引用本文： 胡迎春, 鐘武, 陳睦虎, 李紹蘭, 李林芳. 基于生物信息學探討Yes-相關蛋白在大鼠心肌缺血再灌注損傷中的表達. 華西醫學, 2016, 31(6): 1008-1012. doi: 10.7507/1002-0179.201600272 復制
心肌缺血再灌注損傷在當今仍然威脅人類生命健康。現代研究發現其不僅涉及活性氧、內皮損傷等多種病理生理等方面的改變，還涉及自噬、微RNA、Toll-樣信號通路等多種機制調控[1-4]，但對其在基因水平的調控機制仍缺乏全面分析。隨著醫學科研技術的發展，基于基因芯片技術等高通量檢測方法使研究者對其基因水平全面認識變得可能。本研究擬利用GEO基因芯片數據，結合生物信息學技術篩選出大鼠心肌缺血再灌注差異基因，并從中找到其基因調控通路及關鍵基因，為后期實驗研究提供理論基礎。
1 材料與方法
1.1 篩選大鼠心肌缺血再灌注損傷差異基因及生物信息學分析
以“Myocardial ischemia reperfusion”為關鍵詞進入GEO數據庫（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）檢索，找到大鼠心肌缺血再灌注損傷基因芯片數據：GDS1959[
1.2 實驗動物與材料
1.2.1 實驗動物
雄性健康Sprague Dawley（SD）大鼠，清潔級，5 ~ 6周大小，體質量約為200 g，購于西南醫科大學實驗動物中心，所有實驗符合西南醫科大學實驗動物倫理委員會標準。
1.2.2 試劑與儀器
逆轉錄熒光定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR）試劑、核酸染料Sybr Green I引物（重慶Western Biotechnology公司）；預染蛋白marker （加拿大Fermentas公司）；一抗（美國 Santa Cruz公司）；辣根過氧化物酶二抗、電化學發光試劑（北京普利萊公司）。酶標儀（Sunrise Remote A-5082，美國Thermo公司）；聚合酶鏈反應（PCR）儀器 （System 7500，美國Applied Biosystem公司）；蛋白電泳儀（DYCZ-24DN，北京六一儀器廠）。
1.3 方法
1.3.1 大鼠心肌缺血再灌注損傷模型構建及標本采集
SD大鼠隨機分為正常組（n=6）、假手術組（n=6）和心肌缺血再灌注損傷組（模型組，n=6）。模型組水合氯醛腹腔注射麻醉，固定四肢、牙齒，氣管插管以及心電監護，開胸結扎冠狀動脈左前降支觀察心電圖，以出現QRS高大增寬為結扎成功標志，記錄缺血時間，40 min后輕拉松結線，打開血管再灌注，立即觀察心電圖[7]。假手術組僅開胸不結扎，其余同模型組。建模48 h后脊椎脫臼法處死大鼠。取心臟左前降支支配區域組織，10%甲醛溶液固定，石蠟包埋，制備組織切片；另快速取部分組織液氮凍存，制備組織勻漿。
1.3.2 免疫組織化學觀察Yes-相關蛋白（YAP）定位表達
取石蠟包埋心臟組織切片，采用EnVision二步法染色，操作按照說明書進行，以磷酸鹽緩沖液代替一抗作為陰性對照。陽性產物為棕黃色或棕褐色，背景為藍色。
1.3.3 qRT-PCR檢測YAP mRNA表達
取損傷心臟組織（每只大鼠心臟血管旁組織取3處），使用Trizol法提取總mRNA[8, 9]，逆轉錄反應條件的設置：25℃10 min，42℃ 50 min，85℃ 5 min；熒光定量PCR擴增條件的設置：94℃ 4 min；94℃ 20 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，循環35次，72℃檢測信號。YAP mRNA相對表達量以2（?ΔΔCt）計算。目的基因序列見表 1。
表1
目的基因序列
1.3.4 蛋白質印跡法檢測YAP蛋白表達水平
取心臟左前降支支配區域組織剪切成細小碎片；每 100 mg組織加入1 mL蛋白裂解液。用玻璃勻漿器勻漿；離心，取上清，蛋白濃度測定、十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳、封閉、孵育一抗（鼠抗 1︰1 000）、孵育二抗（兔抗鼠1︰5 000）、化學發光，顯影，定影。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）為內參。
1.4 統計學方法
采用SPSS 17.0軟件進行統計。計量數據均以均數±標準差表示，組間比較采用方差分析。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 生物信息學篩選心肌缺血再灌注信號通路
本研究共篩選到在大鼠心肌缺血再灌注2 d表達差異基因共345條，其中上調181條，下調164條；經FLINK分析出這些差異基因主要集中在代謝、免疫系統、信號傳導等生物學過程，每一個生物學過程至少包括15個基因。經KOBAS2.0分析出信號通路，其中HIPPO信號通路中富集達10條差異基因。見表 2。
表2
大鼠心肌缺血再灌注信號通路與主要生物學行為
2.2 基于KEGG通路圖篩選心肌缺血再灌注篩選關鍵基因
YAP、Mst1/2等為HIPPO通路的關鍵因子，且YAP為轉錄因子與TAZ結合后發生轉核，進一步促進下游基因的表達（圖 1）。本課題組選擇YAP進行下一步驗證。
圖1
KEGG 數據庫中顯示的HIPPO 信號通路圖
2.3 YAP蛋白在心肌缺血再灌注組織中的定位表達情況
大鼠缺血再灌注組織心肌細胞陽性表現為棕黃色或棕褐色，并呈顆粒狀，背景呈藍色。YAP蛋白主要在心肌細胞細胞質中表達，在模型組中較正常組和假手術組表達增多。見圖 2。
圖2
大鼠心肌缺血再灌注后YAP 蛋白在心肌細胞中的定位表達（免疫組織化學染色×200） 2a. 模型組 2b. 假手術組 2c. 正常組? ?圖 33 大鼠心肌缺血再灌注后YAP mRNA 在心肌中的表達情況? ?圖 4大鼠心肌缺血再灌注后YAP 蛋白在心肌中的定量表達情況 4a. 蛋白質印跡法檢測各組YAP 蛋白表達情況 4b. 各組YAP 蛋白相對表達量的直條圖。* 與假手術組和正常組比較，P＜0.05
2.4 qRT-PCR檢測YAP在心肌缺血再灌注組織中mRNA定量表達情況
心肌缺血再灌注后72 h，與正常組、假手術組相比，qRT-PCR檢測YAP在心肌缺血再灌注組織中mRNA表達較正常組上升至2.5倍（P＜0.05），假手術組與正常組差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖 3。
2.5 蛋白質印跡法檢測YAP蛋白在心肌缺血再灌注組織中的表達情況
YAP蛋白在模型組中的表達量約為正常組的2倍，是假手術組的1.8倍，差異具有統計學意義（P＜0.05）；假手術組與正常組差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖 4。
3 討論
GEO網站是目前最重要的對基因表達數據進行瀏覽、檢索的在線資源。其中GDS數據集對原始基因芯片數據進行了對數化、過濾以及標準化處理，并且GEO網站對每個GDS數據集中提供幾個在線輔助工具，方便研究者對數據的快捷分析。KOBAS 2.0是一個基于KEGG Orthology注釋系統的KOBAS更新版，其目的是運用常用的通路和疾病知識庫，來系統地識別和眾多通路與疾病相關的基因或蛋白質。本研究利用GEO網站大鼠心肌再灌注損傷后基因芯片GDS數據，并使用其在線篩選工具篩選出差異基因345條，并利用FLINK工具分析出心肌缺血再灌注損傷主要的生物學過程，如代謝、免疫系統、信號傳導等。基于差異基因的富集結果顯示其涉及多方面的生物過程，對其機制研究還需進一步細化深入。利用KOBAS2.0在線工具分析預測出所涉及的信號通路，如Wnt、HIPPO、MAPK、Jak-STAT等。
Wnt信號通路是廣泛存在于多細胞真核生物中的一條高度保守的信號通路，在胚胎發育過程中起到重要作用[10]，例如促進神經祖細胞的增殖，抑制其分化。MAPK信號通路與Jak-STAT信號轉導轉導通路存在于大多數細胞內，在將細胞外刺激信號轉導至細胞及其核內，并引起細胞生物學反應（如細胞增殖、分化、轉化及凋亡等）的過程中具有至關重要的作用[11, 12]。目前，HIPPO信號通路一般被認為與腫瘤抑制有關[13]，協同其他機制而控制組織生長。HIPPO信號通路還與組織損傷后的再生有關[14]。有研究報道HIPPO信號通路中的關鍵基因YAP/TAZ在慢性神經損傷中表達升高[15]；Orcholski等[16]發現其參與了阿爾茨海默病疾病過程；Heallen等[17]發現改變大鼠YAP基因將導致大鼠胚胎心臟發育缺陷，證實其與維持心臟的正常形態有關；而Xin等[18]研究發現YAP的過表達與心肌細胞增殖有關。另Schlegelmilch等[19]研究發現YAP與創傷后表皮愈合有關。HIPPO通路是一個保守的通路，在心肌缺血再灌注損傷中未見報道。本研究組發現YAP蛋白在大鼠心肌缺血再灌注中表達上升，但其作用機制有待進一步研究。推測其可能與其控制器官大小、接觸抑制功能所導致心肌重構有關。
通常研究采取的策略是直接驗證所篩選出來的基因，但基因芯片篩選的差異基因多達數百，甚至上千個。現在的觀點認為單一基因的作用有限，而應以信號通路作為模塊化研究。本研究針對信號通路的研究采用的策略是：① 先通過生物信息學篩選出差異基因富集的信號通路；② 通過閱讀文獻選取在心肌缺血再灌注損傷方向研究較少的信號通路進行重點研究，如本研究選取HIPPO信號通路；③ 再通過KEGG通路圖查找到該信號通路的關鍵基因，如本研究HIPPO信號通路中的關鍵基因YAP；④ 對該基因進行分子生物學方法驗證。研究驗證了我們的前期生物信息學技術篩選的信號通路結果，顯示出生物信息學技術篩選的準確性，說明其是一種高效的篩選技術。
心肌缺血再灌注損傷在當今仍然威脅人類生命健康。現代研究發現其不僅涉及活性氧、內皮損傷等多種病理生理等方面的改變，還涉及自噬、微RNA、Toll-樣信號通路等多種機制調控[1-4]，但對其在基因水平的調控機制仍缺乏全面分析。隨著醫學科研技術的發展，基于基因芯片技術等高通量檢測方法使研究者對其基因水平全面認識變得可能。本研究擬利用GEO基因芯片數據，結合生物信息學技術篩選出大鼠心肌缺血再灌注差異基因，并從中找到其基因調控通路及關鍵基因，為后期實驗研究提供理論基礎。
1 材料與方法
1.1 篩選大鼠心肌缺血再灌注損傷差異基因及生物信息學分析
以“Myocardial ischemia reperfusion”為關鍵詞進入GEO數據庫（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）檢索，找到大鼠心肌缺血再灌注損傷基因芯片數據：GDS1959[
1.2 實驗動物與材料
1.2.1 實驗動物
雄性健康Sprague Dawley（SD）大鼠，清潔級，5 ~ 6周大小，體質量約為200 g，購于西南醫科大學實驗動物中心，所有實驗符合西南醫科大學實驗動物倫理委員會標準。
1.2.2 試劑與儀器
逆轉錄熒光定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR）試劑、核酸染料Sybr Green I引物（重慶Western Biotechnology公司）；預染蛋白marker （加拿大Fermentas公司）；一抗（美國 Santa Cruz公司）；辣根過氧化物酶二抗、電化學發光試劑（北京普利萊公司）。酶標儀（Sunrise Remote A-5082，美國Thermo公司）；聚合酶鏈反應（PCR）儀器 （System 7500，美國Applied Biosystem公司）；蛋白電泳儀（DYCZ-24DN，北京六一儀器廠）。
1.3 方法
1.3.1 大鼠心肌缺血再灌注損傷模型構建及標本采集
SD大鼠隨機分為正常組（n=6）、假手術組（n=6）和心肌缺血再灌注損傷組（模型組，n=6）。模型組水合氯醛腹腔注射麻醉，固定四肢、牙齒，氣管插管以及心電監護，開胸結扎冠狀動脈左前降支觀察心電圖，以出現QRS高大增寬為結扎成功標志，記錄缺血時間，40 min后輕拉松結線，打開血管再灌注，立即觀察心電圖[7]。假手術組僅開胸不結扎，其余同模型組。建模48 h后脊椎脫臼法處死大鼠。取心臟左前降支支配區域組織，10%甲醛溶液固定，石蠟包埋，制備組織切片；另快速取部分組織液氮凍存，制備組織勻漿。
1.3.2 免疫組織化學觀察Yes-相關蛋白（YAP）定位表達
取石蠟包埋心臟組織切片，采用EnVision二步法染色，操作按照說明書進行，以磷酸鹽緩沖液代替一抗作為陰性對照。陽性產物為棕黃色或棕褐色，背景為藍色。
1.3.3 qRT-PCR檢測YAP mRNA表達
取損傷心臟組織（每只大鼠心臟血管旁組織取3處），使用Trizol法提取總mRNA[8, 9]，逆轉錄反應條件的設置：25℃10 min，42℃ 50 min，85℃ 5 min；熒光定量PCR擴增條件的設置：94℃ 4 min；94℃ 20 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，循環35次，72℃檢測信號。YAP mRNA相對表達量以2（?ΔΔCt）計算。目的基因序列見表 1。
表1
目的基因序列
1.3.4 蛋白質印跡法檢測YAP蛋白表達水平
取心臟左前降支支配區域組織剪切成細小碎片；每 100 mg組織加入1 mL蛋白裂解液。用玻璃勻漿器勻漿；離心，取上清，蛋白濃度測定、十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳、封閉、孵育一抗（鼠抗 1︰1 000）、孵育二抗（兔抗鼠1︰5 000）、化學發光，顯影，定影。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）為內參。
1.4 統計學方法
采用SPSS 17.0軟件進行統計。計量數據均以均數±標準差表示，組間比較采用方差分析。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 生物信息學篩選心肌缺血再灌注信號通路
本研究共篩選到在大鼠心肌缺血再灌注2 d表達差異基因共345條，其中上調181條，下調164條；經FLINK分析出這些差異基因主要集中在代謝、免疫系統、信號傳導等生物學過程，每一個生物學過程至少包括15個基因。經KOBAS2.0分析出信號通路，其中HIPPO信號通路中富集達10條差異基因。見表 2。
表2
大鼠心肌缺血再灌注信號通路與主要生物學行為
2.2 基于KEGG通路圖篩選心肌缺血再灌注篩選關鍵基因
YAP、Mst1/2等為HIPPO通路的關鍵因子，且YAP為轉錄因子與TAZ結合后發生轉核，進一步促進下游基因的表達（圖 1）。本課題組選擇YAP進行下一步驗證。
圖1
KEGG 數據庫中顯示的HIPPO 信號通路圖
2.3 YAP蛋白在心肌缺血再灌注組織中的定位表達情況
大鼠缺血再灌注組織心肌細胞陽性表現為棕黃色或棕褐色，并呈顆粒狀，背景呈藍色。YAP蛋白主要在心肌細胞細胞質中表達，在模型組中較正常組和假手術組表達增多。見圖 2。
圖2
大鼠心肌缺血再灌注后YAP 蛋白在心肌細胞中的定位表達（免疫組織化學染色×200） 2a. 模型組 2b. 假手術組 2c. 正常組? ?圖 33 大鼠心肌缺血再灌注后YAP mRNA 在心肌中的表達情況? ?圖 4大鼠心肌缺血再灌注后YAP 蛋白在心肌中的定量表達情況 4a. 蛋白質印跡法檢測各組YAP 蛋白表達情況 4b. 各組YAP 蛋白相對表達量的直條圖。* 與假手術組和正常組比較，P＜0.05
2.4 qRT-PCR檢測YAP在心肌缺血再灌注組織中mRNA定量表達情況
心肌缺血再灌注后72 h，與正常組、假手術組相比，qRT-PCR檢測YAP在心肌缺血再灌注組織中mRNA表達較正常組上升至2.5倍（P＜0.05），假手術組與正常組差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖 3。
2.5 蛋白質印跡法檢測YAP蛋白在心肌缺血再灌注組織中的表達情況
YAP蛋白在模型組中的表達量約為正常組的2倍，是假手術組的1.8倍，差異具有統計學意義（P＜0.05）；假手術組與正常組差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖 4。
3 討論
GEO網站是目前最重要的對基因表達數據進行瀏覽、檢索的在線資源。其中GDS數據集對原始基因芯片數據進行了對數化、過濾以及標準化處理，并且GEO網站對每個GDS數據集中提供幾個在線輔助工具，方便研究者對數據的快捷分析。KOBAS 2.0是一個基于KEGG Orthology注釋系統的KOBAS更新版，其目的是運用常用的通路和疾病知識庫，來系統地識別和眾多通路與疾病相關的基因或蛋白質。本研究利用GEO網站大鼠心肌再灌注損傷后基因芯片GDS數據，并使用其在線篩選工具篩選出差異基因345條，并利用FLINK工具分析出心肌缺血再灌注損傷主要的生物學過程，如代謝、免疫系統、信號傳導等。基于差異基因的富集結果顯示其涉及多方面的生物過程，對其機制研究還需進一步細化深入。利用KOBAS2.0在線工具分析預測出所涉及的信號通路，如Wnt、HIPPO、MAPK、Jak-STAT等。
Wnt信號通路是廣泛存在于多細胞真核生物中的一條高度保守的信號通路，在胚胎發育過程中起到重要作用[10]，例如促進神經祖細胞的增殖，抑制其分化。MAPK信號通路與Jak-STAT信號轉導轉導通路存在于大多數細胞內，在將細胞外刺激信號轉導至細胞及其核內，并引起細胞生物學反應（如細胞增殖、分化、轉化及凋亡等）的過程中具有至關重要的作用[11, 12]。目前，HIPPO信號通路一般被認為與腫瘤抑制有關[13]，協同其他機制而控制組織生長。HIPPO信號通路還與組織損傷后的再生有關[14]。有研究報道HIPPO信號通路中的關鍵基因YAP/TAZ在慢性神經損傷中表達升高[15]；Orcholski等[16]發現其參與了阿爾茨海默病疾病過程；Heallen等[17]發現改變大鼠YAP基因將導致大鼠胚胎心臟發育缺陷，證實其與維持心臟的正常形態有關；而Xin等[18]研究發現YAP的過表達與心肌細胞增殖有關。另Schlegelmilch等[19]研究發現YAP與創傷后表皮愈合有關。HIPPO通路是一個保守的通路，在心肌缺血再灌注損傷中未見報道。本研究組發現YAP蛋白在大鼠心肌缺血再灌注中表達上升，但其作用機制有待進一步研究。推測其可能與其控制器官大小、接觸抑制功能所導致心肌重構有關。
通常研究采取的策略是直接驗證所篩選出來的基因，但基因芯片篩選的差異基因多達數百，甚至上千個。現在的觀點認為單一基因的作用有限，而應以信號通路作為模塊化研究。本研究針對信號通路的研究采用的策略是：① 先通過生物信息學篩選出差異基因富集的信號通路；② 通過閱讀文獻選取在心肌缺血再灌注損傷方向研究較少的信號通路進行重點研究，如本研究選取HIPPO信號通路；③ 再通過KEGG通路圖查找到該信號通路的關鍵基因，如本研究HIPPO信號通路中的關鍵基因YAP；④ 對該基因進行分子生物學方法驗證。研究驗證了我們的前期生物信息學技術篩選的信號通路結果，顯示出生物信息學技術篩選的準確性，說明其是一種高效的篩選技術。
