性的高危婦女，盡量完善輸卵管鏡檢查；在婦科手術中可對患者輸卵管傘部徹底詳細檢查，以期減少隱匿性癌的漏診率，從而提高EOC的早期診斷率。
卵巢癌是目前死亡率最高的女性生殖系統腫瘤[1]，其中上皮性卵巢癌（EOC）占卵巢癌發病的大多數，在所有卵巢癌中致死率最高[2]。EOC起病隱匿，難以早期發現[3]，大部分患者臨床發現已屬晚期，目前國際上雖采用了綜合治療的方案，但晚期患者長期生存率仍不容樂觀[4]。EOC病因學復雜，目前具體發病機制尚不清楚[5-6]。近來有研究提出可將EOC分為Ⅰ、Ⅱ兩種類型的“二元論”發病分型[6-9]，Ⅱ型EOC起病隱匿，惡性程度高，進展迅速，病死率高。p53基因是迄今發現與人類腫瘤相關性最高的基因，p53突變是EOC中常被描述的基因事件[5]，但目前關于p53基因在EOC發病中的具體作用仍有不同看法[10-12]。p53基因多數突變發生于保守區內的5-8外顯子上，目前p53基因5-8外顯子突變與EOC發病分型的相關性研究較少，本研究通過研究45例中國西部漢族人群原發EOC患者p53基因5-8外顯子區域突變情況，分析p53基因突變與EOC發病分型間的相關性。現報告如下。
1 資料與方法
1.1 一般資料
選取2011年8月－2012年12月在四川大學華西第二醫院手術并病理確診的四川省漢族原發性EOC患者45例，納入標準為術前未接受物理或手術治療，無全身或局部化學療法（化療）藥物使用史者。病理診斷由醫院婦科病理專家復核、確診。具體病理診斷標準為卵巢上皮細胞增生活躍及核異型，核分裂象增加，上皮細胞層次增加，如無間質浸潤，則為交界性卵巢癌（BOT）；如伴間質浸潤，則為EOC。
卵巢癌的臨床分期采用國際婦產科盟聯2000年制定的標準，卵巢癌病理組織學分級根據世界衛生組織分級標準并參照細胞分化程度進行組織學分級。所選EOC患者依據Shih等[7]提出的“二元論”發病分型，EOC患者可分為Ⅰ型（29例）、Ⅱ型（16例）2組，Ⅰ型腫瘤中包括8例BOT及21例低度惡性EOC；Ⅱ型包括高度惡性漿液性腺癌14例，混合性上皮癌及未分化癌各1例。
1.2 方法
應用聚合酶鏈反應（PCR）、PCR產物純化后DNA測序技術，分析45例原發性EOC患者p53基因第5、6、7、8外顯子突變情況，并結合研究對象的臨床病理參數進行統計分析。
1.2.1 樣本DNA的提取
取抗凝靜脈血200μL，使用離心柱型全血基因組DNA快速提取試劑盒（北京百泰克公司）提取外周血有核細胞基因組DNA，具體操作步驟嚴格按試劑盒說明書進行。用紫外分光檢測儀（美國Beckman公司）檢測提取后的DNA的濃度和純度，并記錄結果，?20℃保存。
1.2.2 目標片段體外擴增及DNA測序
p53基因第5-8外顯子區域共分成5-6、7、8外顯子3個DNA片段，使用表 1中的引物對各片段進行PCR擴增，經36個循環的PCR擴增后，對PCR擴增產物進行DNA測序。測序前先用PCR純化試劑盒純化PCR產物。純化后的PCR產物交由上海華津生物有限公司采用ABI 3730XL測序儀進行測序，具體操作嚴格按照Big Dye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit（ABI）試劑盒說明書進行。
表1
p53基因第5-8外顯子PCR擴增引物
1.2.3 觀察指標
在凝膠成像儀上觀察PCR擴增產物電泳條帶位置，若條帶清晰均勻且無雜帶，則表明該PCR擴增產物合格，并與核酸相對分子質量標準Marker比較擴增產物大小，判斷PCR擴增產物片段大小是否與目標片段相符合。將PCR擴增產物測序結果與人p53標準序列進行人工比對，并結合美國國立生物技術信息中心（NCBI）網站BLAST分析軟件，來判定突變情況，并根據其是否突變分為p53突變型和p53野生型。每組p53突變率=突變例數/每組總例數。
1.3 統計學方法
運用SPSS 17.0統計學軟件對數據進行統計學分析。計算各組患者樣本基因突變頻率及類型。計量資料采用均數±標準差表示，組間比較行成組設計兩樣本t檢驗；計數資料采用百分比表示，組間比較行χ2檢驗或Fisher確切概率法。檢驗水準α=0.05（雙側）。
2 結果
2.1 p53基因5-8外顯子區域突變檢測結果
分析45例EOC患者目標片段突變情況，共有9例患者在p53基因5-8外顯子區域發生了基因突變，其余36例EOC患者在目標區域未檢測到突變，突變患者檢測結果見表 2，突變位點測序圖見圖 1。其中29號患者發生了2處突變，其他8例患者各有1處突變。從突變類型來看，點突變有8處，均為單堿基替換突變，G:C→A:T型置換最多，占1/2；C:G→A:T型占1/4；A:T→C:G型及C: G→G:C型各占1/8。插入突變有2處，且均為G插入突變。按突變影響分類，有7例錯義突變，1例同義突變，2例插入突變。從突變區域來看，第5、6、7、8外顯子突變各有5、2、1、2處，發生于第5外顯子的突變明顯高于其他外顯子區域，但差異無統計學意義（P > 0.05）。
表2
突變病例p53基因5-8外顯子的檢測結果
圖1
患者突變位點測序圖可見突變位點（藍箭）a. p53基因第5外顯子175密碼子突變（CGC→CAC）b. p53基因第6外顯子223密碼子突變（CCT→CAT）c. p53基因第6外顯子224密碼子突變（GAG→GAA）d. p53基因第7外顯子230密碼子突變（ACC→CCC）e. p53基因第8外顯子264、265密碼子突變（CTA→ATA，CTG→GTG）f. p53基因第5外顯子138密碼子插入突變（GCC→GGCC）g. p53基因第5外顯子164密碼子插入突變（AAG→AAGG）
分析Ⅰ、Ⅱ型患者中目標片段突變情況，發現Ⅰ型患者中p53基因突變僅1例（1/29）；而Ⅱ型患者p53基因突變8例（8/16），發生率明顯高于Ⅰ型患者，差異有統計學意義（P < 0.05）。分析各型EOC患者p53基因突變，發現Ⅰ型患者中僅24號患者的p53基因目標區域發生了突變，為同義突變，發生于第6外顯子，對應224位密碼子，編碼的氨基酸并未改變。而Ⅱ型突變患者中均為有效突變（6例錯義突變、2例插入突變）。可見Ⅱ型患者p53基因突變頻率和效率均明顯高于Ⅰ型患者。同時發現在Ⅱ型患者中p53基因第5外顯子突變率明顯高于其他外顯子，有3例患者在此區域檢測出175密碼子發生了錯義突變。
2.2 EOC患者臨床病理參數的比較
分析對比Ⅰ、Ⅱ型EOC患者臨床病理情況，發現Ⅰ型患者中淋巴結轉移1例（1/29）；而Ⅱ型患者中有7例（7/16），發生率明顯高于Ⅰ型患者，二者差異有統計學意義（P < 0.05）。Ⅱ型患者中累及輸卵管者有6例（6/16），組織學類型均為低分化漿液性腺癌；而Ⅰ型患者中累及輸卵管僅有1例（1/29），發生率明顯低于Ⅱ型患者，差異有統計學意義（P < 0.05）。Ⅰ型患者合并卵巢良性病變者有8例（8/29），而Ⅱ型患者中未發現有合并卵巢良性病變者，二者差異有統計學意義（P < 0.05）。Ⅱ型患者盆腹腔彌漫播散有8例（8/16），而Ⅰ型患者中僅發現有2例（2/29），二者差異有統計學意義（P < 0.05）。
在組織學分化差、淋巴結轉移、輸卵管受累、腹腔彌漫播散患者中p53突變率顯著升高，差異有統計學意義（P < 0.01）。臨床分期越晚、卵巢雙側受累及未合并良性病變患者中p53突變率也有升高趨勢，但與對照組比較差異無統計學意義（P > 0.05）。EOC患者病理參數間p53基因突變情況分析，見表 3。
表3
p53基因突變與EOC各病理參數的關系
3 討論
EOC患者中有9例在p53基因第5-8外顯子區域發生基因突變。對比Ⅰ、Ⅱ類型患者p53基因突變情況，發現Ⅱ型EOC突變率顯著高于Ⅰ型，提示p53突變在Ⅰ、Ⅱ型EOC分型中可能具有重要意義。有研究發現p53突變類型可影響p53抗體產生[13]，只有發生在基因中央部位的錯義突變才可誘導抗體的產生，而后者與宿主免疫狀態、惡性腫瘤發生等方面聯系密切[14]。本研究對比兩種類型EOC患者p53突變類型，發現只有Ⅱ型EOC在5-8外顯子區域發生錯義突變，而Ⅰ型患者中僅有1例同義突變。Ⅱ型EOC患者7處錯義突變中有3處發生于第175密碼子，而對應的3例患者均為高級別漿液性癌，推測175位密碼子突變可能與Ⅱ型EOC，尤其是高級別漿液性癌發生可能關系密切。
本研究分析p53基因突變與EOC組織學分級、淋巴轉移、卵巢受累、腹腔播散參數關系發現，在腫瘤惡性程度高，即組織學分化差、有淋巴結轉移、彌漫腹腔播散、雙側卵巢受累的患者中p53基因突變率顯著升高，而相應對照組突變率明顯降低，差異有統計學意義（P < 0.05）。同時結合Ⅰ、Ⅱ類型患者臨床病理分析，Ⅱ型EOC患者臨床病理與Ⅰ型明顯不同，其惡性程度更高，進展更迅速。本研究結果支持將EOC“二元論”學說，并佐證了Ⅱ型EOC惡性程度更高，預后更差的觀點。
關于Ⅰ、Ⅱ型EOC具體發病機制，有研究認為Ⅰ型腫瘤起源于卵巢生發上皮，有促進生長功能的激素可誘導皮質包涵囊腫上皮增生[15]，逐漸引發癌變。本研究對比了Ⅰ、Ⅱ型EOC患者合并良性病變（卵巢良性囊腫）情況，發現Ⅰ型患者中合并有良性病變率較高；而Ⅱ型患者未發現有此現象。因此，本研究結果支持Ⅰ型腫瘤由前體病變發展逐漸致癌的觀點。Ⅱ型EOC的發病機制目前尚不清楚，有研究發現高級別漿液性癌來源于輸卵管傘部[16-18]，p53突變可促使輸卵管上皮細胞增生，促發前體病變[19]，致癌因子可促使其獲得增生能力，發生輸卵管上皮內癌。由于輸卵管傘部在盆腔的位置特殊，在進展早期癌細胞即可脫落至卵巢表面或直接播散至盆腹腔。本研究對比了Ⅰ、Ⅱ型EOC患者切除的輸卵管組織病理結果，發現6例Ⅱ型患者輸卵管組織內發現有上皮癌灶，且組織學類型均為低分化漿液性腺癌，并伴有盆腹腔廣泛播散。Ⅰ型腫瘤患者中僅1例累及輸卵管，發生率明顯低于Ⅱ型，因此本研究結果亦支持Ⅱ型腫瘤可能來源于輸卵管的觀點，起病隱匿，腫瘤侵犯卵巢時已為轉移癌，故腫瘤迅速彌漫播散，預后極差。p53基因突變在Ⅱ型腫瘤發生中可能發揮至關重要作用[20]。
綜上所述，本研究結果支持EOC分為Ⅰ、Ⅱ兩型的構想，Ⅱ型EOC起病隱匿，惡性程度高，進展迅速，p53基因突變與EOC發病分型間可能有密切關系。p53基因突變在Ⅱ型EOC發生發展過程中可能發揮重要作用，其中175位密碼子有可能是Ⅱ型EOC的突變熱點。臨床有望通過檢測p53基因突變情況，對EOC高危人群進行篩查。對p53突變陽性的高危婦女，盡量完善輸卵管鏡檢查；在婦科手術中可對患者輸卵管傘部徹底詳細檢查，以期減少隱匿性癌的漏診率，從而提高EOC的早期診斷率。
