引用本文： 董艷, 陸金根. 香連丸對潰瘍性結腸炎大鼠細胞凋亡及Bcl-2、Bax mRNA表達的影響. 華西醫學, 2016, 31(6): 1046-1051. doi: 10.7507/1002-0179.201600281 復制
潰瘍性結腸炎（UC）臨床以腹瀉、腹痛、大便帶血或黏液膿血便為主要表現。雖然其病因尚未十分明確，但有研究表明異常的細胞凋亡參與了潰瘍形成的病理過程。細胞凋亡在生物體的進化、內環境的穩定等方面起著重要作用。細胞凋亡的調節機制非常復雜，其中Bcl-2家族的作用突出。Bcl-2家族涉有眾多成員，包括Bax等。Bcl-2成員間的二聚體化是其功能調節的主要方式，Bcl-2的生理功能是阻止細胞凋亡，延長細胞壽命，Bcl-2/Bax系統失衡，可能參與UC的發病過程。本研究通過對細胞凋亡因子Bcl-2、Bax的研究，探討香連丸對UC大鼠結腸組織細胞凋亡的影響。現報告如下。
1 材料與方法
1.1 實驗動物
7周齡清潔級Wistar雄性大鼠50只，體質量（200±20）g，由上海中醫藥大學動物實驗中心提供。適應性喂養標準飼料7 d后開始進行實驗。
1.2 實驗藥物
5% 2，4，6-三硝基苯磺酸溶液（TNBS）（美國Sigma公司）；無水乙醇（國藥集團化學試劑有限公司，批號20130407）；香連丸（國藥準字Z42020398，湖北諾得勝制藥有限公司，主要成分：萸黃連，木香）；AG490（Tyrphostin B42）（美國Selleck公司）；Trizol（美國Invitrogen公司）；逆轉錄（RT）試劑盒，Sybr green（TAKARA公司），氯仿，異丙醇（國藥集團化學試劑有限公司）；原位末端凋亡（TUNEL）檢測試劑盒（德國寶靈曼公司）。
1.3 主要儀器
實時熒光定量聚合酶鏈反應（PCR）儀（美國ABI公司），高速冷凍離心機（德國EPPENDORF公司），低溫冰箱（日本SANYO公司），高壓蒸氣消毒器（上海醫用核子儀器廠），紫外分光光度計（上海第三分析儀器廠），光學顯微鏡（奧林巴斯CKX41），切片機RM2145（德國Lico公司）。
1.4 方法
1.4.1 造模方法
采用Morris等[1]用5% TNBS/乙醇復制UC模型。除正常組外其余各組造模大鼠造模前1 d均禁食不禁水24 h，按100 mg/kg計算TNBS（約等于TNBS原液0.18 mL/100 g）加50%乙醇0.25 mL，用聚丙烯管插入肛門上段8 cm后一次性注入混合試劑。
1.4.2 分組及給藥
應用隨機數字表進行完全隨機化分組，分為5組，每組10只，即正常組、模型組（UC模型）、中藥組、抑制劑組、中藥+抑制劑組。于造模開始第1天，各組分別以下列方法處理：① 正常組：蒸餾水灌胃；② 模型組：蒸餾水灌胃；③ 中藥組（香連丸）：香連丸研磨成粉，蒸餾水制成混懸液，按 1.6 g/kg生藥量灌胃；④ 抑制劑組：按說明指導劑量配制（AG490、二甲基亞砜、雙蒸水按1︰1︰3）2 mg/kg 劑量腹腔注射，蒸餾水灌胃；⑤ 中藥+抑制劑組：AG4902 mg/kg腹腔注射，1.6 g/kg中藥灌胃。連續灌胃給藥10 d。
1.4.3 標本采集
于末次給藥結束后，禁食12 h。麻醉大鼠，自肛門上2～8 cm處，截取結腸組織，肉眼觀察黏膜組織，并按照結腸組織損傷評分標準記錄：① 粘連：無粘連，計0分；輕度粘連（結腸與周圍組織可較易剝離），計1分；重度粘連（較難分離粘連組織），計2分。② 潰瘍形成及炎癥評分：無充血、無潰瘍，計0分；局部充血、無潰瘍，計1分；1處潰瘍不伴充血或腸壁增厚，計2分；1處潰瘍伴炎癥，計 3分；≥2處潰瘍伴炎癥，計4分；＞2處潰瘍和（或）炎癥＞1 cm，計5分；潰瘍和（或）炎癥＞2 cm，病變范圍每增加1 cm，計分加1分。
取結腸組織，部分以4%多聚甲醛固定，進行常規石蠟切片，蘇木精-伊紅（HE）染色，光學顯微鏡觀察，并根據鏡下評分標準病理評分。潰瘍面：無潰瘍，計 0分；潰瘍＜3 cm2，計1分；潰瘍＞3 cm2，計2分。炎癥：無，計0分；輕度，計1分；重度，計2分。肉芽腫：無，計0分；有，計1分。病變深度：無，計0分；黏膜下層，計1分；肌層，計2分；漿膜層，計3分。纖維化：無，計0分；輕度，計1分；重度，計2分。部分結腸組織液氮保存備用熒光定量PCR檢測。
1.4.4 TUNEL法檢測細胞凋亡
組織用4%甲醛溶液4℃過夜固定，浸蠟、包埋、切片，厚度4 μm，檢測前切片常規脫蠟入水。樣品片放入新鮮配制的3%過氧化氫溶液中，室溫10 min，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗樣品片：5 min/次，洗3次。用0.01 mol/L PBS （7.4）稀釋DAN蛋白酶K儲備液中20 μg/mL，50 μL/片 加至脫蠟入水后的樣品片上37℃濕盒中放置 20 min。雙蒸水洗樣品：5 min/次，洗3次；樣品片上加標記緩沖液，20 μL/片，室溫放置15 min。將TDT及Biotin-11-dUTP離心混勻后，分別取2 μL加入16 μL標記緩沖液中，混勻。甩掉樣品片上標記緩沖液，保證樣品片濕潤，然后加已混勻的混合液至樣品片上，20 μL/片，37℃濕盒中標記60 min。標記后的樣品片浸泡于2倍SSC中，室溫放置15 min。PBS洗樣品片：3 min/次，洗3次。樣品片加封閉液 50 μL/片，室溫放置30 min，然后甩掉封閉液。以封閉液按1︰50配制Avidin-HRP為工作液；50 μL片加于樣品片上，37℃反應60 min。PBS洗樣品片：3 min/次，洗3次。二氨基聯苯胺顯色液顯色，蘇木素復染，常規封片，顯微鏡檢查。每個樣品3個視野鏡下計數陽性細胞。
1.4.5 逆轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）
取結腸組織50 mg，按照Trizol試劑盒說明提取總RNA，分光光度計測定RNA濃度，互補DNA合成，PCR擴增。引物由上海英俊生物技術有限公司合成（表 1）。PCR反應條件為95℃ 30 s；95℃ 3 s，60℃ 30 s，40個循環。目的基因的相對表達量可以采用??CT法加以分析。通常以正常或陰性作為對照樣本。CT值—n：擴增循環，?CT=目的基因CT-內參CT（注：同一反轉錄產物擴增后），??CT=觀察樣本?CT-對照樣本?CT=（觀察樣本目的基因CT-觀察樣本內參CT）-（對照樣本目的基因CT-對照樣本內參CT）；樣本的相對表達量=2-??CT
表1
引物序列
1.5 統計學方法
采用統計軟件SPSS 19.0分析數據。計量資料數據以均數±標準差表示，均數的組間差異采用方差分析，組間兩兩比較采用LSD法。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 各組大鼠肉眼及光學顯微鏡下觀察結腸組織形態及黏膜損傷評分結果
潰瘍性大鼠病變結腸黏膜肉眼可見潰瘍多發，腸壁增厚，黏膜糜爛并充血；中藥組、抑制劑組及中藥+抑制組結腸黏膜充血程度減輕，輕度糜爛，潰瘍不明顯。與正常組比較，模型組大鼠組織學損傷程度嚴重，有統計學意義（P＜0.001）；與模型組比較，中藥及抑制劑干預各組結腸黏膜損傷程度減輕，有統計學意義（P＜0.05）。光學顯微鏡下，模型組大鼠結腸黏膜潰瘍可達肌層，潰瘍面較大，炎癥反應重度，伴充血、糜爛，輕度纖維化；中藥及抑制劑干預各組可見不同程度損傷改變，但程度較模型組輕。組織學評分結果表明，與正常組比較，模型組大鼠組織學損傷程度嚴重，有統計學意義（P＜0.05）；與模型組比較，給藥各組結腸黏膜損傷程度減輕，有統計學意義（P＜0.05）。見表 2。
表2
各組大鼠肉眼及光學顯微鏡下觀察黏膜組織損傷分值 （n=10，2.2 結腸組織病理學變化
光學顯微鏡下可見正常組結腸組織見腺體排列整齊，隱窩正常，杯狀細胞無減少，無黏膜糜爛、出血；模型組可見腺腔不規則擴張，腺管排列紊亂，黏膜及黏膜下層血管有高度擴張充血，甚至個別模型的結腸組織切片可見巨大潰瘍，潰瘍深達肌層，并有大量炎細胞浸潤，浸潤程度可及黏膜下或固有層，部分浸潤全層，以中性粒細胞、淋巴細胞為主；抑制劑組可見黏膜消失或部分消失，腺體排列紊亂，炎性細胞浸潤，但較模型組有所減輕；中藥組及中藥+抑制劑組的組織損傷最輕，多表現為接近正常組。見圖 1。
圖1
各組結腸組織光學顯微鏡下病理學變化（HE ×100） 1a. 正常組結腸組織見腺體排列整齊，隱窩正常，杯狀細胞正常，無黏膜糜爛、出血 1b. 模型組結腸組織見腺腔不規則擴張，腺管排列紊亂，黏膜及黏膜下層血管有高度擴張充血，有大量炎細胞浸潤，以中性粒細胞、淋巴細胞為主 1c. 模型組可見巨大潰瘍，潰瘍深達肌層 1d. 中藥組結腸組織損傷較小，腺管排列基本整齊，隱窩正常，杯狀細胞無減少，未見黏膜糜爛 1e.抑制劑組可見黏膜消失或部分消失，腺體排列紊亂，炎性細胞浸潤，但較模型組有所減輕 1f. 中藥+抑制劑組組織損傷最輕，表現接近正常組? ?圖 2TUNEL法檢測細胞凋亡（400倍鏡下，電壓2.79 V，電流2.51 A，陽性細胞核棕褐色染色） 2a. 正常組：凋亡細胞數目較少（褐色染色細胞少） 2b. 模型組：凋亡細胞數目明顯增多（褐色染色細胞核較多） 2c. 中藥組：凋亡細胞數目較模型組少（褐色細胞核減少） 2d. 抑制劑組：凋亡細胞數目較模型組少 2e. 中藥+抑制劑組：凋亡細胞數目減少（褐色細胞核減少）
2.3 香連丸對大鼠結腸組織細胞凋亡的影響
光學顯微鏡下可見陽性細胞核棕褐色染色（圖 2）。各組凋亡指數分別為正常組（5.53±2.49）%，模型組（21.20±5.37）%，中藥組（7.93±2.87）%，抑制劑組（10.60±4.97）%，中藥+抑制劑組（8.66±3.24）%，模型組凋亡指數明顯高于其他各組，差異有統計學意義（P＜0.001）；經藥物干預后的中藥組/抑制劑組細胞凋亡指數較模型組明顯減少，有統計學意義（P＜0.001）；而藥物干預后的各組與正常組相比無明顯差異（P＞0.05）。見圖 3。
圖3
TUNEL 法檢測各組細胞凋亡情況
2.4 香連丸對大鼠Bcl-2、Bax mRNA的表達影響
與正常組比較，模型組大鼠結腸組織Bcl-2 mRNA表達降低，差異有統計學意義（P＜0.05）；與模型組比較，中藥組、抑制劑組及中藥+抑制劑組結腸組織中Bcl-2 mRNA表達水平均升高，接近正常組，差異有統計學意義（P＜0.05）；與正常組比較，模型組大鼠結腸組織Bax的mRNA表達增加，差異有統計學意義（P＜0.05）；與模型組比較，中藥組、抑制劑組及中藥+抑制劑組結腸組織中Bax mRNA表達水平降低，接近正常組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表 3、圖 4。
圖4
各組大鼠結腸組織中Bcl-2、Bax mRNA表達
4a. Bcl-2 mRNA的表達 4b. Bax mRNA的表達
表3
各組大鼠結腸組織中Bcl-2、Bax 的mRNA 相對表達量（n=10，3 討論
正常結腸上皮存在凋亡現象，是腸上皮細胞更新的生理過程，為自發性凋亡；而UC炎癥時黏膜上皮細胞凋亡速率明顯增加。上皮細胞凋亡的增加可能導致上皮屏障的改變，從而增加腸損傷的發生[2]。細胞凋亡是在某些生理或病理因素誘導下，激活膜信號系統，啟動自身內部機制，主要通過內源性DNA內切酶的激活而發生的自然死亡現象[3]。凋亡對確保正常發育、生長以及維持內環境穩定有著重要的作用。細胞凋亡是由參與細胞凋亡的系列基因相對表達程度決定的，并受多種細胞因子的影響，細胞凋亡參與組織中炎癥細胞數量的調節。研究表明，UC患者淋巴細胞凋亡延遲[4]，淋巴細胞介導的細胞毒作用在UC發病機制中占重要地位。腸道免疫-炎癥調節功能異常，不能將免疫反應下調，使得腸道炎癥反應得以持續[5]。
細胞凋亡常通過Bcl-2家族中的Bcl-2和Bax來調節。Bcl-2是抑制細胞凋亡的一種癌基因[6]，編碼一個相對分子質量為26×103的蛋白，借助C端疏水區定位于線粒體外膜、內質網膜、核膜上，直接影響線粒體膜功能，其主要生物學功能是延長細胞壽命，增加細胞對多種調亡刺激因素的抗性，被認為是細胞凋亡調控的最后通路之一。Bax是凋亡基因家族的核心成員之一，由p53直接激活，提高凋亡的敏感性，促進p53介導的細胞凋亡。有研究認為Bcl-2可作為促細胞生存信號，而Bax是促進上皮細胞凋亡的組成部分，并且影響Bcl-2的凋亡作用，Bcl-2與Bax的比例決定了細胞的存活或死亡[2, 7]。有研究顯示Bax/Bcl-2比率增加，提高線粒體釋放細胞色素C，促進腸壁損傷的進行[8]。Bax/Bcl-2比率與上皮細胞凋亡呈正相關[9]。?亦有研究發現Bax蛋白和mRNA在活動性UC的結腸上皮表達減少，在正常黏膜和非活動性UC則增加[10-13]。
本研究的前期試驗中，發現白細胞介素-6/信號轉導及轉錄激活蛋白（STAT）3信號通路相關因子表達異常是UC發生的重要分子生物學基礎，STAT3活化抑制劑piceatannol可以使細胞凋亡調控蛋白Bcl-2表達減弱[14]，表明STAT3途徑可調節Bcl-2表達，STAT3的活化通過增強Bcl-2表達，顯示其抗凋亡效應。有研究顯示，UC患者腸黏膜中Bcl-2表達增加，且以上皮細胞、淋巴細胞和漿細胞為主，而炎性細胞中Bax表達減少，說明UC腸黏膜炎性細胞的凋亡減少與上皮細胞的凋亡增加同步進行，在UC的潰瘍形成中起一定作用[15]。亦有研究表明，UC患者腸黏膜組織中Bcl-2、Bax均下調，其中，Bax的凋亡主要是上皮細胞，Bcl-2的凋亡主要是淋巴細胞，并且兩者具有弱相關性[16]。故在本實驗中分組采用了STAT3通路中的抑制劑AG-490干預，觀察香連丸干預、抑制劑干預及中藥+抑制劑共同干預的細胞凋亡結果。本實驗研究發現在UC模型大鼠中結腸組織中Bcl-2 mRNA的表達降低，抗凋亡性減退，而Bax mRNA表達相對增加，細胞凋亡加速，腸道上皮細胞凋亡進程加快，促進腸壁損傷。
中藥古方香連丸出自《太平惠民和劑局方》，是臨床治療濕熱痢疾的主要方劑之一，具有清熱燥濕，行氣化滯之功效。目前，臨床多用于治療大腸濕熱所致的痢疾、腸炎、腸傷寒或者胃炎等屬濕熱為患者。現代藥理研究表明，香連丸具有抗潰瘍、解痙、抗病原微生物、止瀉等作用，在本實驗研究證實，香連丸可提高Bax mRNA、減少Bcl-2 mRNA的表達，改善結腸黏膜損傷，減少上皮細胞凋亡，改善細胞凋亡情況，其機制可能是通過調節凋亡因子Bcl-2、Bax mRNA表達的平衡，調節Bax/Bcl-2的比例，誘導結腸黏膜固有層淋巴細胞凋亡，達到緩解UC目的，這一發現可能為UC的中藥治療提供新的理論基礎。
綜上所述，本實驗運用TNBS經典造模方法建立UC模型大鼠，觀察UC模型大鼠的結腸病理情況，發現結腸黏膜損傷情況與細胞凋亡因子Bcl-2、Bax的變化有關；通過有效中成藥香連丸干預，發現可提高Bcl-2 mRNA、減少Bax mRNA的表達，其機制可能是通過調節Bcl-2、Bax mRNA表達的平衡，調節Bax/Bcl-2的比例，緩解上皮細胞凋亡。
潰瘍性結腸炎（UC）臨床以腹瀉、腹痛、大便帶血或黏液膿血便為主要表現。雖然其病因尚未十分明確，但有研究表明異常的細胞凋亡參與了潰瘍形成的病理過程。細胞凋亡在生物體的進化、內環境的穩定等方面起著重要作用。細胞凋亡的調節機制非常復雜，其中Bcl-2家族的作用突出。Bcl-2家族涉有眾多成員，包括Bax等。Bcl-2成員間的二聚體化是其功能調節的主要方式，Bcl-2的生理功能是阻止細胞凋亡，延長細胞壽命，Bcl-2/Bax系統失衡，可能參與UC的發病過程。本研究通過對細胞凋亡因子Bcl-2、Bax的研究，探討香連丸對UC大鼠結腸組織細胞凋亡的影響。現報告如下。
1 材料與方法
1.1 實驗動物
7周齡清潔級Wistar雄性大鼠50只，體質量（200±20）g，由上海中醫藥大學動物實驗中心提供。適應性喂養標準飼料7 d后開始進行實驗。
1.2 實驗藥物
5% 2，4，6-三硝基苯磺酸溶液（TNBS）（美國Sigma公司）；無水乙醇（國藥集團化學試劑有限公司，批號20130407）；香連丸（國藥準字Z42020398，湖北諾得勝制藥有限公司，主要成分：萸黃連，木香）；AG490（Tyrphostin B42）（美國Selleck公司）；Trizol（美國Invitrogen公司）；逆轉錄（RT）試劑盒，Sybr green（TAKARA公司），氯仿，異丙醇（國藥集團化學試劑有限公司）；原位末端凋亡（TUNEL）檢測試劑盒（德國寶靈曼公司）。
1.3 主要儀器
實時熒光定量聚合酶鏈反應（PCR）儀（美國ABI公司），高速冷凍離心機（德國EPPENDORF公司），低溫冰箱（日本SANYO公司），高壓蒸氣消毒器（上海醫用核子儀器廠），紫外分光光度計（上海第三分析儀器廠），光學顯微鏡（奧林巴斯CKX41），切片機RM2145（德國Lico公司）。
1.4 方法
1.4.1 造模方法
采用Morris等[1]用5% TNBS/乙醇復制UC模型。除正常組外其余各組造模大鼠造模前1 d均禁食不禁水24 h，按100 mg/kg計算TNBS（約等于TNBS原液0.18 mL/100 g）加50%乙醇0.25 mL，用聚丙烯管插入肛門上段8 cm后一次性注入混合試劑。
1.4.2 分組及給藥
應用隨機數字表進行完全隨機化分組，分為5組，每組10只，即正常組、模型組（UC模型）、中藥組、抑制劑組、中藥+抑制劑組。于造模開始第1天，各組分別以下列方法處理：① 正常組：蒸餾水灌胃；② 模型組：蒸餾水灌胃；③ 中藥組（香連丸）：香連丸研磨成粉，蒸餾水制成混懸液，按 1.6 g/kg生藥量灌胃；④ 抑制劑組：按說明指導劑量配制（AG490、二甲基亞砜、雙蒸水按1︰1︰3）2 mg/kg 劑量腹腔注射，蒸餾水灌胃；⑤ 中藥+抑制劑組：AG4902 mg/kg腹腔注射，1.6 g/kg中藥灌胃。連續灌胃給藥10 d。
1.4.3 標本采集
于末次給藥結束后，禁食12 h。麻醉大鼠，自肛門上2～8 cm處，截取結腸組織，肉眼觀察黏膜組織，并按照結腸組織損傷評分標準記錄：① 粘連：無粘連，計0分；輕度粘連（結腸與周圍組織可較易剝離），計1分；重度粘連（較難分離粘連組織），計2分。② 潰瘍形成及炎癥評分：無充血、無潰瘍，計0分；局部充血、無潰瘍，計1分；1處潰瘍不伴充血或腸壁增厚，計2分；1處潰瘍伴炎癥，計 3分；≥2處潰瘍伴炎癥，計4分；＞2處潰瘍和（或）炎癥＞1 cm，計5分；潰瘍和（或）炎癥＞2 cm，病變范圍每增加1 cm，計分加1分。
取結腸組織，部分以4%多聚甲醛固定，進行常規石蠟切片，蘇木精-伊紅（HE）染色，光學顯微鏡觀察，并根據鏡下評分標準病理評分。潰瘍面：無潰瘍，計 0分；潰瘍＜3 cm2，計1分；潰瘍＞3 cm2，計2分。炎癥：無，計0分；輕度，計1分；重度，計2分。肉芽腫：無，計0分；有，計1分。病變深度：無，計0分；黏膜下層，計1分；肌層，計2分；漿膜層，計3分。纖維化：無，計0分；輕度，計1分；重度，計2分。部分結腸組織液氮保存備用熒光定量PCR檢測。
1.4.4 TUNEL法檢測細胞凋亡
組織用4%甲醛溶液4℃過夜固定，浸蠟、包埋、切片，厚度4 μm，檢測前切片常規脫蠟入水。樣品片放入新鮮配制的3%過氧化氫溶液中，室溫10 min，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗樣品片：5 min/次，洗3次。用0.01 mol/L PBS （7.4）稀釋DAN蛋白酶K儲備液中20 μg/mL，50 μL/片 加至脫蠟入水后的樣品片上37℃濕盒中放置 20 min。雙蒸水洗樣品：5 min/次，洗3次；樣品片上加標記緩沖液，20 μL/片，室溫放置15 min。將TDT及Biotin-11-dUTP離心混勻后，分別取2 μL加入16 μL標記緩沖液中，混勻。甩掉樣品片上標記緩沖液，保證樣品片濕潤，然后加已混勻的混合液至樣品片上，20 μL/片，37℃濕盒中標記60 min。標記后的樣品片浸泡于2倍SSC中，室溫放置15 min。PBS洗樣品片：3 min/次，洗3次。樣品片加封閉液 50 μL/片，室溫放置30 min，然后甩掉封閉液。以封閉液按1︰50配制Avidin-HRP為工作液；50 μL片加于樣品片上，37℃反應60 min。PBS洗樣品片：3 min/次，洗3次。二氨基聯苯胺顯色液顯色，蘇木素復染，常規封片，顯微鏡檢查。每個樣品3個視野鏡下計數陽性細胞。
1.4.5 逆轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）
取結腸組織50 mg，按照Trizol試劑盒說明提取總RNA，分光光度計測定RNA濃度，互補DNA合成，PCR擴增。引物由上海英俊生物技術有限公司合成（表 1）。PCR反應條件為95℃ 30 s；95℃ 3 s，60℃ 30 s，40個循環。目的基因的相對表達量可以采用??CT法加以分析。通常以正常或陰性作為對照樣本。CT值—n：擴增循環，?CT=目的基因CT-內參CT（注：同一反轉錄產物擴增后），??CT=觀察樣本?CT-對照樣本?CT=（觀察樣本目的基因CT-觀察樣本內參CT）-（對照樣本目的基因CT-對照樣本內參CT）；樣本的相對表達量=2-??CT
表1
引物序列
1.5 統計學方法
采用統計軟件SPSS 19.0分析數據。計量資料數據以均數±標準差表示，均數的組間差異采用方差分析，組間兩兩比較采用LSD法。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 各組大鼠肉眼及光學顯微鏡下觀察結腸組織形態及黏膜損傷評分結果
潰瘍性大鼠病變結腸黏膜肉眼可見潰瘍多發，腸壁增厚，黏膜糜爛并充血；中藥組、抑制劑組及中藥+抑制組結腸黏膜充血程度減輕，輕度糜爛，潰瘍不明顯。與正常組比較，模型組大鼠組織學損傷程度嚴重，有統計學意義（P＜0.001）；與模型組比較，中藥及抑制劑干預各組結腸黏膜損傷程度減輕，有統計學意義（P＜0.05）。光學顯微鏡下，模型組大鼠結腸黏膜潰瘍可達肌層，潰瘍面較大，炎癥反應重度，伴充血、糜爛，輕度纖維化；中藥及抑制劑干預各組可見不同程度損傷改變，但程度較模型組輕。組織學評分結果表明，與正常組比較，模型組大鼠組織學損傷程度嚴重，有統計學意義（P＜0.05）；與模型組比較，給藥各組結腸黏膜損傷程度減輕，有統計學意義（P＜0.05）。見表 2。
表2
各組大鼠肉眼及光學顯微鏡下觀察黏膜組織損傷分值 （n=10，2.2 結腸組織病理學變化
光學顯微鏡下可見正常組結腸組織見腺體排列整齊，隱窩正常，杯狀細胞無減少，無黏膜糜爛、出血；模型組可見腺腔不規則擴張，腺管排列紊亂，黏膜及黏膜下層血管有高度擴張充血，甚至個別模型的結腸組織切片可見巨大潰瘍，潰瘍深達肌層，并有大量炎細胞浸潤，浸潤程度可及黏膜下或固有層，部分浸潤全層，以中性粒細胞、淋巴細胞為主；抑制劑組可見黏膜消失或部分消失，腺體排列紊亂，炎性細胞浸潤，但較模型組有所減輕；中藥組及中藥+抑制劑組的組織損傷最輕，多表現為接近正常組。見圖 1。
圖1
各組結腸組織光學顯微鏡下病理學變化（HE ×100） 1a. 正常組結腸組織見腺體排列整齊，隱窩正常，杯狀細胞正常，無黏膜糜爛、出血 1b. 模型組結腸組織見腺腔不規則擴張，腺管排列紊亂，黏膜及黏膜下層血管有高度擴張充血，有大量炎細胞浸潤，以中性粒細胞、淋巴細胞為主 1c. 模型組可見巨大潰瘍，潰瘍深達肌層 1d. 中藥組結腸組織損傷較小，腺管排列基本整齊，隱窩正常，杯狀細胞無減少，未見黏膜糜爛 1e.抑制劑組可見黏膜消失或部分消失，腺體排列紊亂，炎性細胞浸潤，但較模型組有所減輕 1f. 中藥+抑制劑組組織損傷最輕，表現接近正常組? ?圖 2TUNEL法檢測細胞凋亡（400倍鏡下，電壓2.79 V，電流2.51 A，陽性細胞核棕褐色染色） 2a. 正常組：凋亡細胞數目較少（褐色染色細胞少） 2b. 模型組：凋亡細胞數目明顯增多（褐色染色細胞核較多） 2c. 中藥組：凋亡細胞數目較模型組少（褐色細胞核減少） 2d. 抑制劑組：凋亡細胞數目較模型組少 2e. 中藥+抑制劑組：凋亡細胞數目減少（褐色細胞核減少）
2.3 香連丸對大鼠結腸組織細胞凋亡的影響
光學顯微鏡下可見陽性細胞核棕褐色染色（圖 2）。各組凋亡指數分別為正常組（5.53±2.49）%，模型組（21.20±5.37）%，中藥組（7.93±2.87）%，抑制劑組（10.60±4.97）%，中藥+抑制劑組（8.66±3.24）%，模型組凋亡指數明顯高于其他各組，差異有統計學意義（P＜0.001）；經藥物干預后的中藥組/抑制劑組細胞凋亡指數較模型組明顯減少，有統計學意義（P＜0.001）；而藥物干預后的各組與正常組相比無明顯差異（P＞0.05）。見圖 3。
圖3
TUNEL 法檢測各組細胞凋亡情況
2.4 香連丸對大鼠Bcl-2、Bax mRNA的表達影響
與正常組比較，模型組大鼠結腸組織Bcl-2 mRNA表達降低，差異有統計學意義（P＜0.05）；與模型組比較，中藥組、抑制劑組及中藥+抑制劑組結腸組織中Bcl-2 mRNA表達水平均升高，接近正常組，差異有統計學意義（P＜0.05）；與正常組比較，模型組大鼠結腸組織Bax的mRNA表達增加，差異有統計學意義（P＜0.05）；與模型組比較，中藥組、抑制劑組及中藥+抑制劑組結腸組織中Bax mRNA表達水平降低，接近正常組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表 3、圖 4。
圖4
各組大鼠結腸組織中Bcl-2、Bax mRNA表達
4a. Bcl-2 mRNA的表達 4b. Bax mRNA的表達
表3
各組大鼠結腸組織中Bcl-2、Bax 的mRNA 相對表達量（n=10，3 討論
正常結腸上皮存在凋亡現象，是腸上皮細胞更新的生理過程，為自發性凋亡；而UC炎癥時黏膜上皮細胞凋亡速率明顯增加。上皮細胞凋亡的增加可能導致上皮屏障的改變，從而增加腸損傷的發生[2]。細胞凋亡是在某些生理或病理因素誘導下，激活膜信號系統，啟動自身內部機制，主要通過內源性DNA內切酶的激活而發生的自然死亡現象[3]。凋亡對確保正常發育、生長以及維持內環境穩定有著重要的作用。細胞凋亡是由參與細胞凋亡的系列基因相對表達程度決定的，并受多種細胞因子的影響，細胞凋亡參與組織中炎癥細胞數量的調節。研究表明，UC患者淋巴細胞凋亡延遲[4]，淋巴細胞介導的細胞毒作用在UC發病機制中占重要地位。腸道免疫-炎癥調節功能異常，不能將免疫反應下調，使得腸道炎癥反應得以持續[5]。
細胞凋亡常通過Bcl-2家族中的Bcl-2和Bax來調節。Bcl-2是抑制細胞凋亡的一種癌基因[6]，編碼一個相對分子質量為26×103的蛋白，借助C端疏水區定位于線粒體外膜、內質網膜、核膜上，直接影響線粒體膜功能，其主要生物學功能是延長細胞壽命，增加細胞對多種調亡刺激因素的抗性，被認為是細胞凋亡調控的最后通路之一。Bax是凋亡基因家族的核心成員之一，由p53直接激活，提高凋亡的敏感性，促進p53介導的細胞凋亡。有研究認為Bcl-2可作為促細胞生存信號，而Bax是促進上皮細胞凋亡的組成部分，并且影響Bcl-2的凋亡作用，Bcl-2與Bax的比例決定了細胞的存活或死亡[2, 7]。有研究顯示Bax/Bcl-2比率增加，提高線粒體釋放細胞色素C，促進腸壁損傷的進行[8]。Bax/Bcl-2比率與上皮細胞凋亡呈正相關[9]。?亦有研究發現Bax蛋白和mRNA在活動性UC的結腸上皮表達減少，在正常黏膜和非活動性UC則增加[10-13]。
本研究的前期試驗中，發現白細胞介素-6/信號轉導及轉錄激活蛋白（STAT）3信號通路相關因子表達異常是UC發生的重要分子生物學基礎，STAT3活化抑制劑piceatannol可以使細胞凋亡調控蛋白Bcl-2表達減弱[14]，表明STAT3途徑可調節Bcl-2表達，STAT3的活化通過增強Bcl-2表達，顯示其抗凋亡效應。有研究顯示，UC患者腸黏膜中Bcl-2表達增加，且以上皮細胞、淋巴細胞和漿細胞為主，而炎性細胞中Bax表達減少，說明UC腸黏膜炎性細胞的凋亡減少與上皮細胞的凋亡增加同步進行，在UC的潰瘍形成中起一定作用[15]。亦有研究表明，UC患者腸黏膜組織中Bcl-2、Bax均下調，其中，Bax的凋亡主要是上皮細胞，Bcl-2的凋亡主要是淋巴細胞，并且兩者具有弱相關性[16]。故在本實驗中分組采用了STAT3通路中的抑制劑AG-490干預，觀察香連丸干預、抑制劑干預及中藥+抑制劑共同干預的細胞凋亡結果。本實驗研究發現在UC模型大鼠中結腸組織中Bcl-2 mRNA的表達降低，抗凋亡性減退，而Bax mRNA表達相對增加，細胞凋亡加速，腸道上皮細胞凋亡進程加快，促進腸壁損傷。
中藥古方香連丸出自《太平惠民和劑局方》，是臨床治療濕熱痢疾的主要方劑之一，具有清熱燥濕，行氣化滯之功效。目前，臨床多用于治療大腸濕熱所致的痢疾、腸炎、腸傷寒或者胃炎等屬濕熱為患者。現代藥理研究表明，香連丸具有抗潰瘍、解痙、抗病原微生物、止瀉等作用，在本實驗研究證實，香連丸可提高Bax mRNA、減少Bcl-2 mRNA的表達，改善結腸黏膜損傷，減少上皮細胞凋亡，改善細胞凋亡情況，其機制可能是通過調節凋亡因子Bcl-2、Bax mRNA表達的平衡，調節Bax/Bcl-2的比例，誘導結腸黏膜固有層淋巴細胞凋亡，達到緩解UC目的，這一發現可能為UC的中藥治療提供新的理論基礎。
綜上所述，本實驗運用TNBS經典造模方法建立UC模型大鼠，觀察UC模型大鼠的結腸病理情況，發現結腸黏膜損傷情況與細胞凋亡因子Bcl-2、Bax的變化有關；通過有效中成藥香連丸干預，發現可提高Bcl-2 mRNA、減少Bax mRNA的表達，其機制可能是通過調節Bcl-2、Bax mRNA表達的平衡，調節Bax/Bcl-2的比例，緩解上皮細胞凋亡。
