引用本文： 吳侗, 周彬, 龍麗, 張晶. 血小板生成素及其抗體與原發性干燥綜合征患者血小板減少的相關性研究. 華西醫學, 2016, 31(5): 871-874. doi: 10.7507/1002-0179.201600237 復制
原發性干燥綜合征（PSS）是一種以外分泌腺淋巴細胞高度浸潤的自身免疫性疾病。PSS常常被關注口眼干燥、腎臟受損等癥狀，隨著醫學研究的進步，人們對該病的認識逐漸加深，發現其對非外分泌腺組織也可造成嚴重損害，其中血液系統損害較為常見，發病率約28.7%～71.7%[1-6]。目前針對PSS器官損害的研究不多，對其造成的血液系統損害研究更加缺乏。PSS血液系統損害的常見表現包括血小板減少，可單獨出現也可合并貧血和白細胞減少出現，國內任立敏等[7]調查PSS血小板減少發生率約13% ～ 20%。血小板生成素（TPO）是一種主要由肝臟細胞生成的糖蛋白，它通過與造血干/祖細胞和巨核細胞膜表面的其受體（c-mpl）結合，促進巨核細胞成熟分化釋放血小板。PSS的發病機制與大量自身免疫抗體生成相關，本研究旨在探討TPO及其抗體與PSS患者血小板減少之間的相關性和臨床意義。現報告如下。
1 資料與方法
1.1 一般資料
選取我院風濕免疫科2013年9月－2014年10月間住院的PSS患者共計102例，均符合2002年PSS國際分類（診斷）標準[8]。其中血小板減少[血小板計數（PLT）＜100×109/L]的PSS患者40例（A組），既往曾有血小板減少現已恢復正常的PSS患者22例（B組），無血小板減少的PSS患者40例（C組），以及同期正常體檢的健康志愿者（PLT正常并且無風濕免疫病和血液病病史）40例（D組）。A組男4例，女36例；年齡22 ～ 78歲，平均（55.64±14.98）歲。B組男1例，女21例；年齡24 ～ 76歲，平均（53.75±12.11）歲。C組男3例，女37例；年齡19 ～ 74歲，平均（58.28±16.11）歲。D組男4例，女36例；年齡19 ～ 69歲，平均（50.47±12.76）歲。4組年齡、性別構成差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。
1.2 TPO及其抗體水平檢測
采集所有受試者清晨空腹靜脈血3 mL，分離血清，?80℃保存。酶聯免疫吸附法（ELISA）檢測血清TPO水平，具體步驟按照試劑盒（美國R&D System公司）說明書進行。間接ELISA法測定抗TPO抗體水平，具體步驟為：用重組人TPO（美國R&D System公司）以4 mg/L濃度包被96孔 ELISA板（美國Costar公司），4℃過夜，磷酸鹽吐溫緩沖液[2% tween，歐蒙醫學診斷（中國）有限公司]洗滌后用0.05 g/L小牛血清蛋白（美國Sigma公司）封閉非特異位點，37℃孵育1 h，洗滌后每孔加待測血清（1∶200）100 μL，洗滌后加1∶5 000稀釋的辣根過氧化物酶標記的羊抗人IgG（北京中杉金橋公司）100 μL/孔，再次洗滌后每孔加入四甲基聯苯胺使用液（北京紐樸生物技術有限公司）100 μL，37℃孵育20 min，用2 mol/L稀硫酸終止反應，最后用酶標儀測定450/570 nm吸光度[A，舊稱光密度（OD）]值，以A值大于健康對照平均值2.1倍（源自廠家說明書及統計學截斷值確定方法）以上者為陽性。
1.3 臨床指標檢測
所有PSS患者均測定PLT、紅細胞沉降率（ESR）、C反應蛋白（CRP）、免疫球蛋白A（IgA）、補體C4、抗核抗體（ANA）、抗磷脂抗體（APL）等，其中ANA滴度＞1∶320為ANA陽性。
1.4 統計學方法
運用SPSS 19.0軟件進行統計分析。計量資料正態分布者用均數±標準差表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間進行LSD檢驗；兩組間比較采用t檢驗；非正態分布者采用非參數檢驗（Mann-Whitney秩和檢驗）。計數資料采用χ2檢驗。相關性分析，正態分布資料使用Pearson檢驗，非正態分布資料使用Spearman檢驗和χ2檢驗。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 TPO水平
A、B、C、D組血清TPO水平分別為（129.74±17.47）、（330.23±18.07）、（364.19±12.25）、（54.04±10.71）pg/mL，4組組間差異有統計學意義（F=14.483，P＜0.001），其中A、B、C 3組與D組組間差異有統計學意義（P＜0.001），A、B、C組間兩兩比較差異無統計學意義（P＞0.05）。
2.2 抗TPO抗體
PSS患者抗TPO抗體檢出率為20.59%（21/102），明顯高于正常對照組（0/40）。抗TPO抗體陽性率在A、B、C組分別為17.5%（7/40）、22.72%（5/22）、22.5%（9/40），兩兩組間比較差異無統計學意義（χ2=0.248，P=0.618；χ2=0.313，P=0.576；χ2＜0.001，P=0.984）。
2.3 TPO水平與臨床指標間關系
PSS患者TPO水平明顯與C反應蛋白、IgA水平呈正相關，而與補體C4水平呈負相關，而與PLT、ESR、抗磷脂抗體水平以及ANA滴度無相關性。見表 1。
表1
TPO水平與臨床指標相關性
2.4 抗TPO抗體與臨床指標間關系
比較抗TPO抗體陽性組與陰性組PSS患者PLT、ESR、CRP、IgA、補體C4以及ANA滴度、抗磷脂抗體APL水平等臨床指標，結果顯示差異均無統計學意義（P＞0.05）。見表 2。
表2
抗TPO抗體與臨床指標間關系
3 討論
TPO是骨髓巨核細胞增殖、成熟和血小板生成調控的主要因子，又稱巨核細胞生長發育因子[9]。TPO對血小板生成具有舉足輕重的作用，其濃度的增加以及和其配體c-Mpl形成的信號傳導通路對血小板生成具有特異性促進作用[10]。目前研究發現系統性紅斑狼瘡血小板減少患者體內存在抗TPO抗體和抗c-Mpl抗體[11-12]。抗TPO抗體通過與TPO結合直接影響TPO在患者體內濃度和功能作用。Vadhan-Raj等[13]2000年首次報道發現抗TPO抗體，華寶來[14]等在接受TPO治療的患者血液中發現并且再次證實該抗體與血小板計數減少相關。2002年，Füreder等[15]首次應用酶聯免疫法（EIA）檢測到系統性紅斑狼瘡（SLE）患者血清中存在抗TPO抗體，他們提出抗TPO抗體與SLE血小板減少具有相關性。2006年，Ziakas等[16]應用改良后的ELISA再次檢測到SLE患者血清中存在抗TPO抗體。2008年，Ziakas等[17]分別將抗TPO抗體陽性和陰性的血清加入巨核細胞后，進行體外培養，結果提示抗TPO抗體陽性組巨核細胞集落生長發育明顯受抑制，提示該抗體可能有抑制巨核細胞生長發育的作用。但是在PSS患者中Ziakas等[17]未發現抗TPO抗體是否存在相同的作用。
本研究顯示，PSS患者TPO水平明顯高于健康對照人群，提示在PSS患者中TPO可能與病情有一定相關性。但同時我們也發現TPO水平在血小板減少和血小板已恢復以及血小板正常的PSS患者間無明顯差異，非且與血小板計數不相關，這與我們之前發現TPO濃度明顯升高患者血小板計數無顯著下降的觀點一致[18]。本研究提示PSS患者的TPO濃度與循環中血小板計數不成因果關系，TPO可能受其他細胞因子調控。本研究發現與C反應蛋白和IgA水平具有正相關，而與補體C4水平呈負相關，提示TPO水平可能與炎癥因子及病情嚴重程度呈一定相關性。最近的研究已表明SLE患者的TPO水平不與血栓癥和血小板減少相關，而與巨噬細胞炎癥蛋白-1α、白細胞介素（IL）-4、IL-6等炎癥因子水平相關[19]。本研究顯示抗TPO抗體陽性率約20.59%，但其陽性率在PSS血小板減少組、血小板曾減少已恢復組和無血小板減少組無明顯差異，同時比較抗TPO抗體陽性組與陰性組PSS患者PLT、ESR、CRP、IgA、補體C4以及ANA滴度、抗磷脂抗體APL水平等臨床指標，結果顯示差異均無統計學意義（P＞0.05）。結果提示雖然抗TPO能夠中和TPO降低循環中TPO濃度，但此抗體不是PSS血小板減少的重要原因。目前部分研究顯示PSS患者血小板減少與骨髓巨核細胞成熟障礙相關[18]，因此TPO/c-Mpl信號傳導通路的功能失常可能是PSS血小板減少的致病機制。
綜上所述，本研究對PSS相關血小板減少與TPO及其抗體之間相關性進行了初步的探討，TPO濃度與炎癥因子有一些定相關性，而抗TPO抗體可能不是PSS血小板減少的主要發病機制。但樣本量較少，同時抗體的檢測方法、特異性與TPO濃度的的關系及其作用機制，還有待進一步研究。
原發性干燥綜合征（PSS）是一種以外分泌腺淋巴細胞高度浸潤的自身免疫性疾病。PSS常常被關注口眼干燥、腎臟受損等癥狀，隨著醫學研究的進步，人們對該病的認識逐漸加深，發現其對非外分泌腺組織也可造成嚴重損害，其中血液系統損害較為常見，發病率約28.7%～71.7%[1-6]。目前針對PSS器官損害的研究不多，對其造成的血液系統損害研究更加缺乏。PSS血液系統損害的常見表現包括血小板減少，可單獨出現也可合并貧血和白細胞減少出現，國內任立敏等[7]調查PSS血小板減少發生率約13% ～ 20%。血小板生成素（TPO）是一種主要由肝臟細胞生成的糖蛋白，它通過與造血干/祖細胞和巨核細胞膜表面的其受體（c-mpl）結合，促進巨核細胞成熟分化釋放血小板。PSS的發病機制與大量自身免疫抗體生成相關，本研究旨在探討TPO及其抗體與PSS患者血小板減少之間的相關性和臨床意義。現報告如下。
1 資料與方法
1.1 一般資料
選取我院風濕免疫科2013年9月－2014年10月間住院的PSS患者共計102例，均符合2002年PSS國際分類（診斷）標準[8]。其中血小板減少[血小板計數（PLT）＜100×109/L]的PSS患者40例（A組），既往曾有血小板減少現已恢復正常的PSS患者22例（B組），無血小板減少的PSS患者40例（C組），以及同期正常體檢的健康志愿者（PLT正常并且無風濕免疫病和血液病病史）40例（D組）。A組男4例，女36例；年齡22 ～ 78歲，平均（55.64±14.98）歲。B組男1例，女21例；年齡24 ～ 76歲，平均（53.75±12.11）歲。C組男3例，女37例；年齡19 ～ 74歲，平均（58.28±16.11）歲。D組男4例，女36例；年齡19 ～ 69歲，平均（50.47±12.76）歲。4組年齡、性別構成差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。
1.2 TPO及其抗體水平檢測
采集所有受試者清晨空腹靜脈血3 mL，分離血清，?80℃保存。酶聯免疫吸附法（ELISA）檢測血清TPO水平，具體步驟按照試劑盒（美國R&D System公司）說明書進行。間接ELISA法測定抗TPO抗體水平，具體步驟為：用重組人TPO（美國R&D System公司）以4 mg/L濃度包被96孔 ELISA板（美國Costar公司），4℃過夜，磷酸鹽吐溫緩沖液[2% tween，歐蒙醫學診斷（中國）有限公司]洗滌后用0.05 g/L小牛血清蛋白（美國Sigma公司）封閉非特異位點，37℃孵育1 h，洗滌后每孔加待測血清（1∶200）100 μL，洗滌后加1∶5 000稀釋的辣根過氧化物酶標記的羊抗人IgG（北京中杉金橋公司）100 μL/孔，再次洗滌后每孔加入四甲基聯苯胺使用液（北京紐樸生物技術有限公司）100 μL，37℃孵育20 min，用2 mol/L稀硫酸終止反應，最后用酶標儀測定450/570 nm吸光度[A，舊稱光密度（OD）]值，以A值大于健康對照平均值2.1倍（源自廠家說明書及統計學截斷值確定方法）以上者為陽性。
1.3 臨床指標檢測
所有PSS患者均測定PLT、紅細胞沉降率（ESR）、C反應蛋白（CRP）、免疫球蛋白A（IgA）、補體C4、抗核抗體（ANA）、抗磷脂抗體（APL）等，其中ANA滴度＞1∶320為ANA陽性。
1.4 統計學方法
運用SPSS 19.0軟件進行統計分析。計量資料正態分布者用均數±標準差表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間進行LSD檢驗；兩組間比較采用t檢驗；非正態分布者采用非參數檢驗（Mann-Whitney秩和檢驗）。計數資料采用χ2檢驗。相關性分析，正態分布資料使用Pearson檢驗，非正態分布資料使用Spearman檢驗和χ2檢驗。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 TPO水平
A、B、C、D組血清TPO水平分別為（129.74±17.47）、（330.23±18.07）、（364.19±12.25）、（54.04±10.71）pg/mL，4組組間差異有統計學意義（F=14.483，P＜0.001），其中A、B、C 3組與D組組間差異有統計學意義（P＜0.001），A、B、C組間兩兩比較差異無統計學意義（P＞0.05）。
2.2 抗TPO抗體
PSS患者抗TPO抗體檢出率為20.59%（21/102），明顯高于正常對照組（0/40）。抗TPO抗體陽性率在A、B、C組分別為17.5%（7/40）、22.72%（5/22）、22.5%（9/40），兩兩組間比較差異無統計學意義（χ2=0.248，P=0.618；χ2=0.313，P=0.576；χ2＜0.001，P=0.984）。
2.3 TPO水平與臨床指標間關系
PSS患者TPO水平明顯與C反應蛋白、IgA水平呈正相關，而與補體C4水平呈負相關，而與PLT、ESR、抗磷脂抗體水平以及ANA滴度無相關性。見表 1。
表1
TPO水平與臨床指標相關性
2.4 抗TPO抗體與臨床指標間關系
比較抗TPO抗體陽性組與陰性組PSS患者PLT、ESR、CRP、IgA、補體C4以及ANA滴度、抗磷脂抗體APL水平等臨床指標，結果顯示差異均無統計學意義（P＞0.05）。見表 2。
表2
抗TPO抗體與臨床指標間關系
3 討論
TPO是骨髓巨核細胞增殖、成熟和血小板生成調控的主要因子，又稱巨核細胞生長發育因子[9]。TPO對血小板生成具有舉足輕重的作用，其濃度的增加以及和其配體c-Mpl形成的信號傳導通路對血小板生成具有特異性促進作用[10]。目前研究發現系統性紅斑狼瘡血小板減少患者體內存在抗TPO抗體和抗c-Mpl抗體[11-12]。抗TPO抗體通過與TPO結合直接影響TPO在患者體內濃度和功能作用。Vadhan-Raj等[13]2000年首次報道發現抗TPO抗體，華寶來[14]等在接受TPO治療的患者血液中發現并且再次證實該抗體與血小板計數減少相關。2002年，Füreder等[15]首次應用酶聯免疫法（EIA）檢測到系統性紅斑狼瘡（SLE）患者血清中存在抗TPO抗體，他們提出抗TPO抗體與SLE血小板減少具有相關性。2006年，Ziakas等[16]應用改良后的ELISA再次檢測到SLE患者血清中存在抗TPO抗體。2008年，Ziakas等[17]分別將抗TPO抗體陽性和陰性的血清加入巨核細胞后，進行體外培養，結果提示抗TPO抗體陽性組巨核細胞集落生長發育明顯受抑制，提示該抗體可能有抑制巨核細胞生長發育的作用。但是在PSS患者中Ziakas等[17]未發現抗TPO抗體是否存在相同的作用。
本研究顯示，PSS患者TPO水平明顯高于健康對照人群，提示在PSS患者中TPO可能與病情有一定相關性。但同時我們也發現TPO水平在血小板減少和血小板已恢復以及血小板正常的PSS患者間無明顯差異，非且與血小板計數不相關，這與我們之前發現TPO濃度明顯升高患者血小板計數無顯著下降的觀點一致[18]。本研究提示PSS患者的TPO濃度與循環中血小板計數不成因果關系，TPO可能受其他細胞因子調控。本研究發現與C反應蛋白和IgA水平具有正相關，而與補體C4水平呈負相關，提示TPO水平可能與炎癥因子及病情嚴重程度呈一定相關性。最近的研究已表明SLE患者的TPO水平不與血栓癥和血小板減少相關，而與巨噬細胞炎癥蛋白-1α、白細胞介素（IL）-4、IL-6等炎癥因子水平相關[19]。本研究顯示抗TPO抗體陽性率約20.59%，但其陽性率在PSS血小板減少組、血小板曾減少已恢復組和無血小板減少組無明顯差異，同時比較抗TPO抗體陽性組與陰性組PSS患者PLT、ESR、CRP、IgA、補體C4以及ANA滴度、抗磷脂抗體APL水平等臨床指標，結果顯示差異均無統計學意義（P＞0.05）。結果提示雖然抗TPO能夠中和TPO降低循環中TPO濃度，但此抗體不是PSS血小板減少的重要原因。目前部分研究顯示PSS患者血小板減少與骨髓巨核細胞成熟障礙相關[18]，因此TPO/c-Mpl信號傳導通路的功能失常可能是PSS血小板減少的致病機制。
綜上所述，本研究對PSS相關血小板減少與TPO及其抗體之間相關性進行了初步的探討，TPO濃度與炎癥因子有一些定相關性，而抗TPO抗體可能不是PSS血小板減少的主要發病機制。但樣本量較少，同時抗體的檢測方法、特異性與TPO濃度的的關系及其作用機制，還有待進一步研究。
