引用本文： 胡靜, 李立新, 武永康, 魏大鵬, 彭曉東. 抗細胞膜DNA抗體與其他自身抗體的檢測及相關分析. 華西醫學, 2016, 31(8): 1372-1375. doi: 10.7507/1002-0179.201600374 復制
系統性紅斑狼瘡（SLE）是一種常見的自身免疫性疾病，常累及多個器官和系統，對患者危害性極大，準確診斷該病對指導治療有重要意義。患者血清中可出現多種自身抗體，其中具有診斷價值的特異性自身抗體有抗Sm抗體、抗雙鏈DNA（dsDNA）抗體及抗核糖體抗體等，但其靈敏度不高，僅有10%～40%[1-3]。細胞膜DNA（mDNA）是一種線性雙鏈DNA分子，有17 000個堿基對[4]，SLE患者中存在mDNA受體功能障礙，使mDNA不能正常移除[5]，誘導機體產生特異性的抗mDNA抗體。有文獻報道，抗mDNA在SLE中陽性率高且特異性強[6]，并且在dsDNA、Sm及抗核小體抗體陰性的SLE中也能檢出[7-8]。本研究擬收集我院門診和住院患者，檢測抗mDNA自身抗體以及其他相關自身抗體，評價幾種自身抗體的相關性及其在SLE中的診斷價值。現報告如下。
1 資料與方法
1.1 標本來源
收集2015年1月－8月四川大學華西醫院門診和住院的254例自身免疫性疾病患者血清，包括SLE 106例，類風濕關節炎（RA）80例，混合性結締組織病（MCTD）32例，干燥綜合征（SS）29例，多發性肌炎/皮肌炎（PM/DM）7例，以上各種疾病均符合目前國際診斷標準；另收集20例來我院作健康體檢正常者的血清。所有血清放置?20℃凍存待用。
1.2 試劑及儀器
1.2.1 試劑
Raji細胞（Burkitt淋巴瘤細胞）來自四川大學基礎與法醫學院免疫學教研室；抗核抗體（ANA）、抗dsDNA抗體、抗角蛋白抗體（AKA）檢測試劑盒由德國歐蒙實驗診斷試劑有限公司提供，熒光二抗采用異硫氰酸熒光素（FITC）標記羊抗人免疫球蛋白（Ig）G抗體；抗環瓜氨酸肽（CCP）抗體檢測試劑盒由廣州萬孚生物技術有限公司提供；Sm檢測采用德國歐蒙實驗診斷試劑有限公司提供的抗可溶性抗原譜試劑盒。
1.2.2 儀器
熒光顯微鏡（日本尼康公司）；IMMAGE自動分析儀（美國貝克曼公司）；酶標儀（日本Benchmark公司）。
1.3 方法
1.3.1 抗mDNA抗體檢測
①抗原基質片的制備：收集處于對數生長期的Raji細胞，用Hank液洗滌3次，調節細胞濃度為1×106個/mL，混勻后用微量移液器取10μL加于載物片上反應區，待干燥后分別用70%、75%、80%、85%、90%、95%、100%乙醇固定30 min，取出待干燥后密封置于?20℃凍存備用。②間接免疫熒光方法檢測：待測血清用0.01 mol/L pH值7.2磷酸鹽緩沖液1：20稀釋，滴加25μL于固定有Raji細胞的載物片反應區內，濕盒室溫孵育30 min，洗滌浸泡1～5 min，滴加20μL FITC標記的二抗于載物片反應區內，室溫孵育30 min，洗滌浸泡1～5 min，滴加緩沖甘油封片，在熒光顯微鏡下觀察。Raji細胞膜呈現光滑熒光者判為陽性（圖 1）。
圖1
熒光顯微鏡下抗mDNA抗體陽性圖
1.3.2 ANA、抗dsDNA抗體、AKA檢測
嚴格按使用說明書進行操作和結果判斷，血清稀釋為ANA1：100，抗dsDNA抗體和AKA 1：10。
1.3.3 類風濕因子（RF）檢測
用美國貝克曼公司生產的IMMAGE自動分析儀進行檢測，采用速率散射比濁法，RF值＞20 U/mL為陽性。
1.3.4 抗CCP抗體檢測
嚴格按使用說明書操作，結果判斷使用標準曲線：將CCP IgG強陽性標準品用樣品稀釋液作倍比稀釋（其濃度分別為200、100、50 U），加上弱陽性標準品（濃度25 U）和試劑空白（樣品稀釋液）繪制標準曲線，以樣品吸光度值在標準曲線上查出抗體濃度，＜20 U為陰性，≥20 U為陽性。
1.3.5 抗Sm抗體檢測
嚴格按使用說明書進行操作和結果判斷，血清稀釋為1：100。
1.4 統計學方法
用SPSS 11.0統計軟件進行統計分析。采用四格表計算抗mDNA抗體對診斷SLE的靈敏度和特異度，計數資料的統計采用χ2檢驗，對抗mDNA抗體與其他6種抗體的相關性采用Pearson相關分析。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 各組抗mDNA抗體陽性率
抗mDNA抗體在SLE患者中的陽性率最高（72.6%），高于其他疾病組（0.0%～18.7%）及健康對照組（0.0%），差異有統計學意義（P < 0.001）。見表 1。
表1
抗mDNA抗體在各組中的分布情況
2.2 抗mDNA抗體對于SLE的靈敏度和特異度
對274例研究血清檢測抗mDNA抗體，106例SLE中有77例抗mDNA抗體陽性，168例非SLE中有14例陽性，抗mDNA抗體對SLE診斷的靈敏度為72.6%，特異度為91.7%（154/168），診斷效率為84.3%。見表 2。
表2
抗mDNA抗體對SLE診斷的四格表（例）
2.3 抗mDNA抗體與幾種自身抗體的相關性分析
對179例血清進行了抗mDNA抗體、抗CCP抗體、AKA、RF、ANA及dsDNA檢測，其中83例血清檢測了抗Sm抗體，結果見表 3。Pearson相關分析結果顯示抗mDNA抗體與ANA、抗dsDNA抗體和抗Sm抗體相關（P < 0.001），與抗CCP抗體、AKA和RF無相關性（P > 0.05）。
表3
抗mDNA抗體與其他6種抗體的相關性（例）
3 討論
Raji細胞是EB病毒感染的B細胞，以Raji細胞為底物檢測自身抗體的研究始于1975年[9]，有學者將Raji細胞與HL60細胞分別作為底物用間接免疫熒光的方法檢測抗mDNA抗體，其兩者的特異度和靈敏度無較明顯的區別，但Raji細胞作為底物的熒光強度更明顯，結果更穩定[10]。本研究中我們以Raji細胞為底物，用間接免疫熒光方法檢測多種自身免疫性疾病患者血清中的抗mDNA抗體，發現Raji細胞呈熒光陽性者中SLE占大多數（72.6%），明顯高于RA（5.0%）、MCTD（18.7%）、SS（14.7%）、PM/DM（0.0%）及健康對照組（0.0%），差異有統計學意義（P < 0.001），抗mDNA抗體對SLE診斷的靈敏度和特異度分別為72.6%和91.7%，該結果提示抗mDNA抗體應用于SLE疾病的診斷是高敏感和高特異的，與之前的報道結果基本一致[11-13]。
針對這幾個抗體，本研究進一步將抗mDNA抗體與3種RA特異性自身抗體（包括抗CCP抗體、RF和AKA）、2種SLE特異性自身抗體（包括抗Sm抗體、抗dsDNA抗體）以及ANA的相關性進行研究，結果顯示：抗mDNA抗體與抗CCP抗體、AKA及RF均無顯著相關性（P > 0.05）；抗mDNA抗體與ANA、抗Sm抗體及抗dsDNA抗體顯著相關（P < 0.001）。因此，本研究的結果再次表明以Raji細胞為底物用間接免疫熒光法檢測的抗mDNA抗體是SLE特異的自身抗體。
已有學者研究發現EB病毒是SLE的病原學因素，幾乎所有成人SLE均感染過EB病毒，感染率可達95%[14]，EB病毒持續感染產生的EB病毒核抗原（EBNA）可能誘導機體發生自身免疫反應[15]。在SLE的成人及兒童患者中可以檢測到抗EB病毒早期抗原（EBV-EA）抗體、抗EB病毒核抗原抗體（EBV-VCA），且陽性率均高于健康對照組[16]。EB病毒與自身抗體的產生有關，已有研究發現EBNA-1N端35-38序列（EB病毒編碼核抗原之一）與核糖核蛋白SmD C端95-119具有高度同源性，正常人、EB病毒相關疾病和自身免疫疾病均可產生抗EBNA-1 N端35-38抗體，但只有從SLE親和純化來的該抗體與SmD C端有相似的親和力，也和SmD結合（免疫印跡法），即SLE有與自身抗原交叉反應的抗病毒抗體，其陽性率為38%；EBNA-2354GRGKGKSRDKQRK PGGPWRP373序列和核糖核蛋白SmD1 101GRGRGRGRGRGRGRGGPRR119具有高度同源性，EBNA-2病毒誘導的抗體可能與SmD1抗體發生交叉反應[17]。本研究也發現抗mDNA抗體與抗Sm抗體顯著相關，是否提示以Raji細胞（EB病毒感染B細胞）為底物檢測到的抗mDNA抗體所針對抗原的本質是EB病毒成分？這還有待于進一步研究。
綜上所述，抗mDNA抗體對SLE的診斷具有高度敏感性和特異性，推廣此項檢測有助于提高臨床醫生診斷SLE的準確性，具有重要意義。進一步研究抗mDNA抗體所針對抗原的本質，可能會有助于揭示SLE發病機制，為診斷和治療SLE提供更加可靠的科學依據。
系統性紅斑狼瘡（SLE）是一種常見的自身免疫性疾病，常累及多個器官和系統，對患者危害性極大，準確診斷該病對指導治療有重要意義。患者血清中可出現多種自身抗體，其中具有診斷價值的特異性自身抗體有抗Sm抗體、抗雙鏈DNA（dsDNA）抗體及抗核糖體抗體等，但其靈敏度不高，僅有10%～40%[1-3]。細胞膜DNA（mDNA）是一種線性雙鏈DNA分子，有17 000個堿基對[4]，SLE患者中存在mDNA受體功能障礙，使mDNA不能正常移除[5]，誘導機體產生特異性的抗mDNA抗體。有文獻報道，抗mDNA在SLE中陽性率高且特異性強[6]，并且在dsDNA、Sm及抗核小體抗體陰性的SLE中也能檢出[7-8]。本研究擬收集我院門診和住院患者，檢測抗mDNA自身抗體以及其他相關自身抗體，評價幾種自身抗體的相關性及其在SLE中的診斷價值。現報告如下。
1 資料與方法
1.1 標本來源
收集2015年1月－8月四川大學華西醫院門診和住院的254例自身免疫性疾病患者血清，包括SLE 106例，類風濕關節炎（RA）80例，混合性結締組織病（MCTD）32例，干燥綜合征（SS）29例，多發性肌炎/皮肌炎（PM/DM）7例，以上各種疾病均符合目前國際診斷標準；另收集20例來我院作健康體檢正常者的血清。所有血清放置?20℃凍存待用。
1.2 試劑及儀器
1.2.1 試劑
Raji細胞（Burkitt淋巴瘤細胞）來自四川大學基礎與法醫學院免疫學教研室；抗核抗體（ANA）、抗dsDNA抗體、抗角蛋白抗體（AKA）檢測試劑盒由德國歐蒙實驗診斷試劑有限公司提供，熒光二抗采用異硫氰酸熒光素（FITC）標記羊抗人免疫球蛋白（Ig）G抗體；抗環瓜氨酸肽（CCP）抗體檢測試劑盒由廣州萬孚生物技術有限公司提供；Sm檢測采用德國歐蒙實驗診斷試劑有限公司提供的抗可溶性抗原譜試劑盒。
1.2.2 儀器
熒光顯微鏡（日本尼康公司）；IMMAGE自動分析儀（美國貝克曼公司）；酶標儀（日本Benchmark公司）。
1.3 方法
1.3.1 抗mDNA抗體檢測
①抗原基質片的制備：收集處于對數生長期的Raji細胞，用Hank液洗滌3次，調節細胞濃度為1×106個/mL，混勻后用微量移液器取10μL加于載物片上反應區，待干燥后分別用70%、75%、80%、85%、90%、95%、100%乙醇固定30 min，取出待干燥后密封置于?20℃凍存備用。②間接免疫熒光方法檢測：待測血清用0.01 mol/L pH值7.2磷酸鹽緩沖液1：20稀釋，滴加25μL于固定有Raji細胞的載物片反應區內，濕盒室溫孵育30 min，洗滌浸泡1～5 min，滴加20μL FITC標記的二抗于載物片反應區內，室溫孵育30 min，洗滌浸泡1～5 min，滴加緩沖甘油封片，在熒光顯微鏡下觀察。Raji細胞膜呈現光滑熒光者判為陽性（圖 1）。
圖1
熒光顯微鏡下抗mDNA抗體陽性圖
1.3.2 ANA、抗dsDNA抗體、AKA檢測
嚴格按使用說明書進行操作和結果判斷，血清稀釋為ANA1：100，抗dsDNA抗體和AKA 1：10。
1.3.3 類風濕因子（RF）檢測
用美國貝克曼公司生產的IMMAGE自動分析儀進行檢測，采用速率散射比濁法，RF值＞20 U/mL為陽性。
1.3.4 抗CCP抗體檢測
嚴格按使用說明書操作，結果判斷使用標準曲線：將CCP IgG強陽性標準品用樣品稀釋液作倍比稀釋（其濃度分別為200、100、50 U），加上弱陽性標準品（濃度25 U）和試劑空白（樣品稀釋液）繪制標準曲線，以樣品吸光度值在標準曲線上查出抗體濃度，＜20 U為陰性，≥20 U為陽性。
1.3.5 抗Sm抗體檢測
嚴格按使用說明書進行操作和結果判斷，血清稀釋為1：100。
1.4 統計學方法
用SPSS 11.0統計軟件進行統計分析。采用四格表計算抗mDNA抗體對診斷SLE的靈敏度和特異度，計數資料的統計采用χ2檢驗，對抗mDNA抗體與其他6種抗體的相關性采用Pearson相關分析。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 各組抗mDNA抗體陽性率
抗mDNA抗體在SLE患者中的陽性率最高（72.6%），高于其他疾病組（0.0%～18.7%）及健康對照組（0.0%），差異有統計學意義（P < 0.001）。見表 1。
表1
抗mDNA抗體在各組中的分布情況
2.2 抗mDNA抗體對于SLE的靈敏度和特異度
對274例研究血清檢測抗mDNA抗體，106例SLE中有77例抗mDNA抗體陽性，168例非SLE中有14例陽性，抗mDNA抗體對SLE診斷的靈敏度為72.6%，特異度為91.7%（154/168），診斷效率為84.3%。見表 2。
表2
抗mDNA抗體對SLE診斷的四格表（例）
2.3 抗mDNA抗體與幾種自身抗體的相關性分析
對179例血清進行了抗mDNA抗體、抗CCP抗體、AKA、RF、ANA及dsDNA檢測，其中83例血清檢測了抗Sm抗體，結果見表 3。Pearson相關分析結果顯示抗mDNA抗體與ANA、抗dsDNA抗體和抗Sm抗體相關（P < 0.001），與抗CCP抗體、AKA和RF無相關性（P > 0.05）。
表3
抗mDNA抗體與其他6種抗體的相關性（例）
3 討論
Raji細胞是EB病毒感染的B細胞，以Raji細胞為底物檢測自身抗體的研究始于1975年[9]，有學者將Raji細胞與HL60細胞分別作為底物用間接免疫熒光的方法檢測抗mDNA抗體，其兩者的特異度和靈敏度無較明顯的區別，但Raji細胞作為底物的熒光強度更明顯，結果更穩定[10]。本研究中我們以Raji細胞為底物，用間接免疫熒光方法檢測多種自身免疫性疾病患者血清中的抗mDNA抗體，發現Raji細胞呈熒光陽性者中SLE占大多數（72.6%），明顯高于RA（5.0%）、MCTD（18.7%）、SS（14.7%）、PM/DM（0.0%）及健康對照組（0.0%），差異有統計學意義（P < 0.001），抗mDNA抗體對SLE診斷的靈敏度和特異度分別為72.6%和91.7%，該結果提示抗mDNA抗體應用于SLE疾病的診斷是高敏感和高特異的，與之前的報道結果基本一致[11-13]。
針對這幾個抗體，本研究進一步將抗mDNA抗體與3種RA特異性自身抗體（包括抗CCP抗體、RF和AKA）、2種SLE特異性自身抗體（包括抗Sm抗體、抗dsDNA抗體）以及ANA的相關性進行研究，結果顯示：抗mDNA抗體與抗CCP抗體、AKA及RF均無顯著相關性（P > 0.05）；抗mDNA抗體與ANA、抗Sm抗體及抗dsDNA抗體顯著相關（P < 0.001）。因此，本研究的結果再次表明以Raji細胞為底物用間接免疫熒光法檢測的抗mDNA抗體是SLE特異的自身抗體。
已有學者研究發現EB病毒是SLE的病原學因素，幾乎所有成人SLE均感染過EB病毒，感染率可達95%[14]，EB病毒持續感染產生的EB病毒核抗原（EBNA）可能誘導機體發生自身免疫反應[15]。在SLE的成人及兒童患者中可以檢測到抗EB病毒早期抗原（EBV-EA）抗體、抗EB病毒核抗原抗體（EBV-VCA），且陽性率均高于健康對照組[16]。EB病毒與自身抗體的產生有關，已有研究發現EBNA-1N端35-38序列（EB病毒編碼核抗原之一）與核糖核蛋白SmD C端95-119具有高度同源性，正常人、EB病毒相關疾病和自身免疫疾病均可產生抗EBNA-1 N端35-38抗體，但只有從SLE親和純化來的該抗體與SmD C端有相似的親和力，也和SmD結合（免疫印跡法），即SLE有與自身抗原交叉反應的抗病毒抗體，其陽性率為38%；EBNA-2354GRGKGKSRDKQRK PGGPWRP373序列和核糖核蛋白SmD1 101GRGRGRGRGRGRGRGGPRR119具有高度同源性，EBNA-2病毒誘導的抗體可能與SmD1抗體發生交叉反應[17]。本研究也發現抗mDNA抗體與抗Sm抗體顯著相關，是否提示以Raji細胞（EB病毒感染B細胞）為底物檢測到的抗mDNA抗體所針對抗原的本質是EB病毒成分？這還有待于進一步研究。
綜上所述，抗mDNA抗體對SLE的診斷具有高度敏感性和特異性，推廣此項檢測有助于提高臨床醫生診斷SLE的準確性，具有重要意義。進一步研究抗mDNA抗體所針對抗原的本質，可能會有助于揭示SLE發病機制，為診斷和治療SLE提供更加可靠的科學依據。
