引用本文： 周愛妍, 杜迎, 史傳奎. 健脾化濕法對特應性皮炎小鼠皮膚水通道蛋白3表達的影響. 華西醫學, 2016, 31(1): 119-121. doi: 10.7507/1002-0179.20160033 復制
特應性皮炎（AD）是一種與遺傳過敏素質有關的慢性炎癥性皮膚病，該病反復發作，病程慢性。中醫又稱“浸淫瘡”“四彎風”“奶癬”“濕瘡”。其中醫發病機制包括脾虛濕困、血虛風燥、風濕蘊膚等，脾虛濕困是兒童AD最常見的病機[1]。健脾化濕法治療AD是臨床醫生常用的治療手段，從臨床效果看療效比較顯著，免疫調節和抗炎作用是目前研究較多的作用機制[1-2]。水通道蛋白（AQP）廣泛存在于組織器官內，其主要作用是維持體內水平衡。水液代謝障礙性疾病與AQP關系密切，并有研究報道AQP與中醫津液代謝理論相關[3]，亦有水通道蛋白3（AQP3）與AD發病機制相關的報道[4]。AQP與健脾化濕法都與津液代謝有關，關于健脾化濕法是否通過調節皮膚AQP3的表達來發揮治療作用的報道較少。本研究運用健脾化濕法治療AD小鼠，觀察其皮膚AQP3的表達與分布，以探尋健脾化濕法治療AD的部分作用機制，為進一步闡明健脾化濕法治療AD的分子生物學機制提供理論依據。現報告如下。
1 材料與方法
1.1 實驗動物
選取7周齡健康昆明小鼠30只，雌雄各半，體質量18～22 g，由山東大學實驗動物中心提供，合格證號：scxk（魯）20090001。
1.2 方法
1.2.1 實驗試劑
兔抗人血清白蛋白抗體（Rbabit Anti）-AQP3（北京博奧森生物技術有限公司）、通用型二抗試劑盒（PV-9000）和二氨基聯苯胺（DAB）（ZLI-9032）均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。
1.2.2 實驗藥物
小兒健脾化濕方水煎液方藥組成：黨參15 g，白術15 g，陳皮6 g，白鮮皮12 g，土茯苓12 g，當歸9 g，生地12 g，地膚子9 g，丹皮9 g，茯苓15 g，蒼術12 g，甘草6 g。將上述生藥1付的劑量添加自來水750 mL浸泡1 h，煎煮30 min后過濾，藥渣再加自來水500 mL煎煮20 min，過濾，然后合并2次藥液，在80℃恒溫浴條件下，將其濃縮成100%水煎液，放置于4℃冰箱保存備用。
1.2.3 小鼠分組及皮損誘導
按照隨機數字表將30只7周齡昆明小鼠隨機分成中藥模型組、空白模型組、空白對照組，每組10只。皮炎模型建立參考二硝基氯苯（DNCB）誘發Nc/Nga小鼠皮炎的文獻[5-7]：第1周空白對照組小鼠背部外涂丙酮溶液1次，用量為100 μL，空白模型組、中藥模型組小鼠背部外涂含5%DNCB的丙酮溶液1次，用量為100 μL；第2～ 4周，空白對照組耳朵皮膚外涂丙酮溶液100 μL，空白模型組、中藥模型組小鼠耳部皮膚涂抹0.1%DNCB的丙酮溶液100 μL，1次/周。
1.2.4 給藥及標本收集
小鼠給藥劑量換算方法說明：給藥劑量換算方法參考《中藥藥理研究方法學》第2版人小鼠劑量轉換公式[8]：d小鼠=d人×k小鼠/k人，其中d小鼠是小鼠的每千克體質量劑量，d人是已知人的每千克體質量劑量，k小鼠是小鼠的折算系數，k人是人的折算系數；k小鼠=l，k人=0.11，成人平均體質量按60 kg計算，小鼠平均體質量按20 g計算，d人=成人每日用量/60。
小鼠分組完成后，空白對照組和空白模型組采用生理鹽水灌胃，2次/d，劑量為10 mL/kg；中藥模型組給予小兒健脾化濕方水煎液灌胃，2次/d，劑量為10 mL/kg。等小鼠鼠齡達到11周齡時，取小鼠背部皮膚組織，用甲醛固定。
1.2.5 免疫組織化學染色法觀察3組小鼠AQP3表達
所有標本均經過甲醛溶液固定，石蠟包埋，5 μm厚度連續切片，常規脫蠟至水；3%過氧化氫室溫孵育6 min；磷酸鹽緩沖液（PBS）洗2 min×3次；滴加抗體兔抗AQP3[Rabbit Anti-AQP3（H-80）：ZS-20812]，工作濃度l︰100，置于4℃冰箱過夜；滴加生物素標記山羊抗兔 IgG（Pv-9001），室溫20 min；PBS沖洗2 min×3次；滴加辣根酶標記鏈霉卵白素工作液，室溫30 min；PBS沖洗2 min×3次；滴加DBA顯色，鏡下觀察，適時終止反應，自來水沖洗；蘇木精輕度復染3 min；常規脫水、透明，中性樹膠封片。
1.2.6 結果判定
采用BI2000醫學圖像分析系統進行圖像分析，選取200倍圖像，AQP3陽性表達細胞呈棕黃色，隨機選取每張切片的3～5個高倍視野來測定平均吸光度[A，舊稱光密度（OD）]值，平均A值代表陽性表達強度，陽性表達越強，平均A值就越大。判定標準以細胞染成棕黃色為陽性結果[4]。
1.3 統計學方法
采用SPSS 13.0軟件進行統計學處理。計量資料以均數±標準差表示，組間比較采用Dunnett-t檢驗。檢驗水準α=0.01。
2 結果
2.1 各組小鼠皮膚組織AQP3平均A值比較
空白模型組小鼠皮膚組織中AQP3平均A值（0.611±0.063）高于空白對照組AQP3平均A值（0.261±0.040），差異有統計學意義（P＜0.01）；中藥模型組小鼠皮膚組織AQP3平均A值（0.450±0.061）較空白模型組降低，差異有統計學意義（P＜0.01）。
2.2 各組小鼠皮膚組織AQP3表達分布比較
空白對照組小鼠皮膚AQP3主要分布在表皮基底層中，染色強度較弱，角質層及真皮層無表達；而空白模型組皮損中AQP3基本分布于基底層到棘層的全部區域，皮膚的附屬器中，如毛囊中、皮脂腺中也有表達。中藥模型組皮損中AQP3主要表達于基底層，棘層有少量表達。見圖 1。
圖1
小鼠皮膚免疫組織化學病理切片（PV二步法檢測×200）
a.空白對照組AQP3主要分布于表皮基底層中，染色強度較弱 b. 空白模型組AQP3基本分布于基底層到棘層的全部區域，皮膚的附屬器如毛囊中、皮脂腺中也有表達 c.中藥模型組AQP3主要表達于基底層，棘層有很少部分表達
3 討論
AD是一種慢性、瘙癢性、反復發作的炎癥性皮膚病，其發病率呈逐年上升趨勢。AD發病機制復雜，可能與遺傳、環境、免疫異常、超敏反應及精神因素等有關。目前尚無根治的好辦法。動物模型為研究人類AD較為常用的研究對象，家兔、大鼠、小鼠、豚鼠等最為常用。其中昆明小鼠以價格低廉、與人類 AD相似、模型易建立等優勢而備受青睞[9]。
AQP3在正常皮膚僅表達于基底層細胞。但在病理或某些生理情況下，AQP3的表達會有所變化。研究發現，通過調節AQP3的表達及分布，能夠改變干燥性皮膚的含水量，減少水分丟失[10]。AQP3相關研究主要是以小鼠和人表皮為研究對象。有研究分別取小鼠腹部、背部、下唇、眼瞼、耳和爪處的皮膚，利用間接免疫熒光技術檢測小鼠上皮，發現AQP3主要位于基底層，同時皮膚的附屬器如毛囊的外毛根鞘、皮脂腺等也存在[11]。AQP3在基底層的表達明顯多于棘層，而在顆粒層、角質層幾乎無表達[12-13]。在AD發作期間，AQP3 mRNA表達增多，除了基底層，棘細胞層也有少許表達。這與AD患者經皮失水增加，皮膚干燥加重有密切關系[14]。有學者推測AQP3的高表達導致表皮水梯度破壞使其屏障保護功能削弱，導致經皮水丟失增加從而引起皮膚干燥[14]。
本研究可見，空白對照組小鼠皮膚AQP3主要分布于表皮基底層中，染色強度較弱，角質層及真皮層無表達；而空白模型組皮損中AQP3基本分布于基底層到棘層的全部區域，毛囊及皮脂腺等皮膚附屬器中也有少量分布；AD模型組小鼠皮膚組織中AQP3表達增多，提示皮膚屏障功能破壞、水分丟失增多可導致AD小鼠皮膚AQP3表達的增多和分布改變。中藥模型組皮膚組織中AQP3主要表達于基底層，很少部分分布于棘層。AQP3的平均A值結果顯示，AD小鼠皮膚AQP3平均A值較空白對照組升高，差異有統計學意義（P＜0.05）；中藥模型組小鼠皮膚組織AQP3平均A值較空白模型組降低，其差異有統計學意義（P＜0.05）。可見健脾化濕法有利于受損皮膚組織的恢復。
在小兒健脾化濕方中白術、蒼術、茯苓、陳皮等有理氣健脾、燥濕利水的功效，白鮮皮、地膚子則可清熱利濕、脾氣健運，濕邪得以祛除，津液得以正常敷布，留滯體內水津有所出路，故而皮損得以修復。本研究結果顯示健脾化濕方能調節皮膚AQP3的含量和分布，為健脾化濕法治療AD的機制提供了理論支持。
綜上所述，皮膚屏障破壞可以導致AD小鼠皮膚AQP3的表達增多，分布也有所改變，因此皮膚組織中AQP3的增多和分布改變可以提示皮膚屏障功能破壞、水分丟失增加。健脾化濕法可以調節皮膚AQP3的含量和分布，恢復受損的皮膚屏障，有利于受損皮膚組使織的修復。
特應性皮炎（AD）是一種與遺傳過敏素質有關的慢性炎癥性皮膚病，該病反復發作，病程慢性。中醫又稱“浸淫瘡”“四彎風”“奶癬”“濕瘡”。其中醫發病機制包括脾虛濕困、血虛風燥、風濕蘊膚等，脾虛濕困是兒童AD最常見的病機[1]。健脾化濕法治療AD是臨床醫生常用的治療手段，從臨床效果看療效比較顯著，免疫調節和抗炎作用是目前研究較多的作用機制[1-2]。水通道蛋白（AQP）廣泛存在于組織器官內，其主要作用是維持體內水平衡。水液代謝障礙性疾病與AQP關系密切，并有研究報道AQP與中醫津液代謝理論相關[3]，亦有水通道蛋白3（AQP3）與AD發病機制相關的報道[4]。AQP與健脾化濕法都與津液代謝有關，關于健脾化濕法是否通過調節皮膚AQP3的表達來發揮治療作用的報道較少。本研究運用健脾化濕法治療AD小鼠，觀察其皮膚AQP3的表達與分布，以探尋健脾化濕法治療AD的部分作用機制，為進一步闡明健脾化濕法治療AD的分子生物學機制提供理論依據。現報告如下。
1 材料與方法
1.1 實驗動物
選取7周齡健康昆明小鼠30只，雌雄各半，體質量18～22 g，由山東大學實驗動物中心提供，合格證號：scxk（魯）20090001。
1.2 方法
1.2.1 實驗試劑
兔抗人血清白蛋白抗體（Rbabit Anti）-AQP3（北京博奧森生物技術有限公司）、通用型二抗試劑盒（PV-9000）和二氨基聯苯胺（DAB）（ZLI-9032）均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。
1.2.2 實驗藥物
小兒健脾化濕方水煎液方藥組成：黨參15 g，白術15 g，陳皮6 g，白鮮皮12 g，土茯苓12 g，當歸9 g，生地12 g，地膚子9 g，丹皮9 g，茯苓15 g，蒼術12 g，甘草6 g。將上述生藥1付的劑量添加自來水750 mL浸泡1 h，煎煮30 min后過濾，藥渣再加自來水500 mL煎煮20 min，過濾，然后合并2次藥液，在80℃恒溫浴條件下，將其濃縮成100%水煎液，放置于4℃冰箱保存備用。
1.2.3 小鼠分組及皮損誘導
按照隨機數字表將30只7周齡昆明小鼠隨機分成中藥模型組、空白模型組、空白對照組，每組10只。皮炎模型建立參考二硝基氯苯（DNCB）誘發Nc/Nga小鼠皮炎的文獻[5-7]：第1周空白對照組小鼠背部外涂丙酮溶液1次，用量為100 μL，空白模型組、中藥模型組小鼠背部外涂含5%DNCB的丙酮溶液1次，用量為100 μL；第2～ 4周，空白對照組耳朵皮膚外涂丙酮溶液100 μL，空白模型組、中藥模型組小鼠耳部皮膚涂抹0.1%DNCB的丙酮溶液100 μL，1次/周。
1.2.4 給藥及標本收集
小鼠給藥劑量換算方法說明：給藥劑量換算方法參考《中藥藥理研究方法學》第2版人小鼠劑量轉換公式[8]：d小鼠=d人×k小鼠/k人，其中d小鼠是小鼠的每千克體質量劑量，d人是已知人的每千克體質量劑量，k小鼠是小鼠的折算系數，k人是人的折算系數；k小鼠=l，k人=0.11，成人平均體質量按60 kg計算，小鼠平均體質量按20 g計算，d人=成人每日用量/60。
小鼠分組完成后，空白對照組和空白模型組采用生理鹽水灌胃，2次/d，劑量為10 mL/kg；中藥模型組給予小兒健脾化濕方水煎液灌胃，2次/d，劑量為10 mL/kg。等小鼠鼠齡達到11周齡時，取小鼠背部皮膚組織，用甲醛固定。
1.2.5 免疫組織化學染色法觀察3組小鼠AQP3表達
所有標本均經過甲醛溶液固定，石蠟包埋，5 μm厚度連續切片，常規脫蠟至水；3%過氧化氫室溫孵育6 min；磷酸鹽緩沖液（PBS）洗2 min×3次；滴加抗體兔抗AQP3[Rabbit Anti-AQP3（H-80）：ZS-20812]，工作濃度l︰100，置于4℃冰箱過夜；滴加生物素標記山羊抗兔 IgG（Pv-9001），室溫20 min；PBS沖洗2 min×3次；滴加辣根酶標記鏈霉卵白素工作液，室溫30 min；PBS沖洗2 min×3次；滴加DBA顯色，鏡下觀察，適時終止反應，自來水沖洗；蘇木精輕度復染3 min；常規脫水、透明，中性樹膠封片。
1.2.6 結果判定
采用BI2000醫學圖像分析系統進行圖像分析，選取200倍圖像，AQP3陽性表達細胞呈棕黃色，隨機選取每張切片的3～5個高倍視野來測定平均吸光度[A，舊稱光密度（OD）]值，平均A值代表陽性表達強度，陽性表達越強，平均A值就越大。判定標準以細胞染成棕黃色為陽性結果[4]。
1.3 統計學方法
采用SPSS 13.0軟件進行統計學處理。計量資料以均數±標準差表示，組間比較采用Dunnett-t檢驗。檢驗水準α=0.01。
2 結果
2.1 各組小鼠皮膚組織AQP3平均A值比較
空白模型組小鼠皮膚組織中AQP3平均A值（0.611±0.063）高于空白對照組AQP3平均A值（0.261±0.040），差異有統計學意義（P＜0.01）；中藥模型組小鼠皮膚組織AQP3平均A值（0.450±0.061）較空白模型組降低，差異有統計學意義（P＜0.01）。
2.2 各組小鼠皮膚組織AQP3表達分布比較
空白對照組小鼠皮膚AQP3主要分布在表皮基底層中，染色強度較弱，角質層及真皮層無表達；而空白模型組皮損中AQP3基本分布于基底層到棘層的全部區域，皮膚的附屬器中，如毛囊中、皮脂腺中也有表達。中藥模型組皮損中AQP3主要表達于基底層，棘層有少量表達。見圖 1。
圖1
小鼠皮膚免疫組織化學病理切片（PV二步法檢測×200）
a.空白對照組AQP3主要分布于表皮基底層中，染色強度較弱 b. 空白模型組AQP3基本分布于基底層到棘層的全部區域，皮膚的附屬器如毛囊中、皮脂腺中也有表達 c.中藥模型組AQP3主要表達于基底層，棘層有很少部分表達
3 討論
AD是一種慢性、瘙癢性、反復發作的炎癥性皮膚病，其發病率呈逐年上升趨勢。AD發病機制復雜，可能與遺傳、環境、免疫異常、超敏反應及精神因素等有關。目前尚無根治的好辦法。動物模型為研究人類AD較為常用的研究對象，家兔、大鼠、小鼠、豚鼠等最為常用。其中昆明小鼠以價格低廉、與人類 AD相似、模型易建立等優勢而備受青睞[9]。
AQP3在正常皮膚僅表達于基底層細胞。但在病理或某些生理情況下，AQP3的表達會有所變化。研究發現，通過調節AQP3的表達及分布，能夠改變干燥性皮膚的含水量，減少水分丟失[10]。AQP3相關研究主要是以小鼠和人表皮為研究對象。有研究分別取小鼠腹部、背部、下唇、眼瞼、耳和爪處的皮膚，利用間接免疫熒光技術檢測小鼠上皮，發現AQP3主要位于基底層，同時皮膚的附屬器如毛囊的外毛根鞘、皮脂腺等也存在[11]。AQP3在基底層的表達明顯多于棘層，而在顆粒層、角質層幾乎無表達[12-13]。在AD發作期間，AQP3 mRNA表達增多，除了基底層，棘細胞層也有少許表達。這與AD患者經皮失水增加，皮膚干燥加重有密切關系[14]。有學者推測AQP3的高表達導致表皮水梯度破壞使其屏障保護功能削弱，導致經皮水丟失增加從而引起皮膚干燥[14]。
本研究可見，空白對照組小鼠皮膚AQP3主要分布于表皮基底層中，染色強度較弱，角質層及真皮層無表達；而空白模型組皮損中AQP3基本分布于基底層到棘層的全部區域，毛囊及皮脂腺等皮膚附屬器中也有少量分布；AD模型組小鼠皮膚組織中AQP3表達增多，提示皮膚屏障功能破壞、水分丟失增多可導致AD小鼠皮膚AQP3表達的增多和分布改變。中藥模型組皮膚組織中AQP3主要表達于基底層，很少部分分布于棘層。AQP3的平均A值結果顯示，AD小鼠皮膚AQP3平均A值較空白對照組升高，差異有統計學意義（P＜0.05）；中藥模型組小鼠皮膚組織AQP3平均A值較空白模型組降低，其差異有統計學意義（P＜0.05）。可見健脾化濕法有利于受損皮膚組織的恢復。
在小兒健脾化濕方中白術、蒼術、茯苓、陳皮等有理氣健脾、燥濕利水的功效，白鮮皮、地膚子則可清熱利濕、脾氣健運，濕邪得以祛除，津液得以正常敷布，留滯體內水津有所出路，故而皮損得以修復。本研究結果顯示健脾化濕方能調節皮膚AQP3的含量和分布，為健脾化濕法治療AD的機制提供了理論支持。
綜上所述，皮膚屏障破壞可以導致AD小鼠皮膚AQP3的表達增多，分布也有所改變，因此皮膚組織中AQP3的增多和分布改變可以提示皮膚屏障功能破壞、水分丟失增加。健脾化濕法可以調節皮膚AQP3的含量和分布，恢復受損的皮膚屏障，有利于受損皮膚組使織的修復。
