引用本文： 陳斌, 李雅斐, 蘇云潔, 李熙鴻. 地塞米松對膿毒癥相關性腦病大鼠海馬區星形膠質細胞哺乳動物雷帕霉素靶蛋白表達的影響. 華西醫學, 2016, 31(6): 1013-1018. doi: 10.7507/1002-0179.201600273 復制
膿毒癥相關性腦病（SAE）是全身炎癥反應引起的腦損傷，常見于嚴重膿毒癥/膿毒性休克患者[1]。其發病可能與全身炎癥反應時氧化應激[2]、細胞因子風暴[3]、線粒體功能障礙[4]、細胞凋亡[5]和腦血流量減少[6]等有關。臨床上主要采用對癥支持治療，其中，具有抗炎作用的糖皮質激素在嚴重膿毒癥/膿毒性休克患者中的應用仍存在爭議[6-8]。
中樞神經系統感染時星形膠質細胞被活化，細胞數量增加，以便清除壞死的組織和細胞，并阻止病原微生物、內毒素、炎性細胞侵入腦組織，有助于宿主的防御和腦組織的修復[9]。膠質纖維酸性蛋白（GFAP）是星形膠質細胞特異表達的細胞骨架蛋白，為星形膠質細胞免疫熒光染色的特征性標記[10]。哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）是一種非典型絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，參與了機體的免疫調節，其適度表達對神經細胞具有保護作用[11]。但是，關于SAE時海馬區星形膠質細胞表達mTOR的研究比較少。本實驗擬建立SAE大鼠模型，采用免疫熒光等技術，研究SAE時海馬區星形膠質細胞mTOR表達及地塞米松對其表達的影響。
1 材料與方法
1.1 實驗動物
無特定病原體級30日齡雄性Wistar大鼠90只，購自四川簡陽達碩動物科技有限公司，平均體質量（110±15） g，所有大鼠均在避強光、避噪音、自由獲取飼料和水的環境中飼養。
1.2 主要材料和儀器
一抗GFAP鼠抗免疫球蛋白（Ig）G和mTOR兔抗IgG（美國Millipore公司），二抗DyLight 488山羊抗鼠和Cy3山羊抗兔抗體IgG（美國Jackson ImmunoResearch公司），Western二抗為辣根過氧化物酶標志的羊抗兔IgG抗體（美國Sigma公司），Western發光底物（ECL）顯色試劑盒（美國Sigma公司），轉移緩沖液（美國Amresco公司），三羥甲基氨基甲烷緩沖液（TBS，美國Amresco公司），三羥甲基氨基甲烷緩沖液+吐溫（TBST，美國Amreseo公司），多導生理記錄儀（日本光電公司），光學顯微鏡（日本Olympus公司），H-600透射電子顯微鏡（日本Hitachi公司），GDS8000凝膠成像分析系統（美國UVP公司）。
1.3 動物分組和SAE大鼠模型建立
1.3.1 動物分型
90只30日齡Wistar大鼠按隨機數字表法分為假手術組（10只）和盲腸結扎穿孔術（CLP）組（80只）；SAE造模成功后，再將SAE大鼠隨機分為未使用地塞米松組（腦病未治療組）和使用地塞米松組（地塞米松組）。
1.3.2 腦電圖和誘發電位的監測
大鼠在CLP或假手術前10 d放置腦電監測電極。腹腔內注射10%水合氯醛（0.4 mL/100 g）麻醉大鼠，常規外科消毒，在頭顱中間矢狀位行約3 cm皮膚切口，分離軟組織，去除骨膜。用牙科鉆在頭顱前囟點后2.5 mm與右側矢狀縫旁2.5 mm處（皮質電極）和前囟點前10 mm與矢狀面兩側1 mm處（額竇電極）分別鉆孔，將3根不銹鋼螺絲輕輕置入硬腦膜。放置好電極后，用牙托粉固定并封閉骨孔，縫合皮膚。兩個刺激電極置于大鼠左側尾巴中，兩電極間距2 mm。
腦電圖監測：立體定位儀將大鼠頭部固定，皮質電極記錄腦電圖，對側額竇電極作為信號地線。腦電圖機記錄δ波（0.5～3 Hz），θ波（4～8 Hz），α波（8～13 Hz）和β波（13～30 Hz）的頻帶，以及棘波出現的時間。
軀體誘發電位（SEP）監測：兩個刺激電極刺激大鼠產生SEP。刺激信號為多導生理記錄儀產生的2 ms直流方形波脈沖，強度為5～15 mA，波寬10 ms，頻率3 Hz，疊加次數200次。皮質電極記錄SEP，同側額竇電極作為參考電極，對側額竇電極作為信號地線。觀察記錄P1波的波幅（μV）和P1、N1波的潛伏期（ms）。
1.3.3 動物模型的建立
按照參考文獻[12]建立膿毒癥大鼠CLP模型和實施假手術。CLP組采用CLP。腹腔內注射10%水合氯醛（0.4 mL/100 g）麻醉大鼠，待大鼠被麻醉后，用膠布固定于手術臺上，聚維酮碘溶液消毒腹部皮膚，沿腹中線行約2 cm的縱向切口，打開腹腔，找到盲腸，將盲腸內容物輕輕擠向遠端盲腸，在盲腸根部結扎盲腸，用18GG的穿刺針在盲腸根部從腸系膜側向腸系膜游離側穿刺2次，擠出少量糞便至腹腔，回納盲腸至腹腔，保持切口不被糞便污染，逐層縫合腹壁，術后皮下注射林格液（5 mL/100 g）抗休克。假手術組未進行盲腸結扎和穿刺，余處理同上。
CLP后12 h觀察記錄大鼠的精神及活動狀態、切口愈合狀況及有無感染等一般情況，進行神經行為學評分（包括耳廓反射、角膜反射、翻正反射、甩尾反射和逃避反射），0分為無反射，1分為反射減弱（10 s以內缺乏反射），2分為正常反射，最高評分為10分。并完成腦電圖和SEP檢查，如神經行為學評分降低，并伴有腦電圖、SEP異常則診斷為SAE[13]，證明SAE大鼠動物模型建立成功。
SAE大鼠造模成功后，地塞米松組行尾靜脈注射地塞米松（1 mg/kg），隔天1次，共3次；腦病未治療組注射同劑量的生理鹽水。
1.4 標本收集
大鼠40日齡時再次進行神經行為學評分和腦電圖、SEP檢查，然后統一處死大鼠，在冠狀面視交叉后1～4 mm處切取腦組織，部分組織采用4%多聚甲醛溶液固定，常規方法石蠟包埋、切片，行蘇木精-伊紅染色及免疫組織化學檢測，其余置?80℃冰箱備用。
1.5 蛋白質印跡法檢測mTOR蛋白的表達
提取大鼠海馬區腦組織總蛋白，用蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。制備十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠，上樣電泳，濕轉法將蛋白轉至聚偏二氟乙烯膜上，TBST漂洗膜3次，脫脂牛奶封閉轉印膜，然后，將膜置于溶有LC3或β-actin的一抗體的封閉液中，室溫0.5 h，4℃過夜，TBST在室溫下脫色，TBS漂洗10 min，同上方法進行二抗稀釋液與膜接觸。取出轉印膜，加ECL底物顯色液，室溫反應1 min；放進暗盒中，洗片，將膠片進行掃描或拍照。另外，凝膠圖像處理系統分析十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠上的蛋白條帶，測定mTOR和β-actin條帶吸光度值，并計算mTOR/β-actin的比值。
1.6 免疫熒光檢測GFAP和mTOR的表達
4%多聚甲醛固定待測腦組織24～48 h，4%瓊脂糖包埋組織，震蕩切片，切片厚度4 μm，漂洗后用5%的胎牛血清封閉液室溫封閉1 h，加入1︰200稀釋的一抗，4℃冰箱孵育過夜，37 ℃復溫l h，磷酸鹽緩沖液（PBS）振蕩洗滌3遍；加入1︰800稀釋的二抗，37℃避光孵育1 h，PBS振蕩洗滌3遍；用90%甘油封片，4℃冰箱避光保存，熒光顯微鏡觀察。
1.7 數據收集
在熒光顯微鏡的電腦屏幕上，觀察星形膠質細胞的形態。不同倍數的物鏡下采集圖像，采用圖像分析系統軟件（Software Image Pm Plus 4.5 for Windows）進行定量的分析。
1.8 統計學方法
應用SPSS 19.0統計學軟件對數據進行統計學分析。正態分布計量資料采用均數±標準差表示，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 CLP大鼠SAE的發病率
80只CLP Wistar大鼠在術后12 h內死亡6只，CLP后12 h時檢查發現存活74只大鼠中有28只出現神經行為學評分降低、腦電圖和SEP異常，診斷為SAE，發病率為37.84%（28/74）。
2.2 地塞米松對SAE大鼠神經行為學、腦電圖和SEP的影響
大鼠40日齡時，對各組6只大鼠進行神經行為學評分、腦電圖和SEP檢查，結果顯示：與腦病未治療組比較，地塞米松組大鼠神經行為學評分降低；腦電圖的α波明顯減少，δ波增加；SEP的P1振幅下降，P1和N1潛伏期延長；以上差異有統計學意義（P＜0.05）。見表 1。
表1
各組大鼠神經行為學評分、腦電圖和SEP的比較（n=6，2.3 地塞米松對SAE大鼠海馬區神經細胞mTOR表達的影響
地塞米松組大鼠海馬區神經細胞mTOR表達明顯低于腦病未治療組（P＜0.05）。見圖 1、2。
圖1
蛋白質印跡法檢測SAE 大鼠海馬區神經細胞mTOR 的表達? ?圖 2各組 mTOR 陽性細胞百分比直條圖 *與假手術組和地塞米松組比較，P＜0.05? ?圖 33 各組GFAP陽性細胞數量直條圖? ?圖 4各組大鼠海馬區星形膠質細胞免疫熒光圖片（標尺：30 μm） 綠色熒光示星形膠質細胞GFAP 4a. 假手術組 4b. 腦病未治療組 4c. 地塞米松組? ?圖 55 各組大鼠海馬區星形膠質細胞免疫熒光圖片（標尺：50 μm）? ?圖 6各組GFAP/mTOR融合后陽性細胞數量直條圖 *與假手術組和地塞米松組比較，P＜0.05；#與假手術組比較，P＜0.05
2.4 SAE大鼠海馬區星形膠質細胞對地塞米松的反應
GFAP免疫熒光染色提示：假手術組大鼠海馬區星形膠質細胞胞體小，突起細。而腦病未治療組星形膠質細胞胞體和突起肥大，與假手術組比較，細胞數量明顯增多（P＜0.05）。與腦病未治療組比較，地塞米松組星形膠質細胞胞體小，突起細，細胞數量明顯減少（P＜0.05）。見圖 3、4。
2.5 地塞米松對SAE大鼠海馬區星形膠質細胞mTOR表達的影響
假手術組和地塞米松組大鼠海馬區表達mTOR的星形膠質細胞較少。與假手術組比較，腦病未治療組表達mTOR的星形膠質細胞數量明顯增多（P＜0.05）；與腦病未治療組比較，地塞米松組表達mTOR的星形膠質細胞數量明顯減少（P＜0.05）。見圖 5、6。
3 討論
本研究通過CLP建立SAE大鼠模型和熒光免疫技術發現，SAE大鼠在全身炎癥反應時海馬區星形膠質細胞胞體明顯增大，突起肥大，細胞數量增加，mTOR表達上調。SAE大鼠使用地塞米松治療后海馬區星形膠質細胞胞體變小，突起變細，細胞數量減少，mTOR表達下調，大鼠神經行為學評分降低，腦電圖和SEP明顯異常。上述研究結果表明，SAE時大鼠海馬區星形膠質細胞被激活，細胞出現反應性增生，免疫反應增強，而地塞米松對其具有抑制作用。
星形膠質細胞被激活，反應性增生是中樞神經系統感染，尤其是不同類型病毒性腦炎突出的病理改變[13]，而腹膜炎所致的全身炎癥反應也可以誘導星形膠質細胞反應性增生[14]。但是，增生活化的星形膠質細胞對神經元是否存在保護作用仍存在爭論。一方面，增生活化的星形膠質細胞可以通過包繞血管周圍炎癥細胞和受損組織，分泌神經營養因子，如堿性成纖維生長因子、腦源性生長因子等，在神經保護及修復中發揮作用[14]。另一方面，增生活化的星形膠質細胞也可分泌腫瘤壞死因子-α[15]、白細胞介素-6[16]等前炎癥細胞因子，導致免疫損傷。SAE時星形膠質細胞是否存在反應性增生，對神經系統的作用并不十分清楚。因此，我們擬研究SAE時大鼠海馬區星形膠質細胞反應性增生，同時檢查其mTOR的表達。
mTOR在細胞凋亡及自噬、蛋白質合成、免疫、細胞運動及代謝中發揮重要的作用[17]。當機體缺乏營養、能量和生長因子時，mTOR可以根據機體的需要調節細胞胞體的擴張能力，促進細胞生長，同時，通過激活下游效應分子S6K1，傳遞有絲分裂信號，上調細胞周期素和細胞周期依賴性蛋白激酶的翻譯功能，促進細胞增殖與分化[18]，另外，mTOR也可以通過調節蛋白質的合成、抗凋亡和抗自噬功能參與細胞的生長和增殖[19]。在單核細胞、巨噬細胞及樹突狀細胞殖的炎性反應中，mTOR可抑制核轉錄因子κB生成，激活信號轉導及轉錄激活蛋白3，增加抗炎因子白細胞介素-10的產生[19-20]，同時，mTOR也可以通過調節T細胞活化參與炎癥反應時的免疫調節[21]。因此，炎癥反應時適度mTOR表達有利于神經細胞增生和修復。本研究表明，SAE時大鼠海馬區星形膠質細胞被激活，GFAP表達上調，存在反應性增生，同時，具有促神經生長、抗凋亡、抗自噬和抗炎作用的mTOR表達上調，提示在SAE早期，激活的星形膠質細胞可能對中樞神經系統具有保護作用。
盡管糖皮質激素在嚴重膿毒癥/膿毒性休克中的使用已有大量的研究，但是，其安全性和有效性仍存在爭論[6-8]。Minneci等[22]Meta分析研究了糖皮質激素治療嚴重膿毒癥/膿毒性休克的療效，認為膿毒性休克時氫化可的松5～7 d生理劑量使用可以提高患者的生存率。Levy等[23]通過建立腦膜炎球菌所致膿毒癥小鼠模型研究了地塞米松治療膿毒癥的療效，結果表明，地塞米松可以提高血液中白細胞介素-10的水平，降低腫瘤壞死因子-α水平和血中細菌的負荷，作者認為膿毒癥時地塞米松的使用可能會對機體產生有利影響。但是，Atkinson等[24]對糖皮質激素在膿毒性休克中的應用進行了風險分層分析，發現膿毒性休克患者并不能從糖皮質激素使用中獲益。Casserly等[25]研究發現糖皮質激素使用可以增加膿毒性休克患者住院病死率。本研究發現，大鼠患SAE時，地塞米松可以抑制其海馬區星形膠質細胞的反應性增生，下調mTOR表達，且與腦病未治療組比較，地塞米松組大鼠神經行為學、腦電圖和SEP并未得到改善，反而導致大鼠神經行為學評分降低。上述結果表明，SAE時，早期使用地塞米松可能不利于其腦損傷的修復。
綜上所述，SAE大鼠在全身炎癥反應時，海馬區星形膠質細胞mTOR表達上調，細胞出現反應性增生，從而抵抗大鼠神經損傷，而早期使用地塞米松可以抑制上述反應，不利于SAE腦損傷的修復。因此，建議SAE患者，特別是兒童，不宜早期使用地塞米松。
膿毒癥相關性腦病（SAE）是全身炎癥反應引起的腦損傷，常見于嚴重膿毒癥/膿毒性休克患者[1]。其發病可能與全身炎癥反應時氧化應激[2]、細胞因子風暴[3]、線粒體功能障礙[4]、細胞凋亡[5]和腦血流量減少[6]等有關。臨床上主要采用對癥支持治療，其中，具有抗炎作用的糖皮質激素在嚴重膿毒癥/膿毒性休克患者中的應用仍存在爭議[6-8]。
中樞神經系統感染時星形膠質細胞被活化，細胞數量增加，以便清除壞死的組織和細胞，并阻止病原微生物、內毒素、炎性細胞侵入腦組織，有助于宿主的防御和腦組織的修復[9]。膠質纖維酸性蛋白（GFAP）是星形膠質細胞特異表達的細胞骨架蛋白，為星形膠質細胞免疫熒光染色的特征性標記[10]。哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）是一種非典型絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，參與了機體的免疫調節，其適度表達對神經細胞具有保護作用[11]。但是，關于SAE時海馬區星形膠質細胞表達mTOR的研究比較少。本實驗擬建立SAE大鼠模型，采用免疫熒光等技術，研究SAE時海馬區星形膠質細胞mTOR表達及地塞米松對其表達的影響。
1 材料與方法
1.1 實驗動物
無特定病原體級30日齡雄性Wistar大鼠90只，購自四川簡陽達碩動物科技有限公司，平均體質量（110±15） g，所有大鼠均在避強光、避噪音、自由獲取飼料和水的環境中飼養。
1.2 主要材料和儀器
一抗GFAP鼠抗免疫球蛋白（Ig）G和mTOR兔抗IgG（美國Millipore公司），二抗DyLight 488山羊抗鼠和Cy3山羊抗兔抗體IgG（美國Jackson ImmunoResearch公司），Western二抗為辣根過氧化物酶標志的羊抗兔IgG抗體（美國Sigma公司），Western發光底物（ECL）顯色試劑盒（美國Sigma公司），轉移緩沖液（美國Amresco公司），三羥甲基氨基甲烷緩沖液（TBS，美國Amresco公司），三羥甲基氨基甲烷緩沖液+吐溫（TBST，美國Amreseo公司），多導生理記錄儀（日本光電公司），光學顯微鏡（日本Olympus公司），H-600透射電子顯微鏡（日本Hitachi公司），GDS8000凝膠成像分析系統（美國UVP公司）。
1.3 動物分組和SAE大鼠模型建立
1.3.1 動物分型
90只30日齡Wistar大鼠按隨機數字表法分為假手術組（10只）和盲腸結扎穿孔術（CLP）組（80只）；SAE造模成功后，再將SAE大鼠隨機分為未使用地塞米松組（腦病未治療組）和使用地塞米松組（地塞米松組）。
1.3.2 腦電圖和誘發電位的監測
大鼠在CLP或假手術前10 d放置腦電監測電極。腹腔內注射10%水合氯醛（0.4 mL/100 g）麻醉大鼠，常規外科消毒，在頭顱中間矢狀位行約3 cm皮膚切口，分離軟組織，去除骨膜。用牙科鉆在頭顱前囟點后2.5 mm與右側矢狀縫旁2.5 mm處（皮質電極）和前囟點前10 mm與矢狀面兩側1 mm處（額竇電極）分別鉆孔，將3根不銹鋼螺絲輕輕置入硬腦膜。放置好電極后，用牙托粉固定并封閉骨孔，縫合皮膚。兩個刺激電極置于大鼠左側尾巴中，兩電極間距2 mm。
腦電圖監測：立體定位儀將大鼠頭部固定，皮質電極記錄腦電圖，對側額竇電極作為信號地線。腦電圖機記錄δ波（0.5～3 Hz），θ波（4～8 Hz），α波（8～13 Hz）和β波（13～30 Hz）的頻帶，以及棘波出現的時間。
軀體誘發電位（SEP）監測：兩個刺激電極刺激大鼠產生SEP。刺激信號為多導生理記錄儀產生的2 ms直流方形波脈沖，強度為5～15 mA，波寬10 ms，頻率3 Hz，疊加次數200次。皮質電極記錄SEP，同側額竇電極作為參考電極，對側額竇電極作為信號地線。觀察記錄P1波的波幅（μV）和P1、N1波的潛伏期（ms）。
1.3.3 動物模型的建立
按照參考文獻[12]建立膿毒癥大鼠CLP模型和實施假手術。CLP組采用CLP。腹腔內注射10%水合氯醛（0.4 mL/100 g）麻醉大鼠，待大鼠被麻醉后，用膠布固定于手術臺上，聚維酮碘溶液消毒腹部皮膚，沿腹中線行約2 cm的縱向切口，打開腹腔，找到盲腸，將盲腸內容物輕輕擠向遠端盲腸，在盲腸根部結扎盲腸，用18GG的穿刺針在盲腸根部從腸系膜側向腸系膜游離側穿刺2次，擠出少量糞便至腹腔，回納盲腸至腹腔，保持切口不被糞便污染，逐層縫合腹壁，術后皮下注射林格液（5 mL/100 g）抗休克。假手術組未進行盲腸結扎和穿刺，余處理同上。
CLP后12 h觀察記錄大鼠的精神及活動狀態、切口愈合狀況及有無感染等一般情況，進行神經行為學評分（包括耳廓反射、角膜反射、翻正反射、甩尾反射和逃避反射），0分為無反射，1分為反射減弱（10 s以內缺乏反射），2分為正常反射，最高評分為10分。并完成腦電圖和SEP檢查，如神經行為學評分降低，并伴有腦電圖、SEP異常則診斷為SAE[13]，證明SAE大鼠動物模型建立成功。
SAE大鼠造模成功后，地塞米松組行尾靜脈注射地塞米松（1 mg/kg），隔天1次，共3次；腦病未治療組注射同劑量的生理鹽水。
1.4 標本收集
大鼠40日齡時再次進行神經行為學評分和腦電圖、SEP檢查，然后統一處死大鼠，在冠狀面視交叉后1～4 mm處切取腦組織，部分組織采用4%多聚甲醛溶液固定，常規方法石蠟包埋、切片，行蘇木精-伊紅染色及免疫組織化學檢測，其余置?80℃冰箱備用。
1.5 蛋白質印跡法檢測mTOR蛋白的表達
提取大鼠海馬區腦組織總蛋白，用蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。制備十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠，上樣電泳，濕轉法將蛋白轉至聚偏二氟乙烯膜上，TBST漂洗膜3次，脫脂牛奶封閉轉印膜，然后，將膜置于溶有LC3或β-actin的一抗體的封閉液中，室溫0.5 h，4℃過夜，TBST在室溫下脫色，TBS漂洗10 min，同上方法進行二抗稀釋液與膜接觸。取出轉印膜，加ECL底物顯色液，室溫反應1 min；放進暗盒中，洗片，將膠片進行掃描或拍照。另外，凝膠圖像處理系統分析十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠上的蛋白條帶，測定mTOR和β-actin條帶吸光度值，并計算mTOR/β-actin的比值。
1.6 免疫熒光檢測GFAP和mTOR的表達
4%多聚甲醛固定待測腦組織24～48 h，4%瓊脂糖包埋組織，震蕩切片，切片厚度4 μm，漂洗后用5%的胎牛血清封閉液室溫封閉1 h，加入1︰200稀釋的一抗，4℃冰箱孵育過夜，37 ℃復溫l h，磷酸鹽緩沖液（PBS）振蕩洗滌3遍；加入1︰800稀釋的二抗，37℃避光孵育1 h，PBS振蕩洗滌3遍；用90%甘油封片，4℃冰箱避光保存，熒光顯微鏡觀察。
1.7 數據收集
在熒光顯微鏡的電腦屏幕上，觀察星形膠質細胞的形態。不同倍數的物鏡下采集圖像，采用圖像分析系統軟件（Software Image Pm Plus 4.5 for Windows）進行定量的分析。
1.8 統計學方法
應用SPSS 19.0統計學軟件對數據進行統計學分析。正態分布計量資料采用均數±標準差表示，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 CLP大鼠SAE的發病率
80只CLP Wistar大鼠在術后12 h內死亡6只，CLP后12 h時檢查發現存活74只大鼠中有28只出現神經行為學評分降低、腦電圖和SEP異常，診斷為SAE，發病率為37.84%（28/74）。
2.2 地塞米松對SAE大鼠神經行為學、腦電圖和SEP的影響
大鼠40日齡時，對各組6只大鼠進行神經行為學評分、腦電圖和SEP檢查，結果顯示：與腦病未治療組比較，地塞米松組大鼠神經行為學評分降低；腦電圖的α波明顯減少，δ波增加；SEP的P1振幅下降，P1和N1潛伏期延長；以上差異有統計學意義（P＜0.05）。見表 1。
表1
各組大鼠神經行為學評分、腦電圖和SEP的比較（n=6，2.3 地塞米松對SAE大鼠海馬區神經細胞mTOR表達的影響
地塞米松組大鼠海馬區神經細胞mTOR表達明顯低于腦病未治療組（P＜0.05）。見圖 1、2。
圖1
蛋白質印跡法檢測SAE 大鼠海馬區神經細胞mTOR 的表達? ?圖 2各組 mTOR 陽性細胞百分比直條圖 *與假手術組和地塞米松組比較，P＜0.05? ?圖 33 各組GFAP陽性細胞數量直條圖? ?圖 4各組大鼠海馬區星形膠質細胞免疫熒光圖片（標尺：30 μm） 綠色熒光示星形膠質細胞GFAP 4a. 假手術組 4b. 腦病未治療組 4c. 地塞米松組? ?圖 55 各組大鼠海馬區星形膠質細胞免疫熒光圖片（標尺：50 μm）? ?圖 6各組GFAP/mTOR融合后陽性細胞數量直條圖 *與假手術組和地塞米松組比較，P＜0.05；#與假手術組比較，P＜0.05
2.4 SAE大鼠海馬區星形膠質細胞對地塞米松的反應
GFAP免疫熒光染色提示：假手術組大鼠海馬區星形膠質細胞胞體小，突起細。而腦病未治療組星形膠質細胞胞體和突起肥大，與假手術組比較，細胞數量明顯增多（P＜0.05）。與腦病未治療組比較，地塞米松組星形膠質細胞胞體小，突起細，細胞數量明顯減少（P＜0.05）。見圖 3、4。
2.5 地塞米松對SAE大鼠海馬區星形膠質細胞mTOR表達的影響
假手術組和地塞米松組大鼠海馬區表達mTOR的星形膠質細胞較少。與假手術組比較，腦病未治療組表達mTOR的星形膠質細胞數量明顯增多（P＜0.05）；與腦病未治療組比較，地塞米松組表達mTOR的星形膠質細胞數量明顯減少（P＜0.05）。見圖 5、6。
3 討論
本研究通過CLP建立SAE大鼠模型和熒光免疫技術發現，SAE大鼠在全身炎癥反應時海馬區星形膠質細胞胞體明顯增大，突起肥大，細胞數量增加，mTOR表達上調。SAE大鼠使用地塞米松治療后海馬區星形膠質細胞胞體變小，突起變細，細胞數量減少，mTOR表達下調，大鼠神經行為學評分降低，腦電圖和SEP明顯異常。上述研究結果表明，SAE時大鼠海馬區星形膠質細胞被激活，細胞出現反應性增生，免疫反應增強，而地塞米松對其具有抑制作用。
星形膠質細胞被激活，反應性增生是中樞神經系統感染，尤其是不同類型病毒性腦炎突出的病理改變[13]，而腹膜炎所致的全身炎癥反應也可以誘導星形膠質細胞反應性增生[14]。但是，增生活化的星形膠質細胞對神經元是否存在保護作用仍存在爭論。一方面，增生活化的星形膠質細胞可以通過包繞血管周圍炎癥細胞和受損組織，分泌神經營養因子，如堿性成纖維生長因子、腦源性生長因子等，在神經保護及修復中發揮作用[14]。另一方面，增生活化的星形膠質細胞也可分泌腫瘤壞死因子-α[15]、白細胞介素-6[16]等前炎癥細胞因子，導致免疫損傷。SAE時星形膠質細胞是否存在反應性增生，對神經系統的作用并不十分清楚。因此，我們擬研究SAE時大鼠海馬區星形膠質細胞反應性增生，同時檢查其mTOR的表達。
mTOR在細胞凋亡及自噬、蛋白質合成、免疫、細胞運動及代謝中發揮重要的作用[17]。當機體缺乏營養、能量和生長因子時，mTOR可以根據機體的需要調節細胞胞體的擴張能力，促進細胞生長，同時，通過激活下游效應分子S6K1，傳遞有絲分裂信號，上調細胞周期素和細胞周期依賴性蛋白激酶的翻譯功能，促進細胞增殖與分化[18]，另外，mTOR也可以通過調節蛋白質的合成、抗凋亡和抗自噬功能參與細胞的生長和增殖[19]。在單核細胞、巨噬細胞及樹突狀細胞殖的炎性反應中，mTOR可抑制核轉錄因子κB生成，激活信號轉導及轉錄激活蛋白3，增加抗炎因子白細胞介素-10的產生[19-20]，同時，mTOR也可以通過調節T細胞活化參與炎癥反應時的免疫調節[21]。因此，炎癥反應時適度mTOR表達有利于神經細胞增生和修復。本研究表明，SAE時大鼠海馬區星形膠質細胞被激活，GFAP表達上調，存在反應性增生，同時，具有促神經生長、抗凋亡、抗自噬和抗炎作用的mTOR表達上調，提示在SAE早期，激活的星形膠質細胞可能對中樞神經系統具有保護作用。
盡管糖皮質激素在嚴重膿毒癥/膿毒性休克中的使用已有大量的研究，但是，其安全性和有效性仍存在爭論[6-8]。Minneci等[22]Meta分析研究了糖皮質激素治療嚴重膿毒癥/膿毒性休克的療效，認為膿毒性休克時氫化可的松5～7 d生理劑量使用可以提高患者的生存率。Levy等[23]通過建立腦膜炎球菌所致膿毒癥小鼠模型研究了地塞米松治療膿毒癥的療效，結果表明，地塞米松可以提高血液中白細胞介素-10的水平，降低腫瘤壞死因子-α水平和血中細菌的負荷，作者認為膿毒癥時地塞米松的使用可能會對機體產生有利影響。但是，Atkinson等[24]對糖皮質激素在膿毒性休克中的應用進行了風險分層分析，發現膿毒性休克患者并不能從糖皮質激素使用中獲益。Casserly等[25]研究發現糖皮質激素使用可以增加膿毒性休克患者住院病死率。本研究發現，大鼠患SAE時，地塞米松可以抑制其海馬區星形膠質細胞的反應性增生，下調mTOR表達，且與腦病未治療組比較，地塞米松組大鼠神經行為學、腦電圖和SEP并未得到改善，反而導致大鼠神經行為學評分降低。上述結果表明，SAE時，早期使用地塞米松可能不利于其腦損傷的修復。
綜上所述，SAE大鼠在全身炎癥反應時，海馬區星形膠質細胞mTOR表達上調，細胞出現反應性增生，從而抵抗大鼠神經損傷，而早期使用地塞米松可以抑制上述反應，不利于SAE腦損傷的修復。因此，建議SAE患者，特別是兒童，不宜早期使用地塞米松。
