引用本文： 肖準, 張曜曜, 李靈玲, 李尚為. 兩種濃度玻璃化冷凍液對人卵巢組織的冷凍保護效果比較. 華西醫學, 2016, 31(5): 885-888. doi: 10.7507/1002-0179.201600240 復制
隨著玻璃化冷凍技術的發展，如何構建理想的人卵巢組織玻璃化冷凍體系已成為近年生殖醫學領域研究的熱點課題[1-5]。2006年Chen等[6]首次報道了一種便捷有效的玻璃化冷凍法[直接覆蓋法（DCV）]，應用于小鼠卵巢組織玻璃化冷凍中，取得較好的冷凍保存效果。但DCV玻璃化冷凍技術需要高濃度冷凍保護液，其細胞毒性可能對組織造成損傷。在本研究中，我們將通過降低玻璃化冷凍保護液濃度，探討低濃度玻璃化冷凍保護液應用于DCV中，對人卵巢組織始基卵泡及周圍間質細胞的保存效果。現報告如下。
1 資料與方法
1.1 一般資料
2013 年8月－2014年5月收集9例在我院行婦科手術的患者卵巢組織，患者年齡22 ～ 34歲；其中4例因卵巢巧克力囊腫行囊腫剝除術，3例因卵巢畸胎瘤行囊腫剝除術，2例因子宮惡性腫瘤行附件切除術。收集送病理檢查后剩余的卵巢皮質組織，其中病理學證實卵巢組織有癌細胞轉移者已剔除。本研究涉及的人體標本知情同意書經四川大學倫理委員會專家審核批準。將卵巢組織標本立即置于預冷的含10%胎牛血清的L-15培養液中，室溫下在超凈工作臺內，用眼科剪剔除卵巢組織髓質及壞死組織后，將卵巢組織皮質剪裁成面積約為2 ～ 3 mm2大小，每例患者標本隨機等量分配到低濃度組及高濃度組。
1.2 DCV玻璃化冷凍及復蘇方法
低濃度組和高濃度組均采用Chen等[6]提出的玻璃化冷凍法。將剪裁好的人卵巢組織片室溫下置于平衡液：7.5%（V/V）DMSO+7.5%（V/V）乙二醇中平衡10 min；再轉入冷凍液中，其中低濃度組冷凍保護液為12% DMSO+12%乙二醇+0.5 mol/L蔗糖組成，高濃度組冷凍保護液為15% DMSO+15%乙二醇 +0.5 mol/L蔗糖，均放置2 min。組織經過脫水后，再放入冷凍小管中，將液氮直接傾覆于冷凍管中，封閉冷凍小管后，最后快速將冷凍管投入液氮罐儲存備用。
復蘇時，從液氮中快速取出冷凍管，空氣中晃動10 s，用鑷子將組織塊由冷凍管里取出后，立即浸于37℃預熱的1 mol/L蔗糖液中放置5 min，再將組織依次放入0.5 mol/L蔗糖液、0.25 mol/L蔗糖液中各5 min。最后將卵巢組織在含10%胎牛血清的L-15培養液中漂洗3次后，進行下部分實驗。
1.3 普通光學顯微鏡下卵泡結構觀察
復蘇后的兩組卵巢組織均浸入Bouin固定液中固定24 h，通過常規脫水、二甲苯透明、石蠟包埋，卵巢組織制作成5 μm厚度的切片。間隔10張進行蘇木精-伊紅染色（HE），普通光學顯微鏡下觀察始基卵泡的結構形態。為了避免重復計數，將在細胞中見到核為計算卵泡數量的方法。采用目前最廣泛應用的Gougeon分級標準[7]：①始基卵泡指單層扁平的顆粒細胞或扁平與立方混合的顆粒細胞包繞卵母細胞的卵泡。②形態正常的始基卵泡：卵母細胞呈圓形或橢圓形態，包膜完整，無皺縮，細胞核大而圓；顆粒細胞分布均勻，顆粒細胞與基膜之間連接緊密，基膜完整，卵母細胞和顆粒細胞均未見濃縮核。③形態異常的始基卵泡：卵泡和卵母細胞形態不規則，卵母細胞細胞質內出現大量的空泡，核濃縮；顆粒細胞排列極為紊亂、缺失、塌陷或出現多個核濃縮[7]。分別記錄兩組中所有觀察到的形態正常和異常的始基卵泡。
1.4 始基卵泡及間質凋亡測定
載玻片行防脫片劑3-氨丙基三乙氧硅烷處理，兩組復蘇后的卵巢組織經常規脫水、二甲苯透明、石蠟包埋，按5 μm連續切片，間隔10張進行末端脫氧核苷酸轉移酶介導的缺口末端標記法（TUNEL）凋亡細胞染色。主要實驗室步驟如下：①0.3%過氧化氫溶液封閉內源性過氧化物酶，室溫下作用20 min；②1︰200新鮮稀釋胰蛋白酶，37 ℃消化15 min；③加入TUNEL反應液50 μL，37 ℃作用70 min；④二氨基聯苯胺顯微鏡下控制顯色，細胞核呈棕黃色時終止顯色。
凋亡卵泡及間質的判斷標準：①凋亡陽性始基卵泡：參照Raffaell等[8]所述標準，認為若一個始基卵泡中卵母細胞染色陽性和（或）卵泡周圍超過50%顆粒細胞染色陽性，則記錄為凋亡陽性卵泡。計數TUNEL陽性始基卵泡數量和總始基卵泡數，計數始基卵泡凋亡百分率（凋亡始基卵泡數/總始基卵泡數）。②參照Kim等[9]所述方法，間質凋亡陽性率=染色陽性的間質細胞面積/組織總面積×100%；當評判間質細胞凋亡面積時，用圖像分析軟件半定量測定。
1.5 統計學方法
所用統計學軟件為SPSS 13.0軟件。兩組形態學正常始基卵泡的百分率和凋亡卵泡百分率采用χ2檢驗分析；采用χ2檢驗比較兩組凋亡間質細胞百分率。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 兩組始基卵泡結構比較
經復蘇后，光學顯微鏡下兩組中大部分始基卵泡形態正常，卵母細胞呈圓形或橢圓形態，包膜完整，無皺縮；顆粒細胞分布均勻，基膜完整，卵母細胞和顆粒細胞均未見濃縮核。僅少數始基卵泡出現卵泡和卵母細胞形態不規則，細胞質內出現空泡，核濃縮；或者顆粒細胞排列紊亂、缺失、塌陷等損傷表現，見圖 1。計數兩組正常和異常始基卵泡數量，低濃度組正常始基卵泡139個（80.3%），異常始基卵泡34個（19.7%）；高濃度組中正常始基卵泡132個（78.6%），異常始基卵泡36個（21.4）；兩組始基卵泡結構差異無統計學意義（χ2=0.165，P=0.685）。
圖1
兩組始基卵泡形態比較（HE×400）1a. 低濃度組中正常形態始基卵泡，為橢圓形態，顆粒細胞均勻分布，卵母細胞中未見核濃縮1b. 高濃度組中異常形態始基卵泡，卵泡結構不完整，顆粒細胞和卵母細胞出現核濃縮，細胞排列紊亂圖 2低濃度組和高濃度組凋亡比較（TUNEL法×400）2a. 低濃度組中未發生始基卵泡凋亡，表現為卵泡中卵母細胞和顆粒細胞未見陽性棕色染色2b. 高濃度組中發生始基卵泡凋亡，表現為卵母細胞和卵泡周圍顆粒細胞見陽性棕色染色
2.2 兩組始基卵泡凋亡發生率和間質凋亡陽性率比較
兩組中均有始基卵泡卵母細胞或者卵泡周圍顆粒細胞染色陽性，提示冷凍復蘇誘導始基卵泡凋亡發生，見圖 2。在低濃度組中，始基卵泡凋亡發生率為29.7%（58/195），高濃度組中凋亡始基卵泡發生率為42.1%（69/164），差異有統計學意義（χ2=5.923，P=0.015）。低濃度組中卵巢間質細胞凋亡陽性率為30.2%（162/537），高濃度組中間質細胞凋亡陽性率為41.9%（206/492），差異有統計學意義（χ2=15.306，P＜0.001）。
3 討論
玻璃化冷凍法是近年提出的超快速冷凍方法，同傳統慢速冷凍法相比，操作簡便，節省時間，成本低廉，更重要的是它避免了細胞內冰晶形成，可最大限度減少對細胞損傷，現已開始應用于人卵巢組織冷凍[5, 10]。由于起步較晚，關于人類卵巢組織的玻璃化冷凍的研究資料較少，如何構建理想的玻璃化冷凍體系已成為研究熱點。
構建理想玻璃化冷凍體系中，冷凍載體選用是其中關鍵環節之一。選擇適宜的冷凍載體可以有效地提高降溫速率，使組織能迅速地降溫達到玻璃化狀態，同時又能夠減少冷凍保護劑的用量以減少細胞毒性。目前用于人卵巢組織玻璃化冷凍的載體包括傳統的塑料麥管[11]、電子顯微鏡銅網格[12]、巴氏管直接滴入[13]、固體表面[14]、新型針浸入法（NIV）[15]等，均取得了較好的冷凍效果。Chen等[6]報道了一種直接覆蓋玻璃化方法（DCV），將經過冷凍保護劑平衡處理的卵巢組織放入冷凍小管底部，然后讓液氮直接覆蓋卵巢組織，該方法用于小鼠卵巢組織，其冷凍效果優于其他傳統冷凍方法。在本研究中，將DCV法應用于人卵巢組織，經復蘇后，不同濃度組中大部分始基卵泡形態正常，卵母細胞呈圓形或橢圓形，包膜完整，無皺縮；顆粒細胞分布均勻，基膜完整，卵母細胞和顆粒細胞未見濃縮核，提示DCV法對于人卵巢組織是一種較為理想的玻璃化冷凍方法。
構建玻璃化冷凍體系中，冷凍保護劑選用也是關鍵環節之一。玻璃化冷凍同慢速冷凍相比，為了實現玻璃化狀態，必須提高冷凍保護劑的濃度，但保護劑濃度的增加則同時增加細胞毒性和細胞損傷。理想玻璃化冷凍保護劑的濃度是盡量減少冷凍保護劑細胞毒性同時又能達到玻璃化狀態。在前期研究中，我們課題組在使用NIV法玻璃化冷凍人卵巢組織時，將冷凍劑濃度從目前通常使用的15% DMSO+15%乙二醇+0.5 mol/L蔗糖降低到12% DMSO+12%乙二醇+0.5 mol/L蔗糖，提高了冷凍效果，更好保存了始基卵泡和間質細胞[16]。受此啟發，本研究中，我們將DCV冷凍法中保護劑濃度也從15% DMSO+15%乙二醇+0.5 mol/L蔗糖降低到12% DMSO+12%乙二醇+0.5 mol/L蔗糖，研究發現，高濃度組中凋亡發生率為42.1%（69/164），低濃度組明顯增加（P＜0.05）。對于兩組卵巢間質凋亡陽性率分析，低濃度組中卵巢間質細胞凋亡陽性率為30.2%（162/537），高濃度組中間質細胞凋亡陽性率為41.9%（206/492），差異有統計學意義（P＜0.05）。實驗結果提示，通過適當降低冷凍保護劑的濃度，減少高濃度保護劑的細胞毒性和細胞損傷，提高了人卵巢組織始基卵泡及周圍間質細胞的冷凍保存效果。
總之，在DCV玻璃化冷凍法中，降低冷凍保護劑濃度，能減少高濃度保護劑的細胞毒性和細胞損傷，改善卵巢組織保存效果。這為我們如何構建理想的人卵巢組織玻璃化冷凍體系提供了重要的思路，具有重要臨床應用前景，值得進一步深入探究。
隨著玻璃化冷凍技術的發展，如何構建理想的人卵巢組織玻璃化冷凍體系已成為近年生殖醫學領域研究的熱點課題[1-5]。2006年Chen等[6]首次報道了一種便捷有效的玻璃化冷凍法[直接覆蓋法（DCV）]，應用于小鼠卵巢組織玻璃化冷凍中，取得較好的冷凍保存效果。但DCV玻璃化冷凍技術需要高濃度冷凍保護液，其細胞毒性可能對組織造成損傷。在本研究中，我們將通過降低玻璃化冷凍保護液濃度，探討低濃度玻璃化冷凍保護液應用于DCV中，對人卵巢組織始基卵泡及周圍間質細胞的保存效果。現報告如下。
1 資料與方法
1.1 一般資料
2013 年8月－2014年5月收集9例在我院行婦科手術的患者卵巢組織，患者年齡22 ～ 34歲；其中4例因卵巢巧克力囊腫行囊腫剝除術，3例因卵巢畸胎瘤行囊腫剝除術，2例因子宮惡性腫瘤行附件切除術。收集送病理檢查后剩余的卵巢皮質組織，其中病理學證實卵巢組織有癌細胞轉移者已剔除。本研究涉及的人體標本知情同意書經四川大學倫理委員會專家審核批準。將卵巢組織標本立即置于預冷的含10%胎牛血清的L-15培養液中，室溫下在超凈工作臺內，用眼科剪剔除卵巢組織髓質及壞死組織后，將卵巢組織皮質剪裁成面積約為2 ～ 3 mm2大小，每例患者標本隨機等量分配到低濃度組及高濃度組。
1.2 DCV玻璃化冷凍及復蘇方法
低濃度組和高濃度組均采用Chen等[6]提出的玻璃化冷凍法。將剪裁好的人卵巢組織片室溫下置于平衡液：7.5%（V/V）DMSO+7.5%（V/V）乙二醇中平衡10 min；再轉入冷凍液中，其中低濃度組冷凍保護液為12% DMSO+12%乙二醇+0.5 mol/L蔗糖組成，高濃度組冷凍保護液為15% DMSO+15%乙二醇 +0.5 mol/L蔗糖，均放置2 min。組織經過脫水后，再放入冷凍小管中，將液氮直接傾覆于冷凍管中，封閉冷凍小管后，最后快速將冷凍管投入液氮罐儲存備用。
復蘇時，從液氮中快速取出冷凍管，空氣中晃動10 s，用鑷子將組織塊由冷凍管里取出后，立即浸于37℃預熱的1 mol/L蔗糖液中放置5 min，再將組織依次放入0.5 mol/L蔗糖液、0.25 mol/L蔗糖液中各5 min。最后將卵巢組織在含10%胎牛血清的L-15培養液中漂洗3次后，進行下部分實驗。
1.3 普通光學顯微鏡下卵泡結構觀察
復蘇后的兩組卵巢組織均浸入Bouin固定液中固定24 h，通過常規脫水、二甲苯透明、石蠟包埋，卵巢組織制作成5 μm厚度的切片。間隔10張進行蘇木精-伊紅染色（HE），普通光學顯微鏡下觀察始基卵泡的結構形態。為了避免重復計數，將在細胞中見到核為計算卵泡數量的方法。采用目前最廣泛應用的Gougeon分級標準[7]：①始基卵泡指單層扁平的顆粒細胞或扁平與立方混合的顆粒細胞包繞卵母細胞的卵泡。②形態正常的始基卵泡：卵母細胞呈圓形或橢圓形態，包膜完整，無皺縮，細胞核大而圓；顆粒細胞分布均勻，顆粒細胞與基膜之間連接緊密，基膜完整，卵母細胞和顆粒細胞均未見濃縮核。③形態異常的始基卵泡：卵泡和卵母細胞形態不規則，卵母細胞細胞質內出現大量的空泡，核濃縮；顆粒細胞排列極為紊亂、缺失、塌陷或出現多個核濃縮[7]。分別記錄兩組中所有觀察到的形態正常和異常的始基卵泡。
1.4 始基卵泡及間質凋亡測定
載玻片行防脫片劑3-氨丙基三乙氧硅烷處理，兩組復蘇后的卵巢組織經常規脫水、二甲苯透明、石蠟包埋，按5 μm連續切片，間隔10張進行末端脫氧核苷酸轉移酶介導的缺口末端標記法（TUNEL）凋亡細胞染色。主要實驗室步驟如下：①0.3%過氧化氫溶液封閉內源性過氧化物酶，室溫下作用20 min；②1︰200新鮮稀釋胰蛋白酶，37 ℃消化15 min；③加入TUNEL反應液50 μL，37 ℃作用70 min；④二氨基聯苯胺顯微鏡下控制顯色，細胞核呈棕黃色時終止顯色。
凋亡卵泡及間質的判斷標準：①凋亡陽性始基卵泡：參照Raffaell等[8]所述標準，認為若一個始基卵泡中卵母細胞染色陽性和（或）卵泡周圍超過50%顆粒細胞染色陽性，則記錄為凋亡陽性卵泡。計數TUNEL陽性始基卵泡數量和總始基卵泡數，計數始基卵泡凋亡百分率（凋亡始基卵泡數/總始基卵泡數）。②參照Kim等[9]所述方法，間質凋亡陽性率=染色陽性的間質細胞面積/組織總面積×100%；當評判間質細胞凋亡面積時，用圖像分析軟件半定量測定。
1.5 統計學方法
所用統計學軟件為SPSS 13.0軟件。兩組形態學正常始基卵泡的百分率和凋亡卵泡百分率采用χ2檢驗分析；采用χ2檢驗比較兩組凋亡間質細胞百分率。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 兩組始基卵泡結構比較
經復蘇后，光學顯微鏡下兩組中大部分始基卵泡形態正常，卵母細胞呈圓形或橢圓形態，包膜完整，無皺縮；顆粒細胞分布均勻，基膜完整，卵母細胞和顆粒細胞均未見濃縮核。僅少數始基卵泡出現卵泡和卵母細胞形態不規則，細胞質內出現空泡，核濃縮；或者顆粒細胞排列紊亂、缺失、塌陷等損傷表現，見圖 1。計數兩組正常和異常始基卵泡數量，低濃度組正常始基卵泡139個（80.3%），異常始基卵泡34個（19.7%）；高濃度組中正常始基卵泡132個（78.6%），異常始基卵泡36個（21.4）；兩組始基卵泡結構差異無統計學意義（χ2=0.165，P=0.685）。
圖1
兩組始基卵泡形態比較（HE×400）1a. 低濃度組中正常形態始基卵泡，為橢圓形態，顆粒細胞均勻分布，卵母細胞中未見核濃縮1b. 高濃度組中異常形態始基卵泡，卵泡結構不完整，顆粒細胞和卵母細胞出現核濃縮，細胞排列紊亂圖 2低濃度組和高濃度組凋亡比較（TUNEL法×400）2a. 低濃度組中未發生始基卵泡凋亡，表現為卵泡中卵母細胞和顆粒細胞未見陽性棕色染色2b. 高濃度組中發生始基卵泡凋亡，表現為卵母細胞和卵泡周圍顆粒細胞見陽性棕色染色
2.2 兩組始基卵泡凋亡發生率和間質凋亡陽性率比較
兩組中均有始基卵泡卵母細胞或者卵泡周圍顆粒細胞染色陽性，提示冷凍復蘇誘導始基卵泡凋亡發生，見圖 2。在低濃度組中，始基卵泡凋亡發生率為29.7%（58/195），高濃度組中凋亡始基卵泡發生率為42.1%（69/164），差異有統計學意義（χ2=5.923，P=0.015）。低濃度組中卵巢間質細胞凋亡陽性率為30.2%（162/537），高濃度組中間質細胞凋亡陽性率為41.9%（206/492），差異有統計學意義（χ2=15.306，P＜0.001）。
3 討論
玻璃化冷凍法是近年提出的超快速冷凍方法，同傳統慢速冷凍法相比，操作簡便，節省時間，成本低廉，更重要的是它避免了細胞內冰晶形成，可最大限度減少對細胞損傷，現已開始應用于人卵巢組織冷凍[5, 10]。由于起步較晚，關于人類卵巢組織的玻璃化冷凍的研究資料較少，如何構建理想的玻璃化冷凍體系已成為研究熱點。
構建理想玻璃化冷凍體系中，冷凍載體選用是其中關鍵環節之一。選擇適宜的冷凍載體可以有效地提高降溫速率，使組織能迅速地降溫達到玻璃化狀態，同時又能夠減少冷凍保護劑的用量以減少細胞毒性。目前用于人卵巢組織玻璃化冷凍的載體包括傳統的塑料麥管[11]、電子顯微鏡銅網格[12]、巴氏管直接滴入[13]、固體表面[14]、新型針浸入法（NIV）[15]等，均取得了較好的冷凍效果。Chen等[6]報道了一種直接覆蓋玻璃化方法（DCV），將經過冷凍保護劑平衡處理的卵巢組織放入冷凍小管底部，然后讓液氮直接覆蓋卵巢組織，該方法用于小鼠卵巢組織，其冷凍效果優于其他傳統冷凍方法。在本研究中，將DCV法應用于人卵巢組織，經復蘇后，不同濃度組中大部分始基卵泡形態正常，卵母細胞呈圓形或橢圓形，包膜完整，無皺縮；顆粒細胞分布均勻，基膜完整，卵母細胞和顆粒細胞未見濃縮核，提示DCV法對于人卵巢組織是一種較為理想的玻璃化冷凍方法。
構建玻璃化冷凍體系中，冷凍保護劑選用也是關鍵環節之一。玻璃化冷凍同慢速冷凍相比，為了實現玻璃化狀態，必須提高冷凍保護劑的濃度，但保護劑濃度的增加則同時增加細胞毒性和細胞損傷。理想玻璃化冷凍保護劑的濃度是盡量減少冷凍保護劑細胞毒性同時又能達到玻璃化狀態。在前期研究中，我們課題組在使用NIV法玻璃化冷凍人卵巢組織時，將冷凍劑濃度從目前通常使用的15% DMSO+15%乙二醇+0.5 mol/L蔗糖降低到12% DMSO+12%乙二醇+0.5 mol/L蔗糖，提高了冷凍效果，更好保存了始基卵泡和間質細胞[16]。受此啟發，本研究中，我們將DCV冷凍法中保護劑濃度也從15% DMSO+15%乙二醇+0.5 mol/L蔗糖降低到12% DMSO+12%乙二醇+0.5 mol/L蔗糖，研究發現，高濃度組中凋亡發生率為42.1%（69/164），低濃度組明顯增加（P＜0.05）。對于兩組卵巢間質凋亡陽性率分析，低濃度組中卵巢間質細胞凋亡陽性率為30.2%（162/537），高濃度組中間質細胞凋亡陽性率為41.9%（206/492），差異有統計學意義（P＜0.05）。實驗結果提示，通過適當降低冷凍保護劑的濃度，減少高濃度保護劑的細胞毒性和細胞損傷，提高了人卵巢組織始基卵泡及周圍間質細胞的冷凍保存效果。
總之，在DCV玻璃化冷凍法中，降低冷凍保護劑濃度，能減少高濃度保護劑的細胞毒性和細胞損傷，改善卵巢組織保存效果。這為我們如何構建理想的人卵巢組織玻璃化冷凍體系提供了重要的思路，具有重要臨床應用前景，值得進一步深入探究。
