引用本文： 朱力陽, 馬建, 涂禾, 向猛, 王銳. 二黃凝膠貼膏與軟膏的體外釋放及透皮性能比較. 華西醫學, 2016, 31(4): 724-727. doi: 10.7507/1002-0179.201600196 復制
二黃凝膠貼膏原為軟膏劑，由獨活、羌活、大黃、黃柏、赤芍、川木香、大血藤等中藥組成，作為我院的醫院制劑（批準文號：川藥制字Z20080855）治療閉合性軟組織損傷所致的紅腫灼熱疼痛等病癥療效顯著，但軟膏劑含有海藻酸鈉等海產品，在使用過程中容易導致皮膚過敏，且需要涂抹在泡沫貼上使用，而泡沫貼也含有易致過敏的粘膠。因此，我們將二黃軟膏的藥物特點與新的制劑技術結合，開發了二黃凝膠貼膏[1]。并采用改良的豎式Franz擴散池及Strat-M膜，對制劑進行體外釋放度試驗及透皮試驗[2]，檢測接收液中主藥獨活的主要成分蛇床子素含量，從而比較新老兩種制劑的體外釋放及透皮性能。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 儀器
美國沃特世1525液相色譜，包括2487紫外檢測器、Empower Ⅲ色譜工作站及2707自動進樣器；TT-6D透皮擴散儀（天津市正通科技有限公司）；PL202-L電子天平、XS105分析天平（均為 Mettler Toledo公司）；AYJ1-0501-U純水機（重慶市頤科公司）。
1.1.2 藥品與試劑
蛇床子素對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：110822-201308）；二黃凝膠貼膏（自制，批號：20141110）；二黃軟膏（四川省骨科醫院生產，批號：150330）；Strat-M膜（美國Merck Millipore公司，批號：K4BA1004）；甲醇（色譜純，FISHER公司，批號：144282）；乙腈（色譜純，FISHER公司，批號：138939）。
1.2 方法
1.2.1 二黃凝膠貼膏制備工藝
將卡波姆941加入水中溶解，再將酒石酸加入水中，最后將甘羥鋁加入水中，以上為Ⅰ相；向甘油中加入部分中和的聚丙烯酸鈉（NP700），混合均勻，此為Ⅱ相；中藥材采用乙醇提取，并濃縮成浸膏，加入Ⅱ相中，再將Ⅰ、Ⅱ相混合，攪拌后滴入三乙醇胺調節pH值至中性，攪拌均勻，涂布，蓋上PP膜，靜置后包裝并保存。另稱取不含獨活的處方藥物按上述方法制成陰性二黃凝膠貼膏樣品。
1.2.2 含量測定
① 色譜條件與系統適用性試驗。色譜柱：Waters Symmetry Shield RP18，4.6 mm×250.0 mm，5 μm；流動相為甲醇-水（71 :29）；檢測波長為322 nm，流速為1.0 mL/min。理論板數按蛇床子素峰計算應不低于6 000。
② 對照品溶液配制及標準曲線制備。精密稱取干燥至恒定質量的蛇床子素對照品適量至容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得質量濃度為13.3 μg/mL的儲備液。分別精密量取該儲備液0.05、0.1、0.4、1.6、6.4、25 mL至100 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，進樣，記錄峰面積。以峰面積（y）為縱坐標，以蛇床子素進樣量（x）為橫坐標，繪制標準曲線，計算回歸方程。
③ 供試品溶液及陰性樣品溶液的制備。取250 mL圓底燒瓶，精密稱量40 g凝膠貼膏，加入圓底燒瓶中，再向其中加入乙醇50 mL，稱定重量，熱回流提取60 min，冷卻后用乙醇補足減失的重量，吸取提取液，用直徑0.45 μm濾膜過濾，取續濾液，得供試品溶液。取陰性二黃凝膠貼膏同法制得陰性樣品溶液。
④ 專屬性實驗。將對照品、供試品和陰性樣品溶液分別進樣，測定。
⑤ 精密度實驗。精密吸取以上“②”項下的對照品儲備液20 μL，連續進樣6次，以蛇床子素的峰面積計算相對標準偏差（RSD）。
⑥ 重復性實驗。按 “③”項下方法制備6份供試品溶液，進樣，以蛇床子素含量計算RSD。
⑦ 穩定性實驗。按“③”項下方法制備供試品溶液后于0、1、2、4、6、12、24、48 h進樣并以蛇床子素的峰面積計算RSD。
⑧ 加樣回收率實驗。配制質量濃度為0.18 mg/mL的對照品溶液。取20 g凝膠貼膏，精密稱定，加入上述對照品溶液2.5 mL后，照“③”項下方法制備供試品溶液，進樣，以蛇床子素含量計算RSD。
1.2.3 體外釋放度實驗
以30%乙醇的生理鹽水溶液為接收介質，預溫至（37.0±0.1）℃，將貼膏固定于豎式擴散池擴散室與接收室之間，釋放面向下，在貼膏下方放入孔徑0.8 μm的濾膜，將釋放介質加至刻度線，設置攪拌轉速為600 r/min，分別于1、2、4、6、8、12、24、48 h取出2 mL釋放液，并立即補充等量的空白釋放介質，0.45 μm濾膜過濾，進樣測定，按下式計算累積釋放度（%）：
Ln’為累積釋放度，Cn’為第n個時間點樣品的濃度，V為接收池體積，Ci’為第i個時間點樣品的濃度，V0為每次取樣的體積，W為凝膠貼膏樣品中蛇床子素的含量。軟膏劑實驗方法與凝膠貼膏相同。
1.2.4 體外透皮實驗
試驗采用改良的豎式Franz擴散池，將制備好的貼膏去掉防粘層，緊密貼于處理好的Strat-M膜上，排除貼膏與膜之間的氣泡，然后固定于擴散池的擴散室和接收室之間，貼膏藥物面朝向接收室，在接收室中放入磁力攪拌子，加入30%乙醇的生理鹽水溶液作為接收液至刻度線，排除氣泡。磁力攪拌轉速設定為600 r/min，水浴溫度（37.0±0.1）℃。在設定的時間點1、2、4、6、8、12、24、48 h分別取樣接收液2 mL，同時立即補加同樣體積的空白接收液。將接收液用0.45 μm濾膜過濾，進樣測定，按下式計算計算累積透皮量（mg）、累積透皮率（%）：
Ln=Qn/W×100
Qn為累積透皮量，Cn為第n個時間點樣品的濃度，V為接收池體積，Ci為第i個時間點樣品的濃度，V0為每次取樣的體積，Ln為累積透皮率，W為凝膠貼膏樣品中蛇床子素的含量。軟膏劑實驗方法與凝膠貼膏相同。
1.3 統計學方法
采用SPSS 17.0統計學軟件，應用t檢驗分析比較凝膠貼膏與軟膏的差異。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 標準曲線及線性關系
根據各時間點測得的結果，得回歸方程為y=83080.1x-1 312，相關系數r=0.999 9，表明蛇床子素進樣量在1.3×10-4～0.266 μg范圍內與峰面積呈良好線性關系。
2.2 專屬性實驗
由圖 1可知，供試品中蛇床子素峰形良好，且專屬性好。
圖1
HPLC圖 a.蛇床子素對照品 b.二黃凝膠貼膏 c.陰性二黃凝膠貼膏
2.3 精密度實驗
RSD值為0.90%，表明在此條件下儀器精密度良好。
2.4 重復性實驗
蛇床子素的平均含量為0.038 3 mg/g，RSD值為1.52%，表明樣品重復性良好。
2.5 穩定性實驗
測得蛇床子素峰面積的RSD值為2.001%，表明樣品在48 h內穩定。
2.6 加樣回收率實驗
蛇床子素的平均回收率為100.89%，RSD為2.38%，表明本方法加樣回收率能滿足要求。
2.7 體外釋放度實驗
以累計釋放度Ln’對時間t作圖，得凝膠貼膏回歸方程為：Ln’=9.429 6t-12.947，r=0.982 1，軟膏劑回歸方程為：Ln’=11.263t-9.723 2，r=0.991 1。見表 1。
表1
累積釋放度結果（n=6，2.8 體外透皮實驗
通過SPSS 17.0軟件進行t檢驗，根據表 2、3可知，凝膠貼膏與軟膏劑兩者每個時間點的累積透皮量和累積透皮率相比較，差異有統計學意義（P＜0.01）。以透皮率Ln對時間t對作圖，凝膠貼膏的透皮曲線方程為Ln=0.443 6t+1.350 9，r=0.964 4，軟膏劑的透皮曲線方程為Ln=0.205 1t-0.244 7，r=0.995 6。
表2
累積透皮量結果（n=6，
表3
累積透皮率結果（n=6，3 討論
不論以透皮量還是透皮率考察，二黃凝膠貼膏的透皮性能均優于二黃軟膏，且凝膠貼膏透氣性好、致敏率低、使用方便，從已經開展的初步臨床觀察來看，受到患者的普遍歡迎，具備一定的臨床應用價值[3-4]。
Strat-M膜為美國Merck Millipore公司的仿生透皮膜，在實驗中起透皮屏障的作用，從已知的資料獲知，與小鼠、大鼠、兔、豬等動物皮膚相比，其對藥物的透皮屏障性能與人體皮膚最為接近，且由于是合成的仿生膜，數據重現性也非常好。而目前大多數透皮實驗均采用實驗人員自制的各種動物皮膚[5-7]，質量穩定性難以保證，Strat-M膜在國外已有使用[8-10]。
經預試驗發現，蛇床子素水溶性較差，結合相似藥物的透皮實驗文獻資料，我們比較了生理鹽水、不同濃度的乙醇-生理鹽水、不同濃度的PEG400-生理鹽水等多種接收介質對蛇床子素的溶解性差異，結果發現，乙醇-生理鹽水溶液對蛇床子素的溶解性較好。結合實驗結果可知，凝膠貼膏的累積釋放度為62.9%，累積透皮率為20.82%，透皮量約占釋放量的三分之一，推測30%的乙醇生理鹽水溶液未對仿生皮膚產生破壞。
由釋放度實驗結果可知，軟膏在1～48 h之間，釋放速度均快于凝膠貼膏，經分析，這可能是由于兩種劑型基質結構不同引起的。凝膠貼膏的基質雖然是水溶性成分，但分子量大[11]，且貼膏成型后呈交聯狀態，骨架成分從大分子長鏈結構變為框架結構[12]，而軟膏基質成分的分子量較凝膠貼膏更小，且軟膏成型后基質并非呈框架結構，因此軟膏釋藥較凝膠貼膏更快。但是當存在仿生皮膚屏障時，軟膏中有效成分蛇床子素受屏障阻礙，透皮速率較釋放速率明顯減慢，尤其是在透皮開始后的1～8 h內，透皮量增加非常緩慢，在8～48 h時間段內，透皮速率開始加快，最終累積透皮率為9.36%。而凝膠貼膏中加入了由化學成分和中藥成分組成的聯合促透劑[13-15]，從1 h開始透皮速率就較快，透皮量增加很快，在1～8 h內，透皮速率維持在較快的水平，隨著時間推移，透皮速率逐漸減慢，至48 h，累積透皮率為20.82%，約為軟膏的2.2倍。
綜上所述，結合兩種劑型的釋放度實驗結果發現，凝膠貼膏的最終累積透皮率與釋放度之比為33.1%，軟膏劑的最終累積透皮率與釋放度之比為12.1%，凝膠貼膏透皮率占釋放度的比例約為軟膏劑的2.7倍，推測可能是由于化學與中藥促透劑合用增強了透皮效果，使有效成分透過皮膚屏障的能力更優。二黃凝膠貼膏的透皮特性明顯優于其軟膏劑，且不易過敏，應用前景廣闊。
二黃凝膠貼膏原為軟膏劑，由獨活、羌活、大黃、黃柏、赤芍、川木香、大血藤等中藥組成，作為我院的醫院制劑（批準文號：川藥制字Z20080855）治療閉合性軟組織損傷所致的紅腫灼熱疼痛等病癥療效顯著，但軟膏劑含有海藻酸鈉等海產品，在使用過程中容易導致皮膚過敏，且需要涂抹在泡沫貼上使用，而泡沫貼也含有易致過敏的粘膠。因此，我們將二黃軟膏的藥物特點與新的制劑技術結合，開發了二黃凝膠貼膏[1]。并采用改良的豎式Franz擴散池及Strat-M膜，對制劑進行體外釋放度試驗及透皮試驗[2]，檢測接收液中主藥獨活的主要成分蛇床子素含量，從而比較新老兩種制劑的體外釋放及透皮性能。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 儀器
美國沃特世1525液相色譜，包括2487紫外檢測器、Empower Ⅲ色譜工作站及2707自動進樣器；TT-6D透皮擴散儀（天津市正通科技有限公司）；PL202-L電子天平、XS105分析天平（均為 Mettler Toledo公司）；AYJ1-0501-U純水機（重慶市頤科公司）。
1.1.2 藥品與試劑
蛇床子素對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：110822-201308）；二黃凝膠貼膏（自制，批號：20141110）；二黃軟膏（四川省骨科醫院生產，批號：150330）；Strat-M膜（美國Merck Millipore公司，批號：K4BA1004）；甲醇（色譜純，FISHER公司，批號：144282）；乙腈（色譜純，FISHER公司，批號：138939）。
1.2 方法
1.2.1 二黃凝膠貼膏制備工藝
將卡波姆941加入水中溶解，再將酒石酸加入水中，最后將甘羥鋁加入水中，以上為Ⅰ相；向甘油中加入部分中和的聚丙烯酸鈉（NP700），混合均勻，此為Ⅱ相；中藥材采用乙醇提取，并濃縮成浸膏，加入Ⅱ相中，再將Ⅰ、Ⅱ相混合，攪拌后滴入三乙醇胺調節pH值至中性，攪拌均勻，涂布，蓋上PP膜，靜置后包裝并保存。另稱取不含獨活的處方藥物按上述方法制成陰性二黃凝膠貼膏樣品。
1.2.2 含量測定
① 色譜條件與系統適用性試驗。色譜柱：Waters Symmetry Shield RP18，4.6 mm×250.0 mm，5 μm；流動相為甲醇-水（71 :29）；檢測波長為322 nm，流速為1.0 mL/min。理論板數按蛇床子素峰計算應不低于6 000。
② 對照品溶液配制及標準曲線制備。精密稱取干燥至恒定質量的蛇床子素對照品適量至容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得質量濃度為13.3 μg/mL的儲備液。分別精密量取該儲備液0.05、0.1、0.4、1.6、6.4、25 mL至100 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，進樣，記錄峰面積。以峰面積（y）為縱坐標，以蛇床子素進樣量（x）為橫坐標，繪制標準曲線，計算回歸方程。
③ 供試品溶液及陰性樣品溶液的制備。取250 mL圓底燒瓶，精密稱量40 g凝膠貼膏，加入圓底燒瓶中，再向其中加入乙醇50 mL，稱定重量，熱回流提取60 min，冷卻后用乙醇補足減失的重量，吸取提取液，用直徑0.45 μm濾膜過濾，取續濾液，得供試品溶液。取陰性二黃凝膠貼膏同法制得陰性樣品溶液。
④ 專屬性實驗。將對照品、供試品和陰性樣品溶液分別進樣，測定。
⑤ 精密度實驗。精密吸取以上“②”項下的對照品儲備液20 μL，連續進樣6次，以蛇床子素的峰面積計算相對標準偏差（RSD）。
⑥ 重復性實驗。按 “③”項下方法制備6份供試品溶液，進樣，以蛇床子素含量計算RSD。
⑦ 穩定性實驗。按“③”項下方法制備供試品溶液后于0、1、2、4、6、12、24、48 h進樣并以蛇床子素的峰面積計算RSD。
⑧ 加樣回收率實驗。配制質量濃度為0.18 mg/mL的對照品溶液。取20 g凝膠貼膏，精密稱定，加入上述對照品溶液2.5 mL后，照“③”項下方法制備供試品溶液，進樣，以蛇床子素含量計算RSD。
1.2.3 體外釋放度實驗
以30%乙醇的生理鹽水溶液為接收介質，預溫至（37.0±0.1）℃，將貼膏固定于豎式擴散池擴散室與接收室之間，釋放面向下，在貼膏下方放入孔徑0.8 μm的濾膜，將釋放介質加至刻度線，設置攪拌轉速為600 r/min，分別于1、2、4、6、8、12、24、48 h取出2 mL釋放液，并立即補充等量的空白釋放介質，0.45 μm濾膜過濾，進樣測定，按下式計算累積釋放度（%）：
Ln’為累積釋放度，Cn’為第n個時間點樣品的濃度，V為接收池體積，Ci’為第i個時間點樣品的濃度，V0為每次取樣的體積，W為凝膠貼膏樣品中蛇床子素的含量。軟膏劑實驗方法與凝膠貼膏相同。
1.2.4 體外透皮實驗
試驗采用改良的豎式Franz擴散池，將制備好的貼膏去掉防粘層，緊密貼于處理好的Strat-M膜上，排除貼膏與膜之間的氣泡，然后固定于擴散池的擴散室和接收室之間，貼膏藥物面朝向接收室，在接收室中放入磁力攪拌子，加入30%乙醇的生理鹽水溶液作為接收液至刻度線，排除氣泡。磁力攪拌轉速設定為600 r/min，水浴溫度（37.0±0.1）℃。在設定的時間點1、2、4、6、8、12、24、48 h分別取樣接收液2 mL，同時立即補加同樣體積的空白接收液。將接收液用0.45 μm濾膜過濾，進樣測定，按下式計算計算累積透皮量（mg）、累積透皮率（%）：
Ln=Qn/W×100
Qn為累積透皮量，Cn為第n個時間點樣品的濃度，V為接收池體積，Ci為第i個時間點樣品的濃度，V0為每次取樣的體積，Ln為累積透皮率，W為凝膠貼膏樣品中蛇床子素的含量。軟膏劑實驗方法與凝膠貼膏相同。
1.3 統計學方法
采用SPSS 17.0統計學軟件，應用t檢驗分析比較凝膠貼膏與軟膏的差異。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 標準曲線及線性關系
根據各時間點測得的結果，得回歸方程為y=83080.1x-1 312，相關系數r=0.999 9，表明蛇床子素進樣量在1.3×10-4～0.266 μg范圍內與峰面積呈良好線性關系。
2.2 專屬性實驗
由圖 1可知，供試品中蛇床子素峰形良好，且專屬性好。
圖1
HPLC圖 a.蛇床子素對照品 b.二黃凝膠貼膏 c.陰性二黃凝膠貼膏
2.3 精密度實驗
RSD值為0.90%，表明在此條件下儀器精密度良好。
2.4 重復性實驗
蛇床子素的平均含量為0.038 3 mg/g，RSD值為1.52%，表明樣品重復性良好。
2.5 穩定性實驗
測得蛇床子素峰面積的RSD值為2.001%，表明樣品在48 h內穩定。
2.6 加樣回收率實驗
蛇床子素的平均回收率為100.89%，RSD為2.38%，表明本方法加樣回收率能滿足要求。
2.7 體外釋放度實驗
以累計釋放度Ln’對時間t作圖，得凝膠貼膏回歸方程為：Ln’=9.429 6t-12.947，r=0.982 1，軟膏劑回歸方程為：Ln’=11.263t-9.723 2，r=0.991 1。見表 1。
表1
累積釋放度結果（n=6，2.8 體外透皮實驗
通過SPSS 17.0軟件進行t檢驗，根據表 2、3可知，凝膠貼膏與軟膏劑兩者每個時間點的累積透皮量和累積透皮率相比較，差異有統計學意義（P＜0.01）。以透皮率Ln對時間t對作圖，凝膠貼膏的透皮曲線方程為Ln=0.443 6t+1.350 9，r=0.964 4，軟膏劑的透皮曲線方程為Ln=0.205 1t-0.244 7，r=0.995 6。
表2
累積透皮量結果（n=6，
表3
累積透皮率結果（n=6，3 討論
不論以透皮量還是透皮率考察，二黃凝膠貼膏的透皮性能均優于二黃軟膏，且凝膠貼膏透氣性好、致敏率低、使用方便，從已經開展的初步臨床觀察來看，受到患者的普遍歡迎，具備一定的臨床應用價值[3-4]。
Strat-M膜為美國Merck Millipore公司的仿生透皮膜，在實驗中起透皮屏障的作用，從已知的資料獲知，與小鼠、大鼠、兔、豬等動物皮膚相比，其對藥物的透皮屏障性能與人體皮膚最為接近，且由于是合成的仿生膜，數據重現性也非常好。而目前大多數透皮實驗均采用實驗人員自制的各種動物皮膚[5-7]，質量穩定性難以保證，Strat-M膜在國外已有使用[8-10]。
經預試驗發現，蛇床子素水溶性較差，結合相似藥物的透皮實驗文獻資料，我們比較了生理鹽水、不同濃度的乙醇-生理鹽水、不同濃度的PEG400-生理鹽水等多種接收介質對蛇床子素的溶解性差異，結果發現，乙醇-生理鹽水溶液對蛇床子素的溶解性較好。結合實驗結果可知，凝膠貼膏的累積釋放度為62.9%，累積透皮率為20.82%，透皮量約占釋放量的三分之一，推測30%的乙醇生理鹽水溶液未對仿生皮膚產生破壞。
由釋放度實驗結果可知，軟膏在1～48 h之間，釋放速度均快于凝膠貼膏，經分析，這可能是由于兩種劑型基質結構不同引起的。凝膠貼膏的基質雖然是水溶性成分，但分子量大[11]，且貼膏成型后呈交聯狀態，骨架成分從大分子長鏈結構變為框架結構[12]，而軟膏基質成分的分子量較凝膠貼膏更小，且軟膏成型后基質并非呈框架結構，因此軟膏釋藥較凝膠貼膏更快。但是當存在仿生皮膚屏障時，軟膏中有效成分蛇床子素受屏障阻礙，透皮速率較釋放速率明顯減慢，尤其是在透皮開始后的1～8 h內，透皮量增加非常緩慢，在8～48 h時間段內，透皮速率開始加快，最終累積透皮率為9.36%。而凝膠貼膏中加入了由化學成分和中藥成分組成的聯合促透劑[13-15]，從1 h開始透皮速率就較快，透皮量增加很快，在1～8 h內，透皮速率維持在較快的水平，隨著時間推移，透皮速率逐漸減慢，至48 h，累積透皮率為20.82%，約為軟膏的2.2倍。
綜上所述，結合兩種劑型的釋放度實驗結果發現，凝膠貼膏的最終累積透皮率與釋放度之比為33.1%，軟膏劑的最終累積透皮率與釋放度之比為12.1%，凝膠貼膏透皮率占釋放度的比例約為軟膏劑的2.7倍，推測可能是由于化學與中藥促透劑合用增強了透皮效果，使有效成分透過皮膚屏障的能力更優。二黃凝膠貼膏的透皮特性明顯優于其軟膏劑，且不易過敏，應用前景廣闊。
