引用本文： 羅昊翔, 顧隆, 冉光鑫, 米樹文. 重組聚合酶鏈反應擴增乙型肝炎病毒跨直接重復序列區DNA片段方法的建立. 華西醫學, 2016, 31(5): 913-915. doi: 10.7507/1002-0179.201600246 復制
乙型肝炎病毒（HBV）基因組為不完全雙鏈環狀DNA，其中在HBV DNA的nt1087-nt2488區域為HBV的C基因和X基因所在區域，且在該區域內包含有HBV核心區基因的啟動子、增強子Ⅱ、前C基因等調控序列，還包含有直接重復序列（DR）1和DR2，該區DNA序列在HBV復制和抗原的表達有不可忽視的作用[1]，但是DR區也是HBV的DNA含有缺口的區域，只有在HBV復制時，該區缺口才會補齊成為共價閉合環狀DNA（cccDNA），然而，HBV的復制是在肝細胞中進行的，所以外周血中的HBV DNA幾乎都不是cccDNA，這給擴增和研究HBV的該段DNA序列帶來了困難[2]。此外，目前使用的重組聚合酶鏈反應（PCR）方法，模板量不好把握，過程繁瑣，本實驗研究主要探討使用優化的重組PCR方法，擴增該段帶有缺口的HBV DNA片段。現報告如下。
1 材料與方法
1.1 材料
HBV“大三陽”即乙型肝炎表面抗原（HBsAg）（+）、乙型肝炎核心抗體（HBcAb）（+）、乙型肝炎e抗原（HBeAg）（+）血清，由黔西南民族職業技術學院醫藥系病原生物學與免疫學實驗室收集保存。
1.2 主要試劑
Tris（美國Bio Bisic Inc公司），乙二胺四乙酸（EDTA）（洛陽化學試劑廠），NP40（美國Sigma公司），Taq酶（上海賽百盛基因技術有限公司），脫氧核糖核苷三磷酸（dNTPs）（上海賽百盛基因技術有限公司），10×PCR Buffer（含鎂離子）（上海賽百盛基因技術有限公司），用Primer5軟件設計引物，由美國 Invitrogen公司合成，引物序列為P1：5’-AGTGTATCATATGCTTTCACTTTCTCGCCAACTTAC-3’（1087-1111），P2：5’-GCCTACAGCCTCCTAGTACAAAGACCTT-3’（1760-1788），P3：5’-GTTAAAGGTCTTTGTACTAGGAGGCTGTAGG-3’（1757-1788），P4：5’-TGGAATTCCAGTAAAGTTTCCCACCTTATGAGT-3’（2462-2488），瓊脂糖 （aMResco）。
1.3 主要儀器
生物安全柜（Labconco ClasslI TYPE A2），PCR儀（Perkin Elmer 9600），電泳儀（DYY-12），凝膠成像系統（Syngene SYDR2/1529），冷凍高速離心機 （Eppenddrof 5804R），高壓蒸汽滅菌器（上海博訊實業有限公司醫療設備廠）。
1.4 血清HBV DNA的提取
分別取HBsAg（+）、HBcAb（+）、HBeAg（+）血清50 μL，HBV DNA提取液（氯化鈉1.229 g，六水合氯化鎂0.457 g，1 mmol/L的Tris-HCl 0.15 g，NP-40 0.75 mL，超純水49.1 mL）25 μL，在0.2 mL EP管中混勻，37℃水浴30 min，室溫1 h，100℃ 10 min， 10 000 r/min離心5 min，取上清液做PCR模板[3]。
1.5 重組PCR擴增HBV跨DR區DNA片段
1.5.1 第1輪PCR反應體系及反應參數
取2只PCR管，分別標記為S1-1和S2-1，分別加入10×PCR Buffer（含鎂離子）5 μL，2.5 mmol/μL dNTPs 1 μL，10 pmol/μL 正義引物1 μL（P1加入S1-1中，P3加入S2-1中），10 pmol/μL 反義引物各1 μL（P2加入S1-1中，P4加入S2-1中），5 U/μL Taq酶0.5 μL，HBV模板10 μL，超純水31.5 μL，總體積50 μL，94℃預變性5 min，94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸50 s，30個循環，終末延伸10 min。1%瓊脂糖凝膠，100 V電壓下電泳30 min，凝膠成像系統觀察并拍照，并在紫外分析儀下切膠純化，按照天根瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒說明書操作。
1.5.2 第2輪PCR反應體系及反應參數
取1只PCR管，標記為S2，分別加入10×PCR Buffer（含鎂離子）5 μL，2.5 mmol/μL dNTPs 1 μL，第1輪反應切膠純化產物S1-1和S2-1各21.5 μL，不加引物， 5 U/μL Taq酶0.5 μL，超純水0.5 μL，總體積50 μL，94℃預變性5 min，94℃變性30 s，56℃退火30 s， 72℃延伸50 s，20個循環，終末延伸10 min。
1.5.3 第3輪PCR反應體系及反應參數
取1只PCR管，標記為S3，分別加入10×PCR Buffer（含鎂離子）5 μL，2.5 mmol/μL dNTPs 1 μL，10 pmol/μL 正義引物P1 1 μL，10 pmol/μL 反義引物P4 1 μL，第2輪反應產物10 μL，5 U/μL Taq酶0.5 μL，超純水31.5 μL， 總體積50 μL，94℃預變性5 min，94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸1.5 min，30個循環，終末延伸10 min，1%瓊脂糖凝膠，100 V電壓下電泳30 min，凝膠成像系統觀察并拍照[4-5]。
2 結果
利用Primer5設計的引物通過分段擴增，兩端補齊，補齊后擴增，成功重組擴增出HBV跨DR區缺口的DNA片段，圖 1為分段擴增的產物，1泳道和2泳道分別為引物P1/P2擴增和引物P3/P4擴增的產物，片段長度分別為701 bp和731 bp，圖 2為重組后產物，片段長度為1 401 bp，與預期擴增片段長度相符，且無非特異擴增現象。見圖 1、2。
圖1
第1 輪PCR 結果 M：Marker；1：引物P1/P2 擴增產物；2：引物P3/P4 擴增產物? ?圖 2第2 輪PCR 結果 M：Marker；1：引物P1/P4 擴增產物
3 討論
HBV的基因結構具有特殊性，為不完全雙鏈環狀DNA，長鏈為負鏈，有固定長度3 200 bp，短鏈為正鏈，長度不固定，其長度為正鏈的50%～100%，兩條鏈的5’端各有250個核苷酸互相配對，構成黏性末端，黏性末端兩側分別有11個核苷酸組成的DR即DR區，分別稱為DR1和DR2，分別起始于nt1824和nt1590，該區域通常不完全閉合，中間有缺口，只有在HBV復制時，在DNA聚合酶的催化下，才補齊缺口稱為cccDNA，但是此區的功能不能忽視，該區是HBV DNA成環和復制的關鍵區，同時在此區還有HBV 的啟動子、增強子、X基因等重要的調控序列[6]，以往擴增該區DNA的方法通常是先提取HBV cccDNA[7]，由于血液中HBV都是不完全環狀DNA，HBV cccDNA只存在于肝細胞中，且在病毒復制時才出現，且量極少，這就給擴增和研究該段DNA的功能帶來了困難。本研究以DR1和DR2中間互補區域為基礎，使用Primer5分別設計兩側引物，使用重組PCR方法，模擬HBV復制時補齊雙鏈的機制，成功重組出HBV跨缺口DNA片段，起始位點為nt1087，終止位點為nt2488，片段長度共計1 401 bp，該區域包含了HBV的EnhancerⅡ、Core promoter、X基因、Pre-C和C基因，建立了擴增該區DNA片段的方法，為以后對該區DNA片段功能的研究打下了基礎，此外，以往的重組PCR方法普遍采用2輪PCR擴增，這種方法擴增出的條帶往往有不特異的現象，模板量不好把握，本研究重組PCR方法使用 3輪PCR擴增，模板量容易把握，且擴增的條帶比較特異，無雜帶，本實驗研究優化了重組PCR擴增的方法。
乙型肝炎病毒（HBV）基因組為不完全雙鏈環狀DNA，其中在HBV DNA的nt1087-nt2488區域為HBV的C基因和X基因所在區域，且在該區域內包含有HBV核心區基因的啟動子、增強子Ⅱ、前C基因等調控序列，還包含有直接重復序列（DR）1和DR2，該區DNA序列在HBV復制和抗原的表達有不可忽視的作用[1]，但是DR區也是HBV的DNA含有缺口的區域，只有在HBV復制時，該區缺口才會補齊成為共價閉合環狀DNA（cccDNA），然而，HBV的復制是在肝細胞中進行的，所以外周血中的HBV DNA幾乎都不是cccDNA，這給擴增和研究HBV的該段DNA序列帶來了困難[2]。此外，目前使用的重組聚合酶鏈反應（PCR）方法，模板量不好把握，過程繁瑣，本實驗研究主要探討使用優化的重組PCR方法，擴增該段帶有缺口的HBV DNA片段。現報告如下。
1 材料與方法
1.1 材料
HBV“大三陽”即乙型肝炎表面抗原（HBsAg）（+）、乙型肝炎核心抗體（HBcAb）（+）、乙型肝炎e抗原（HBeAg）（+）血清，由黔西南民族職業技術學院醫藥系病原生物學與免疫學實驗室收集保存。
1.2 主要試劑
Tris（美國Bio Bisic Inc公司），乙二胺四乙酸（EDTA）（洛陽化學試劑廠），NP40（美國Sigma公司），Taq酶（上海賽百盛基因技術有限公司），脫氧核糖核苷三磷酸（dNTPs）（上海賽百盛基因技術有限公司），10×PCR Buffer（含鎂離子）（上海賽百盛基因技術有限公司），用Primer5軟件設計引物，由美國 Invitrogen公司合成，引物序列為P1：5’-AGTGTATCATATGCTTTCACTTTCTCGCCAACTTAC-3’（1087-1111），P2：5’-GCCTACAGCCTCCTAGTACAAAGACCTT-3’（1760-1788），P3：5’-GTTAAAGGTCTTTGTACTAGGAGGCTGTAGG-3’（1757-1788），P4：5’-TGGAATTCCAGTAAAGTTTCCCACCTTATGAGT-3’（2462-2488），瓊脂糖 （aMResco）。
1.3 主要儀器
生物安全柜（Labconco ClasslI TYPE A2），PCR儀（Perkin Elmer 9600），電泳儀（DYY-12），凝膠成像系統（Syngene SYDR2/1529），冷凍高速離心機 （Eppenddrof 5804R），高壓蒸汽滅菌器（上海博訊實業有限公司醫療設備廠）。
1.4 血清HBV DNA的提取
分別取HBsAg（+）、HBcAb（+）、HBeAg（+）血清50 μL，HBV DNA提取液（氯化鈉1.229 g，六水合氯化鎂0.457 g，1 mmol/L的Tris-HCl 0.15 g，NP-40 0.75 mL，超純水49.1 mL）25 μL，在0.2 mL EP管中混勻，37℃水浴30 min，室溫1 h，100℃ 10 min， 10 000 r/min離心5 min，取上清液做PCR模板[3]。
1.5 重組PCR擴增HBV跨DR區DNA片段
1.5.1 第1輪PCR反應體系及反應參數
取2只PCR管，分別標記為S1-1和S2-1，分別加入10×PCR Buffer（含鎂離子）5 μL，2.5 mmol/μL dNTPs 1 μL，10 pmol/μL 正義引物1 μL（P1加入S1-1中，P3加入S2-1中），10 pmol/μL 反義引物各1 μL（P2加入S1-1中，P4加入S2-1中），5 U/μL Taq酶0.5 μL，HBV模板10 μL，超純水31.5 μL，總體積50 μL，94℃預變性5 min，94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸50 s，30個循環，終末延伸10 min。1%瓊脂糖凝膠，100 V電壓下電泳30 min，凝膠成像系統觀察并拍照，并在紫外分析儀下切膠純化，按照天根瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒說明書操作。
1.5.2 第2輪PCR反應體系及反應參數
取1只PCR管，標記為S2，分別加入10×PCR Buffer（含鎂離子）5 μL，2.5 mmol/μL dNTPs 1 μL，第1輪反應切膠純化產物S1-1和S2-1各21.5 μL，不加引物， 5 U/μL Taq酶0.5 μL，超純水0.5 μL，總體積50 μL，94℃預變性5 min，94℃變性30 s，56℃退火30 s， 72℃延伸50 s，20個循環，終末延伸10 min。
1.5.3 第3輪PCR反應體系及反應參數
取1只PCR管，標記為S3，分別加入10×PCR Buffer（含鎂離子）5 μL，2.5 mmol/μL dNTPs 1 μL，10 pmol/μL 正義引物P1 1 μL，10 pmol/μL 反義引物P4 1 μL，第2輪反應產物10 μL，5 U/μL Taq酶0.5 μL，超純水31.5 μL， 總體積50 μL，94℃預變性5 min，94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸1.5 min，30個循環，終末延伸10 min，1%瓊脂糖凝膠，100 V電壓下電泳30 min，凝膠成像系統觀察并拍照[4-5]。
2 結果
利用Primer5設計的引物通過分段擴增，兩端補齊，補齊后擴增，成功重組擴增出HBV跨DR區缺口的DNA片段，圖 1為分段擴增的產物，1泳道和2泳道分別為引物P1/P2擴增和引物P3/P4擴增的產物，片段長度分別為701 bp和731 bp，圖 2為重組后產物，片段長度為1 401 bp，與預期擴增片段長度相符，且無非特異擴增現象。見圖 1、2。
圖1
第1 輪PCR 結果 M：Marker；1：引物P1/P2 擴增產物；2：引物P3/P4 擴增產物? ?圖 2第2 輪PCR 結果 M：Marker；1：引物P1/P4 擴增產物
3 討論
HBV的基因結構具有特殊性，為不完全雙鏈環狀DNA，長鏈為負鏈，有固定長度3 200 bp，短鏈為正鏈，長度不固定，其長度為正鏈的50%～100%，兩條鏈的5’端各有250個核苷酸互相配對，構成黏性末端，黏性末端兩側分別有11個核苷酸組成的DR即DR區，分別稱為DR1和DR2，分別起始于nt1824和nt1590，該區域通常不完全閉合，中間有缺口，只有在HBV復制時，在DNA聚合酶的催化下，才補齊缺口稱為cccDNA，但是此區的功能不能忽視，該區是HBV DNA成環和復制的關鍵區，同時在此區還有HBV 的啟動子、增強子、X基因等重要的調控序列[6]，以往擴增該區DNA的方法通常是先提取HBV cccDNA[7]，由于血液中HBV都是不完全環狀DNA，HBV cccDNA只存在于肝細胞中，且在病毒復制時才出現，且量極少，這就給擴增和研究該段DNA的功能帶來了困難。本研究以DR1和DR2中間互補區域為基礎，使用Primer5分別設計兩側引物，使用重組PCR方法，模擬HBV復制時補齊雙鏈的機制，成功重組出HBV跨缺口DNA片段，起始位點為nt1087，終止位點為nt2488，片段長度共計1 401 bp，該區域包含了HBV的EnhancerⅡ、Core promoter、X基因、Pre-C和C基因，建立了擴增該區DNA片段的方法，為以后對該區DNA片段功能的研究打下了基礎，此外，以往的重組PCR方法普遍采用2輪PCR擴增，這種方法擴增出的條帶往往有不特異的現象，模板量不好把握，本研究重組PCR方法使用 3輪PCR擴增，模板量容易把握，且擴增的條帶比較特異，無雜帶，本實驗研究優化了重組PCR擴增的方法。
