引用本文： 蔡盈盈, 汪漢, 鄧玨琳. 質粒短發夾RNA對小鼠腎內髓集合管細胞Klotho基因的影響. 華西醫學, 2016, 31(7): 1205-1208. doi: 10.7507/1002-0179.201600329 復制
Klotho基因是Kuro-o等[1]在1997年研究自發型高血壓時發現的抑制衰老的基因。在腎臟，Klotho基因主要是在腎小管上皮細胞及腎髓質集合小管上皮細胞（IMCD3）表達[2]。研究認為Klotho基因作用于腎小管上皮細胞主要是通過成纖維細胞生長因子途徑及與鈣代謝及調控有關的瞬時感受器電位通道起作用[3]。質粒表達型短發夾RNA（shRNA）是目前進行RNA干擾研究的較好方法[4]。目前，運用RNA干擾技術抑制Klotho基因的研究并不多見[5]。本部分研究通過質粒shRNA干擾小鼠腎臟IMCD3細胞，為進一步研究Klotho基因在腎臟衰老及相關疾病中的作用機制奠定基礎；另外可選擇并驗證合適的shRNA為體內干擾實驗準備。現報告如下。
1 資料與方法
1.1 材料與儀器
1.1.1 細胞株
小鼠IMCD3細胞株購自中國生物細胞庫上海細胞分庫。
1.1.2 主要試劑
Lipofectamine 2000（美國Invitrogene公司），shRNA-Klotho（由江蘇南通百奧邁科生物有限公司合成），pRNAT-U6.1/Neo載體（美國GenScript公司），克隆菌株E.Coli Top 10（美國GenScript公司），BamHⅠ，HindⅢ，T4 DNA連接酶（紐英倫生物技術有限公司），Taq DNA聚合酶（美國Sigma公司），三磷酸堿基脫氧核苷酸（美國Sigma公司），質粒抽提試劑盒（江蘇南通百奧邁科生物有限公司合成），瓊脂糖電泳DNA回收盒（百奧邁科生物有限公司），DMEM高糖培養基干粉（美國Sigma公司），胎牛血清（鄭州伯安生物工程有限公司），青霉素及鏈霉素干粉（華北制藥廠生產），胰蛋白酶（美國Sigma公司），Taq DNA聚合酶（北京博大泰克生物有限公司生產），氯仿，異丙醇，聚合酶鏈反應（PCR）引物（由上海生工生物工程有限公司合成），聚偏氟乙烯膜（Millipore公司生產），多克隆兔抗鼠Klotho蛋白抗體（美國Acam公司），辣根過氧化物標記羊抗兔IgG抗體（上海史瑞可有限公司）。
1.1.3 主要儀器
細胞培養箱（日本Sanyo公司），細胞培養瓶（美國Costar公司），細胞培養板（美國Coring公司），微量臺式離心機（美國Beckman公司），恒溫水浴箱（DK-420型，上海精密科學儀器有限公司），電熱恒溫鼓風干燥箱（上海精宏實驗設備有限公司），生物組織包埋機（BMJ-Ⅲ型，常州中威電子儀器有限公司），實時熒光定量基因擴增儀（FTC2000型，加拿大Funglyn公司），微型電泳槽（H6-1型，上海精益有機玻璃制品儀器廠），PCR擴增儀（PE9600DNA型，美國PE公司），水平電泳儀（美國BIO-RAD公司），凝膠成像系統（Gel Doc 1000型，美國BIO-RAD公司），圖像采集系統（日本Olympus公司）。
1.2 實驗方法與步驟
1.2.1 IMCD3細胞的培養
① 復蘇細胞；② 細胞傳代。培養條件：DMEM高糖培養基，10%胎牛血清，100 U/mL青鏈霉素，37℃，5%二氧化碳孵育，觀察60 mm培養板細胞占80%左右即可。
1.2.2 shRNA-Klotho質粒的構建及鑒定
① 設計shRNA序列（圖 1）；② 引物合成；③ 稀釋Oligos，退火；④ 載體pRNAi-U6.1/Neo進行酶切；⑤ 連接；⑥ 質粒轉化；⑦ 陽性克隆鑒定，抽提及測序。
圖1
設計的Klotho基因的shRNA序列
1.2.3 IMCD3細胞分組
將小鼠的IMCD3細胞分為5組，shRNA轉染1、2、3組對應圖 1中MK0907SL18-1、-2和-3組，陰性對照組對應圖 1中NC組，即不起作用的序列組，未處理組即IMCD3細胞未予任何處理組。
1.2.4 shRNA-Klotho表達載體的轉染
① 無抗生素培養液培養轉染前的IMCD3細胞1 d，細胞換液；② 細胞計數；③ 將Klotho-shRNA質粒500 ng稀釋于50 μL不含血清的DMEM中并混勻；④ 將1 μL Lipofectamine2000稀釋于50 μL不含血清的DMEM中，混勻；⑤ 將稀釋的shRNA質粒與Lipofectamine2000混合，混勻，室溫孵育20 min使DNA-脂質體復合物形成；⑥ 復合物加入24 孔板；⑦ 轉染完成后，在熒光倒置顯微鏡下判斷轉染效率。
1.2.5 小鼠IMCD3細胞Klotho
mRNA表達的逆轉錄PCR（RT-PCR）的檢測 ① 分別對轉染1、2、3組和陰性對照組進行轉染；② 總RNA提取；③ 逆轉錄合成互補DNA；④ RT-PCR的檢測。mRNA的表達水平用基因的相對表達量表示。
1.2.6 小鼠IMCD3細胞Klotho基因蛋白水平表達的蛋白質印跡法檢測
① 樣品制備及蛋白含量檢測；② 蛋白質印跡法檢測。蛋白表達水平用凝膠圖象處理系統分析目標帶的相對分子質量和凈吸光度值。
1.3 統計學方法
Klotho基因的Ct值換算為基因的相對表達量2-ΔΔCt。在該公式中，ΔΔCt=（Ct目的基因-Ct管家基因）實驗組-（Ct目的基因-Ct管家基因）對照組。所有數據錄入Excel軟件，應用SPSS 13.0軟件進行數據統計，實驗數據以均數±標準差表示，柱狀圖以Excel 2003軟件繪制，多組之間用單因素方差分析統計，兩兩之間的比較采用LSD法。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 RT-PCR檢測IMCD3細胞的Klotho基因mRNA水平的表達
與未處理組及陰性對照組相比較，shRNA轉染2組Klotho mRNA水平較低，差異均有統計學意義（P＜0.01），而shRNA轉染1組及3組下降不明顯。見表 1。
表1
IMCD3細胞干擾后Klotho基因mRNA的表達和蛋白水平 （2.2 蛋白質印跡法檢測IMCD3細胞的Klotho基因蛋白水平的表達
5組之間Klotho蛋白相對表達量差異有統計學意義（F=15.85，P＜0.001）。與未處理組、陰性對照組、shRNA轉染1組及shRNA轉染3組相比，shRNA轉染2組Klotho蛋白相對表達量差異均有統計學意義（P＜0.001）。見表 1、圖 2。
圖2
IMCD3細胞轉染后Klotho基因蛋白水平從左至右為未處理組、陰性對照組、shRNA轉染1組、shRNA轉染2組和shRNA轉染3組
3 討論
RNA干擾是指通過正反義RNA片段形成雙鏈RNA（dsRNA），由dsRNA特異性地誘導其同源靶基因mRNA降解，從而抑制同源靶基因表達的現象。不同序列shRNA誘導RNA干擾的效果并不一致，相關shRNA的設計原則要求如下：從目標基因開放閱讀框起始密碼下游75～100個堿基位置開始，尋找AA二聯序列后的19～23個堿基序列為目的序列，分析并選擇GC比例在40%～55%之間的靶基因序列為目的的序列為優選；設計shRNA時不要針對5’及3’端的非編碼區；將潛在的序列和相應的數據庫進行比較，排除和其他編碼序列同源的序列。
RNA干擾技術是一種發生于mRNA水平的轉錄后基因沉默技術，所以RT-PCR可靈敏快捷地反映shRNA介導的同源mRNA的降解，而蛋白質印跡法可用來檢測蛋白水平。RNA抑制一般在轉染后24 h內發生，其引發基因沉默的程度和持續時間依賴于靶蛋白質的降解率、shRNA在細胞內的壽命以及其逐漸被稀釋的程度。
我們按照以上原則設計了針對Klotho基因的3條shRNA序列，利用基因重組技術構建了RNA干擾質粒。通過雙酶切及測序鑒定，同時設計了陰性的對照組。利用這種方法設計的干擾效果，更易導入細胞體內，存在時間長且穩定，對靶基因抑制效率高，便于長時間的研究干擾效果。
IMCD3細胞與腎小管上皮細胞的形態及生物學性狀極為相似，Klotho基因在鼠腎小管上皮細胞及IMCD3細胞的表達較高[6]，因此，本研究選用了IMCD3細胞。該細胞在1989年由Clapp等[7]首先成功分離培養，1993年Rauchman等[8]成功建立了IMCD3細胞株，可用于許多IMCD3細胞培養模型的研究。但是在國內，腎臟IMCD3細胞的培養僅見少量散在文獻報道[9-10]。
Klotho基因與腎臟關系密切。研究發現Klotho基因在野生型小鼠腎臟的高表達，尤其在腎皮質小管強烈表達，而Klotho基因缺陷小鼠卻無表達[11]；同時在慢性腎功能衰竭的患者中發現腎臟Klotho基因mRNA及蛋白表達明顯降低[12]。相關的機制可能如下[13-17]：① Klotho蛋白或者其代謝產物能促進動脈內皮細胞一氧化氮的產生，持續循環應激狀態下，腎臟Klotho mRNA表達下調；② Klotho蛋白表達減少引起的鈣激活蛋白酶異常過度激活，導致了諸如血管緊張素Ⅱ這類細胞骨架成分的退化，從而可能觸發腎臟細胞結構和功能異常，而Klotho蛋白對這一過程可能具有抑制作用；③ Klotho基因表達下調可能通過上調血漿纖維蛋白溶解酶原激活物抑制劑-1 mRNA的表達參與了腎臟老化的發生；④ 腎臟Klotho基因表達下調可能加重血管緊張素介導的腎臟損害，轉入Klotho基因可能對血管緊張素介導的終末器官損害有一定的治療作用。
Klotho基因的RNA干擾研究，目前全世界并不多見，基于Klotho基因缺陷小鼠昂貴，又很難得到，我們選用了腎臟組織的IMCD3細胞，運用質粒介導的方式干擾IMCD3細胞Klotho基因的表達，目的在于：選取合適的shRNA序列，并為進一步研究腎臟衰老做準備。
本研究提示：① shRNA轉染IMCD3細胞的Klotho基因mRNA和蛋白水平下降的幅度基本一致，說明shRNA對二者的影響可能一致；② Klotho基因在IMCD3細胞表達；③ 篩選出合適的shRNA序列。以上結果為進一步研究Klotho基因與腎臟衰老及相關疾病的作用機制奠定基礎，另外可用于選擇合適的shRNA為體內干擾實驗做準備。
Klotho基因是Kuro-o等[1]在1997年研究自發型高血壓時發現的抑制衰老的基因。在腎臟，Klotho基因主要是在腎小管上皮細胞及腎髓質集合小管上皮細胞（IMCD3）表達[2]。研究認為Klotho基因作用于腎小管上皮細胞主要是通過成纖維細胞生長因子途徑及與鈣代謝及調控有關的瞬時感受器電位通道起作用[3]。質粒表達型短發夾RNA（shRNA）是目前進行RNA干擾研究的較好方法[4]。目前，運用RNA干擾技術抑制Klotho基因的研究并不多見[5]。本部分研究通過質粒shRNA干擾小鼠腎臟IMCD3細胞，為進一步研究Klotho基因在腎臟衰老及相關疾病中的作用機制奠定基礎；另外可選擇并驗證合適的shRNA為體內干擾實驗準備。現報告如下。
1 資料與方法
1.1 材料與儀器
1.1.1 細胞株
小鼠IMCD3細胞株購自中國生物細胞庫上海細胞分庫。
1.1.2 主要試劑
Lipofectamine 2000（美國Invitrogene公司），shRNA-Klotho（由江蘇南通百奧邁科生物有限公司合成），pRNAT-U6.1/Neo載體（美國GenScript公司），克隆菌株E.Coli Top 10（美國GenScript公司），BamHⅠ，HindⅢ，T4 DNA連接酶（紐英倫生物技術有限公司），Taq DNA聚合酶（美國Sigma公司），三磷酸堿基脫氧核苷酸（美國Sigma公司），質粒抽提試劑盒（江蘇南通百奧邁科生物有限公司合成），瓊脂糖電泳DNA回收盒（百奧邁科生物有限公司），DMEM高糖培養基干粉（美國Sigma公司），胎牛血清（鄭州伯安生物工程有限公司），青霉素及鏈霉素干粉（華北制藥廠生產），胰蛋白酶（美國Sigma公司），Taq DNA聚合酶（北京博大泰克生物有限公司生產），氯仿，異丙醇，聚合酶鏈反應（PCR）引物（由上海生工生物工程有限公司合成），聚偏氟乙烯膜（Millipore公司生產），多克隆兔抗鼠Klotho蛋白抗體（美國Acam公司），辣根過氧化物標記羊抗兔IgG抗體（上海史瑞可有限公司）。
1.1.3 主要儀器
細胞培養箱（日本Sanyo公司），細胞培養瓶（美國Costar公司），細胞培養板（美國Coring公司），微量臺式離心機（美國Beckman公司），恒溫水浴箱（DK-420型，上海精密科學儀器有限公司），電熱恒溫鼓風干燥箱（上海精宏實驗設備有限公司），生物組織包埋機（BMJ-Ⅲ型，常州中威電子儀器有限公司），實時熒光定量基因擴增儀（FTC2000型，加拿大Funglyn公司），微型電泳槽（H6-1型，上海精益有機玻璃制品儀器廠），PCR擴增儀（PE9600DNA型，美國PE公司），水平電泳儀（美國BIO-RAD公司），凝膠成像系統（Gel Doc 1000型，美國BIO-RAD公司），圖像采集系統（日本Olympus公司）。
1.2 實驗方法與步驟
1.2.1 IMCD3細胞的培養
① 復蘇細胞；② 細胞傳代。培養條件：DMEM高糖培養基，10%胎牛血清，100 U/mL青鏈霉素，37℃，5%二氧化碳孵育，觀察60 mm培養板細胞占80%左右即可。
1.2.2 shRNA-Klotho質粒的構建及鑒定
① 設計shRNA序列（圖 1）；② 引物合成；③ 稀釋Oligos，退火；④ 載體pRNAi-U6.1/Neo進行酶切；⑤ 連接；⑥ 質粒轉化；⑦ 陽性克隆鑒定，抽提及測序。
圖1
設計的Klotho基因的shRNA序列
1.2.3 IMCD3細胞分組
將小鼠的IMCD3細胞分為5組，shRNA轉染1、2、3組對應圖 1中MK0907SL18-1、-2和-3組，陰性對照組對應圖 1中NC組，即不起作用的序列組，未處理組即IMCD3細胞未予任何處理組。
1.2.4 shRNA-Klotho表達載體的轉染
① 無抗生素培養液培養轉染前的IMCD3細胞1 d，細胞換液；② 細胞計數；③ 將Klotho-shRNA質粒500 ng稀釋于50 μL不含血清的DMEM中并混勻；④ 將1 μL Lipofectamine2000稀釋于50 μL不含血清的DMEM中，混勻；⑤ 將稀釋的shRNA質粒與Lipofectamine2000混合，混勻，室溫孵育20 min使DNA-脂質體復合物形成；⑥ 復合物加入24 孔板；⑦ 轉染完成后，在熒光倒置顯微鏡下判斷轉染效率。
1.2.5 小鼠IMCD3細胞Klotho
mRNA表達的逆轉錄PCR（RT-PCR）的檢測 ① 分別對轉染1、2、3組和陰性對照組進行轉染；② 總RNA提取；③ 逆轉錄合成互補DNA；④ RT-PCR的檢測。mRNA的表達水平用基因的相對表達量表示。
1.2.6 小鼠IMCD3細胞Klotho基因蛋白水平表達的蛋白質印跡法檢測
① 樣品制備及蛋白含量檢測；② 蛋白質印跡法檢測。蛋白表達水平用凝膠圖象處理系統分析目標帶的相對分子質量和凈吸光度值。
1.3 統計學方法
Klotho基因的Ct值換算為基因的相對表達量2-ΔΔCt。在該公式中，ΔΔCt=（Ct目的基因-Ct管家基因）實驗組-（Ct目的基因-Ct管家基因）對照組。所有數據錄入Excel軟件，應用SPSS 13.0軟件進行數據統計，實驗數據以均數±標準差表示，柱狀圖以Excel 2003軟件繪制，多組之間用單因素方差分析統計，兩兩之間的比較采用LSD法。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 RT-PCR檢測IMCD3細胞的Klotho基因mRNA水平的表達
與未處理組及陰性對照組相比較，shRNA轉染2組Klotho mRNA水平較低，差異均有統計學意義（P＜0.01），而shRNA轉染1組及3組下降不明顯。見表 1。
表1
IMCD3細胞干擾后Klotho基因mRNA的表達和蛋白水平 （2.2 蛋白質印跡法檢測IMCD3細胞的Klotho基因蛋白水平的表達
5組之間Klotho蛋白相對表達量差異有統計學意義（F=15.85，P＜0.001）。與未處理組、陰性對照組、shRNA轉染1組及shRNA轉染3組相比，shRNA轉染2組Klotho蛋白相對表達量差異均有統計學意義（P＜0.001）。見表 1、圖 2。
圖2
IMCD3細胞轉染后Klotho基因蛋白水平從左至右為未處理組、陰性對照組、shRNA轉染1組、shRNA轉染2組和shRNA轉染3組
3 討論
RNA干擾是指通過正反義RNA片段形成雙鏈RNA（dsRNA），由dsRNA特異性地誘導其同源靶基因mRNA降解，從而抑制同源靶基因表達的現象。不同序列shRNA誘導RNA干擾的效果并不一致，相關shRNA的設計原則要求如下：從目標基因開放閱讀框起始密碼下游75～100個堿基位置開始，尋找AA二聯序列后的19～23個堿基序列為目的序列，分析并選擇GC比例在40%～55%之間的靶基因序列為目的的序列為優選；設計shRNA時不要針對5’及3’端的非編碼區；將潛在的序列和相應的數據庫進行比較，排除和其他編碼序列同源的序列。
RNA干擾技術是一種發生于mRNA水平的轉錄后基因沉默技術，所以RT-PCR可靈敏快捷地反映shRNA介導的同源mRNA的降解，而蛋白質印跡法可用來檢測蛋白水平。RNA抑制一般在轉染后24 h內發生，其引發基因沉默的程度和持續時間依賴于靶蛋白質的降解率、shRNA在細胞內的壽命以及其逐漸被稀釋的程度。
我們按照以上原則設計了針對Klotho基因的3條shRNA序列，利用基因重組技術構建了RNA干擾質粒。通過雙酶切及測序鑒定，同時設計了陰性的對照組。利用這種方法設計的干擾效果，更易導入細胞體內，存在時間長且穩定，對靶基因抑制效率高，便于長時間的研究干擾效果。
IMCD3細胞與腎小管上皮細胞的形態及生物學性狀極為相似，Klotho基因在鼠腎小管上皮細胞及IMCD3細胞的表達較高[6]，因此，本研究選用了IMCD3細胞。該細胞在1989年由Clapp等[7]首先成功分離培養，1993年Rauchman等[8]成功建立了IMCD3細胞株，可用于許多IMCD3細胞培養模型的研究。但是在國內，腎臟IMCD3細胞的培養僅見少量散在文獻報道[9-10]。
Klotho基因與腎臟關系密切。研究發現Klotho基因在野生型小鼠腎臟的高表達，尤其在腎皮質小管強烈表達，而Klotho基因缺陷小鼠卻無表達[11]；同時在慢性腎功能衰竭的患者中發現腎臟Klotho基因mRNA及蛋白表達明顯降低[12]。相關的機制可能如下[13-17]：① Klotho蛋白或者其代謝產物能促進動脈內皮細胞一氧化氮的產生，持續循環應激狀態下，腎臟Klotho mRNA表達下調；② Klotho蛋白表達減少引起的鈣激活蛋白酶異常過度激活，導致了諸如血管緊張素Ⅱ這類細胞骨架成分的退化，從而可能觸發腎臟細胞結構和功能異常，而Klotho蛋白對這一過程可能具有抑制作用；③ Klotho基因表達下調可能通過上調血漿纖維蛋白溶解酶原激活物抑制劑-1 mRNA的表達參與了腎臟老化的發生；④ 腎臟Klotho基因表達下調可能加重血管緊張素介導的腎臟損害，轉入Klotho基因可能對血管緊張素介導的終末器官損害有一定的治療作用。
Klotho基因的RNA干擾研究，目前全世界并不多見，基于Klotho基因缺陷小鼠昂貴，又很難得到，我們選用了腎臟組織的IMCD3細胞，運用質粒介導的方式干擾IMCD3細胞Klotho基因的表達，目的在于：選取合適的shRNA序列，并為進一步研究腎臟衰老做準備。
本研究提示：① shRNA轉染IMCD3細胞的Klotho基因mRNA和蛋白水平下降的幅度基本一致，說明shRNA對二者的影響可能一致；② Klotho基因在IMCD3細胞表達；③ 篩選出合適的shRNA序列。以上結果為進一步研究Klotho基因與腎臟衰老及相關疾病的作用機制奠定基礎，另外可用于選擇合適的shRNA為體內干擾實驗做準備。
