引用本文： 董賀文, 代號, 夏勇軍, 曾達, 金偉, 劉敏. 大鼠腦震蕩傷后誘導型一氧化氮合酶與膠質纖維酸性蛋白表達比值隨損傷時間. 華西醫學, 2016, 31(4): 718-723. doi: 10.7507/1002-0179.201600195 復制
腦震蕩是臨床醫學和法醫學領域中最為常見的一種顱腦損傷。但是，腦震蕩的損傷時間推斷至今仍然為法醫學領域中的研究難點與熱點。近年來，國內外的學者們通過建立腦震蕩動物模型，研究與腦震蕩傷相關的生物化學指標表達情況來推斷其損傷時間[1-7]。但是前人的研究多為單一生物化學指標，研究結果常常為被觀測指標出現先升高后降低的峰值曲線變化。理論上，觀測指標的某一觀測值在此種曲線上可對應先后不同的兩個時間點，從而造成損傷時間推斷的困難。
腦震蕩傷后觀測先后不同時間表達的兩種生物化學指標的比值變化，能否解決前述單一生物化學指標在損傷時間推斷中的缺陷尚未見研究，值得期待。Deng等[2]研究腦損傷后膠質纖維酸性蛋白（GFAP）表達、王煒煜等[3]研究腦損傷后誘導型一氧化氮合酶（iNOS）的表達，結果發現兩者的表達時間存在先后變化的規律性。我們在既往研究制作的大鼠腦震蕩模型基礎上，采用免疫組織化學染色法對腦震蕩后不同時間大鼠腦組織中表達的iNOS及GFAP進行檢測，觀測該兩種指標在不同時間點上的比值變化，以期為腦震蕩的損傷時間推斷提供新的思路。
1 材料與方法
1.1 實驗動物
健康成年無特定病原體級Sprague-Dawley大鼠85只；雌雄不限；體質量180～200 g，平均（190±10）g；由四川大學實驗動物中心提供。
1.2 主要儀器與試劑
1.2.1 主要儀器
自由落體式大鼠腦損傷打擊裝置（自制），Leica光學生物顯微鏡（德國Leica公司），Image Pro-Plus 6.0顯微圖像分析軟件（美國Media Cybernetics公司），BCD-265WM型冰箱（韓國Samsung公司），DHG-9023A型電熱恒溫鼓風干燥箱（上海益恒實驗儀器有限公司），WD750ASL23型微波爐（廣東格蘭仕集團有限公司）。
1.2.2 主要試劑
兔抗大鼠iNOS多克隆抗體、兔抗大鼠GFAP多克隆抗體（英國BeacomBio公司），即用型鏈霉親和素生物素復合物（SABC）免疫組織化學試劑盒、即用型3，3’-二氨基聯苯胺顯色試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）。
1.3 實驗方法
1.3.1 動物分組及模型制備
將大鼠隨機分成模型組（25只）、實驗組（55只）及對照組（5只），實驗組根據傷后處死的時間不同再分為0.5、1、3、6、12、24、48、96、168、240、336 h共11組，每組5只。
大鼠腦震蕩模型參照文獻[8-9]的自由落體打擊致傷模型，根據模型組大鼠的臨床表現、大體解剖和組織學改變，分析得出最符合腦震蕩臨床表現且無明顯腦挫傷的打擊高度為50 cm。實驗組采用前述方法，從50 cm的高度對本組所有大鼠進行打擊，并分別單獨飼養至0.5、1、3、6、12、24、48、94、168、240、336 h后迅速統一向大鼠左心室灌注4%多聚甲醛溶液致死。自延髓與脊髓交界處離斷，取出大鼠腦組織，于4%多聚甲醛溶液中固定48 h。于大鼠腦視交叉后1～4 mm處做冠狀切面取材，組織厚度約3 mm，脫水、包埋，常規切片，厚度5 μm，保存于4℃冰箱。對照組不做打擊，常規飼養24 h后，處死方式及取材部位與實驗組相同。
1.3.2 蘇木精-伊紅（HE）染色
取樣本石蠟切片采用常規HE染色方法進行染色，染色切片在光學顯微鏡下觀察，分析大鼠腦震蕩后腦組織病理學改變。
1.3.3 免疫組織化學染色
取樣本石蠟切片，按即用型SABC免疫組織化學試劑盒說明書的方法進行染色。一抗為兔抗大鼠GFAP多克隆抗體及兔抗大鼠iNOS多克隆抗體，陰性對照以磷酸鹽緩沖液取代一抗。染色切片在光學顯微鏡下觀察，細胞內/細胞核內有黃色至棕褐色細小顆粒分布者為陽性反應。
1.3.4 圖像分析
在光學顯微鏡下每張切片隨機選取10個視野，運用Image pro plus 6.0圖像分析軟件對每個視野中陽性表達的陽性細胞數目和總細胞數目進行檢測。計算陽性細胞率（陽性細胞數目/總細胞數目）。
1.4 統計學方法
所得數據用SPSS 19.0統計軟件包進行t檢驗，數據用均數±標準差表示。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 實驗組大鼠的臨床表現
實驗組大鼠經自由落體打擊后的臨床表現均符合典型腦震蕩的診斷，包括短暫的意識障礙，意識在數秒鐘至20 min內恢復；呼吸頻率的減慢或暫停，均在20 s內恢復；角膜反射和痛刺激反射減弱或消失，并于3 min內恢復。55只大鼠全部存活至預計時間點，且未遺留任何運動功能障礙。
2.2 大鼠腦組織大體改變和常規HE染色結果
實驗組及對照組大鼠腦組織肉眼觀均無可見的出血和挫傷灶。
實驗組大鼠鏡下觀傷后0.5 h可見腦血管擴張淤血，一直持續至傷后240 h；傷后3 h神經細胞和血管周圍間隙開始增寬，48 h此改變最為顯著。傷后3 h出現神經元的腫脹或固縮、尼氏體溶解，48～168 h改變最為明顯。0.5 h時少量神經膠質細胞肥大，異染色質減少；48 h時膠質細胞增生較明顯，個別變性壞死的神經元周圍出現噬神經現象和衛星現象；336 h時噬神經現象和衛星現象增多。所有大鼠均未見腦挫裂傷。對照組大鼠鏡下觀無明顯異常改變。
2.3 腦組織免疫組織化學染色結果
2.3.1 iNOS在腦組織中的表達
對照組大鼠腦組織中未見iNOS表達（圖 1a）。實驗組大鼠傷后0.5 h腦組織少量神經元和膠質細胞開始出現少量iNOS陽性染色，表現為黃色或棕色改變，主要出現在細胞核和細胞質，且細胞核著色較細胞質著色深（圖 1b）；隨著時間延長，陽性細胞數目和染色強度逐漸增加，至傷后24 h，iNOS陽性細胞數目和染色強度達到高峰（圖 1c），之后陽性細胞數目減少，染色強度減弱，但直至腦震蕩傷后336 h仍有陽性表達（圖 1d）。
圖1
大鼠腦組織iNOS免疫組織化學染色像（SABC ×400） 1a. 對照組大鼠腦組織不表達iNOS 1b. 實驗組大鼠傷后0.5 h少量神經元和膠質細胞呈iNOS陽性著色，細胞核著色較細胞質著色深 1c. 實驗組大鼠傷后24 h，iNOS陽性細胞數目和染色強度達到高峰 1d. 實驗組大鼠傷后336 h時iNOS陽性反應仍較對照組強 圖 2 大鼠腦組織GFAP免疫組織化學染色像（SABC ×400） 2a. 對照組大鼠腦組織中GFAP陽性細胞較少 2b. 實驗組大鼠傷后6 h，星形膠質細胞突起增粗變長，GFAP陽性反應增強 2c. 實驗組大鼠傷后48 h，星形膠質細胞的GFAP陽性反應達到最強 2d. 實驗組大鼠傷后336 h時GFAP陽性反應仍明顯強于對照組
2.3.2 GFAP在腦組織中的表達
對照組大鼠腦組織內見少數GFAP陽性表達的星形膠質細胞，陽性著色主要位于膠質細胞的細胞質和星形突起，表現為均勻分布的黃色至棕褐色細小顆粒（圖 2a）。實驗組大鼠傷后0.5、1、3 h時腦組織GFAP陽性細胞數目未見顯著增加；傷后6 h GFAP陽性表達開始出現明顯增強（圖 2b）；傷后48 h GFAP的表達達到高峰，星形膠質細胞的胞體增大，突起增粗、延長（圖 2c）；傷后96 h時GFAP陽性表達與48 h相比無明顯的減弱，傷后168 h GFAP陽性細胞數目明顯減少，但傷后336 h時仍有較多星形膠質細胞呈陽性染色（圖 2d）。
2.4 iNOS和GFAP陽性表達的變化規律
實驗組大鼠傷后0.5 h腦組織開始出現iNOS陽性表達，陽性細胞率高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）；隨后陽性細胞率逐漸升高，至24 h時達到最大值；之后至傷后336 h，陽性細胞率逐漸減少，但其值仍明顯高于對照組（P＜0.05）。實驗組大鼠傷后0.5、1、3 h時腦組織GFAP陽性細胞數目未見顯著增加，陽性表達與對照組比較差異無統計學意義（P＞0.05）；傷后6 h GFAP陽性表達明顯增強，陽性細胞率高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）；傷后48 h GFAP表達達到高峰，傷后96 h時其陽性表達與48 h相比無明顯的減弱（P＞0.05），之后至傷后336 h，陽性細胞率逐漸減少，但其值仍明顯高于對照組（P＜0.05）。見表 1。
表1
腦震蕩傷后不同時間iNOS、GFAP陽性細胞率（n=5，實驗組大鼠腦震蕩傷后腦組織內iNOS和GFAP兩種蛋白指標的陽性細胞率分別有著各自的時間規律性。傷后0.5～3 h表達iNOS的陽性細胞率快速升高，而表達GFAP的陽性細胞率無明顯變化；傷后6 h表達iNOS的陽性細胞率升高的速度開始減慢，表達GFAP的陽性細胞率明顯升高；傷后24 h表達iNOS的陽性細胞率達最大值，表達GFAP的陽性細胞率于傷后12～48 h有快速的升高，并于傷后48 h達到峰值；傷后48 h以后二者的陽性細胞率均呈下降趨勢，持續至傷后336 h，但iNOS的陽性細胞率比GFAP陽性細胞率的下降速度更快。見圖 3。
圖3
腦震蕩后不同時間點iNOS和GFAP陽性細胞率線性圖
2.5 iNOS與GFAP陽性表達的比值關系
iNOS與GFAP陽性細胞率的比值關系呈上升-峰值-下降的趨勢。傷后0.5～3 h，兩者比值呈逐漸升高的趨勢，至傷后3 h時二者的比值達到峰值（10.47）。之后則逐漸降低，傷后12 h兩者比值為4.98，與傷后0.5 h的比值非常接近。傷后12～336 h，iNOS與GFAP陽性細胞率的比值呈逐漸遞減的變化趨勢，其中傷后12～48 h的比值降低的速率較快，而傷后48～336 h二者的比值降低速率減慢。見圖 4。
圖4
腦震蕩后不同時間點iNOS與GFAP陽性細胞率的比值線性圖
3 討論
3.1 腦震蕩傷后iNOS的表達
正常情況下腦組織不表達iNOS，本實驗中對照組大鼠腦組織中即未見iNOS陽性表達細胞。當腦組織受到損傷，或內毒素侵襲時，干擾素γ或腫瘤壞死因子（TNF）-α、白細胞介素-1β等細胞因子通過激活與一氧化氮合酶啟動子相結合的干擾素調節因子1或核因子κB來誘導iNOS基因的轉錄[10-12]，iNOS催化細胞中的左旋精氨酸生成一氧化氮，發揮神經遞質、舒張血管平滑肌、參與免疫反應等一系列生物活性作用[13-14]。基于iNOS在正常組織不表達、僅在受損傷時表達的特性，可以作為判斷是否發生顱腦損傷的一種指標。TNF-α是最早參與炎癥反應的細胞因子之一，其出現可以誘導iNOS在腦損傷早期的快速表達[15]。本研究中，大鼠傷后0.5 h在腦組織中即可觀察到皮質和海馬的部分膠質細胞和個別神經元呈iNOS陽性表達。隨著損傷時間的推移，細胞內iNOS的表達不斷增強，可見陽性細胞逐漸增多，陽性染色不斷加深，0.5～12 h間陽性細胞率逐漸升高，至傷后24 h其值達到高峰，同王煒煜等[3]的研究結果相似。傷后48～96 h，腦組織內iNOS的陽性表達仍然處于較高水平，這可能和Ono等[16]報道的小膠質細胞增生誘導的遲發性神經損傷有關，當發生遲發性神經損傷時，會誘導損傷區周圍小膠質細胞的增生以及iNOS表達水平的升高。腦震蕩168 h后，腦組織內iNOS陽性表達水平不斷下降，但直至336 h在腦組織中仍可見少量iNOS陽性著色細胞；該時間段內iNOS表達的降低可能與神經型一氧化氮合酶催化底物左旋精氨酸和產物一氧化氮的負反饋調節有關[17]，也可能與一氧化氮引起神經細胞凋亡、壞死導致的細胞數目減少和iNOS活性的降低有關[18]。
3.2 腦震蕩傷后GFAP的表達
GFAP屬于Ⅲ型中間絲蛋白，是中樞神經系統中星形膠質細胞的特征標志蛋白，只在成熟的星形膠質細胞中表達。GFAP最主要的功能是和波形蛋白、外周蛋白等一起參與星形膠質細胞細胞骨架的構成，并維持星形膠質細胞的機械強度和細胞形態，發揮著神經保護和損害兩種矛盾的作用。當腦組織受到損傷或者外界刺激時，星形膠質細胞會呈現反應性的增生，同時GFAP的表達也會發生上調[19]。本研究中實驗組大鼠在傷后3 h內GFAP陽性表達水平無明顯升高，可能與腦組織損傷早期星形膠質細胞形成緩慢有關，與Hozumi等[20]報道一致；傷后6 h陽性細胞數目與對照組比較明顯增多，陽性染色強度增加，星狀突起增粗變長，至傷后48 h達到峰值，并維持高峰至96 h，與李玉紅等[21]報道達到峰值的時間不同，考慮這種差異可能與致傷方式、打擊力量和顱腦損傷的輕重不同有關。傷后168～336 h期間陽性表達逐漸減弱，但與對照組比較始終維持在較高水平，可能與損傷后期GFAP有促進膠質瘢痕形成有關，膠質瘢痕又是損傷后期神經元的再生和神經突生長過程中的重要障礙，從這點來說，GFAP在腦組織損傷后的表達中又扮演著損害的角色，具體作用機制尚有待于研究。
3.3 iNOS與GFAP表達比值與腦震蕩損傷時間的推斷
iNOS及GFAP在腦震蕩傷后的表達均表現為先升高再降低的變化趨勢，與國內外的學者們有關的研究[1-4]類似，利用單一指標的表達曲線來推斷損傷時間，可能出現同一個表達值對應曲線上兩個時間點的情況，因此不能用于腦震蕩損傷時間的推斷。本研究發現，傷后0.5～3 h，iNOS與GFAP陽性細胞率的比值呈逐漸升高的趨勢，至傷后3 h時二者的比值達到峰值（10.47）；之后則逐漸降低。兩者比值關系盡管仍然呈上升-峰值-下降的變化規律，但是如同時結合同一時間范圍內iNOS與GFAP陽性細胞率的變化情況，對于損傷時間推斷有重要價值。如二者比值處于比值曲線的上升段，且iNOS陽性細胞率亦顯著升高，但GFAP的陽性細胞率無明顯升高時，可判斷腦震蕩傷后時間在0.5～3 h區間；如二者比值處于比值曲線下降段，同時iNOS陽性細胞率與GFAP的陽性細胞率均顯著升高，可判斷腦震蕩傷后時間在3～12 h區間；如二者比值呈單調遞減的變化趨勢，且均小于0.5～12 h之間二者比值，可判斷腦震蕩傷時間在12～336 h區間。
綜上所述，腦震蕩傷后iNOS與GFAP的各自表達雖然存在時間變化規律性，但單一表達指標不能提供損傷時間推斷的區間；而采用iNOS與GFAP比值，同時結合iNOS與GFAP各自變化規律，可為腦震蕩損傷時間劃定時間范圍。說明采用兩個或多個生物化學指標的比值研究，可望為損傷時間的推斷提供可行的研究思路。
腦震蕩是臨床醫學和法醫學領域中最為常見的一種顱腦損傷。但是，腦震蕩的損傷時間推斷至今仍然為法醫學領域中的研究難點與熱點。近年來，國內外的學者們通過建立腦震蕩動物模型，研究與腦震蕩傷相關的生物化學指標表達情況來推斷其損傷時間[1-7]。但是前人的研究多為單一生物化學指標，研究結果常常為被觀測指標出現先升高后降低的峰值曲線變化。理論上，觀測指標的某一觀測值在此種曲線上可對應先后不同的兩個時間點，從而造成損傷時間推斷的困難。
腦震蕩傷后觀測先后不同時間表達的兩種生物化學指標的比值變化，能否解決前述單一生物化學指標在損傷時間推斷中的缺陷尚未見研究，值得期待。Deng等[2]研究腦損傷后膠質纖維酸性蛋白（GFAP）表達、王煒煜等[3]研究腦損傷后誘導型一氧化氮合酶（iNOS）的表達，結果發現兩者的表達時間存在先后變化的規律性。我們在既往研究制作的大鼠腦震蕩模型基礎上，采用免疫組織化學染色法對腦震蕩后不同時間大鼠腦組織中表達的iNOS及GFAP進行檢測，觀測該兩種指標在不同時間點上的比值變化，以期為腦震蕩的損傷時間推斷提供新的思路。
1 材料與方法
1.1 實驗動物
健康成年無特定病原體級Sprague-Dawley大鼠85只；雌雄不限；體質量180～200 g，平均（190±10）g；由四川大學實驗動物中心提供。
1.2 主要儀器與試劑
1.2.1 主要儀器
自由落體式大鼠腦損傷打擊裝置（自制），Leica光學生物顯微鏡（德國Leica公司），Image Pro-Plus 6.0顯微圖像分析軟件（美國Media Cybernetics公司），BCD-265WM型冰箱（韓國Samsung公司），DHG-9023A型電熱恒溫鼓風干燥箱（上海益恒實驗儀器有限公司），WD750ASL23型微波爐（廣東格蘭仕集團有限公司）。
1.2.2 主要試劑
兔抗大鼠iNOS多克隆抗體、兔抗大鼠GFAP多克隆抗體（英國BeacomBio公司），即用型鏈霉親和素生物素復合物（SABC）免疫組織化學試劑盒、即用型3，3’-二氨基聯苯胺顯色試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）。
1.3 實驗方法
1.3.1 動物分組及模型制備
將大鼠隨機分成模型組（25只）、實驗組（55只）及對照組（5只），實驗組根據傷后處死的時間不同再分為0.5、1、3、6、12、24、48、96、168、240、336 h共11組，每組5只。
大鼠腦震蕩模型參照文獻[8-9]的自由落體打擊致傷模型，根據模型組大鼠的臨床表現、大體解剖和組織學改變，分析得出最符合腦震蕩臨床表現且無明顯腦挫傷的打擊高度為50 cm。實驗組采用前述方法，從50 cm的高度對本組所有大鼠進行打擊，并分別單獨飼養至0.5、1、3、6、12、24、48、94、168、240、336 h后迅速統一向大鼠左心室灌注4%多聚甲醛溶液致死。自延髓與脊髓交界處離斷，取出大鼠腦組織，于4%多聚甲醛溶液中固定48 h。于大鼠腦視交叉后1～4 mm處做冠狀切面取材，組織厚度約3 mm，脫水、包埋，常規切片，厚度5 μm，保存于4℃冰箱。對照組不做打擊，常規飼養24 h后，處死方式及取材部位與實驗組相同。
1.3.2 蘇木精-伊紅（HE）染色
取樣本石蠟切片采用常規HE染色方法進行染色，染色切片在光學顯微鏡下觀察，分析大鼠腦震蕩后腦組織病理學改變。
1.3.3 免疫組織化學染色
取樣本石蠟切片，按即用型SABC免疫組織化學試劑盒說明書的方法進行染色。一抗為兔抗大鼠GFAP多克隆抗體及兔抗大鼠iNOS多克隆抗體，陰性對照以磷酸鹽緩沖液取代一抗。染色切片在光學顯微鏡下觀察，細胞內/細胞核內有黃色至棕褐色細小顆粒分布者為陽性反應。
1.3.4 圖像分析
在光學顯微鏡下每張切片隨機選取10個視野，運用Image pro plus 6.0圖像分析軟件對每個視野中陽性表達的陽性細胞數目和總細胞數目進行檢測。計算陽性細胞率（陽性細胞數目/總細胞數目）。
1.4 統計學方法
所得數據用SPSS 19.0統計軟件包進行t檢驗，數據用均數±標準差表示。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 實驗組大鼠的臨床表現
實驗組大鼠經自由落體打擊后的臨床表現均符合典型腦震蕩的診斷，包括短暫的意識障礙，意識在數秒鐘至20 min內恢復；呼吸頻率的減慢或暫停，均在20 s內恢復；角膜反射和痛刺激反射減弱或消失，并于3 min內恢復。55只大鼠全部存活至預計時間點，且未遺留任何運動功能障礙。
2.2 大鼠腦組織大體改變和常規HE染色結果
實驗組及對照組大鼠腦組織肉眼觀均無可見的出血和挫傷灶。
實驗組大鼠鏡下觀傷后0.5 h可見腦血管擴張淤血，一直持續至傷后240 h；傷后3 h神經細胞和血管周圍間隙開始增寬，48 h此改變最為顯著。傷后3 h出現神經元的腫脹或固縮、尼氏體溶解，48～168 h改變最為明顯。0.5 h時少量神經膠質細胞肥大，異染色質減少；48 h時膠質細胞增生較明顯，個別變性壞死的神經元周圍出現噬神經現象和衛星現象；336 h時噬神經現象和衛星現象增多。所有大鼠均未見腦挫裂傷。對照組大鼠鏡下觀無明顯異常改變。
2.3 腦組織免疫組織化學染色結果
2.3.1 iNOS在腦組織中的表達
對照組大鼠腦組織中未見iNOS表達（圖 1a）。實驗組大鼠傷后0.5 h腦組織少量神經元和膠質細胞開始出現少量iNOS陽性染色，表現為黃色或棕色改變，主要出現在細胞核和細胞質，且細胞核著色較細胞質著色深（圖 1b）；隨著時間延長，陽性細胞數目和染色強度逐漸增加，至傷后24 h，iNOS陽性細胞數目和染色強度達到高峰（圖 1c），之后陽性細胞數目減少，染色強度減弱，但直至腦震蕩傷后336 h仍有陽性表達（圖 1d）。
圖1
大鼠腦組織iNOS免疫組織化學染色像（SABC ×400） 1a. 對照組大鼠腦組織不表達iNOS 1b. 實驗組大鼠傷后0.5 h少量神經元和膠質細胞呈iNOS陽性著色，細胞核著色較細胞質著色深 1c. 實驗組大鼠傷后24 h，iNOS陽性細胞數目和染色強度達到高峰 1d. 實驗組大鼠傷后336 h時iNOS陽性反應仍較對照組強 圖 2 大鼠腦組織GFAP免疫組織化學染色像（SABC ×400） 2a. 對照組大鼠腦組織中GFAP陽性細胞較少 2b. 實驗組大鼠傷后6 h，星形膠質細胞突起增粗變長，GFAP陽性反應增強 2c. 實驗組大鼠傷后48 h，星形膠質細胞的GFAP陽性反應達到最強 2d. 實驗組大鼠傷后336 h時GFAP陽性反應仍明顯強于對照組
2.3.2 GFAP在腦組織中的表達
對照組大鼠腦組織內見少數GFAP陽性表達的星形膠質細胞，陽性著色主要位于膠質細胞的細胞質和星形突起，表現為均勻分布的黃色至棕褐色細小顆粒（圖 2a）。實驗組大鼠傷后0.5、1、3 h時腦組織GFAP陽性細胞數目未見顯著增加；傷后6 h GFAP陽性表達開始出現明顯增強（圖 2b）；傷后48 h GFAP的表達達到高峰，星形膠質細胞的胞體增大，突起增粗、延長（圖 2c）；傷后96 h時GFAP陽性表達與48 h相比無明顯的減弱，傷后168 h GFAP陽性細胞數目明顯減少，但傷后336 h時仍有較多星形膠質細胞呈陽性染色（圖 2d）。
2.4 iNOS和GFAP陽性表達的變化規律
實驗組大鼠傷后0.5 h腦組織開始出現iNOS陽性表達，陽性細胞率高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）；隨后陽性細胞率逐漸升高，至24 h時達到最大值；之后至傷后336 h，陽性細胞率逐漸減少，但其值仍明顯高于對照組（P＜0.05）。實驗組大鼠傷后0.5、1、3 h時腦組織GFAP陽性細胞數目未見顯著增加，陽性表達與對照組比較差異無統計學意義（P＞0.05）；傷后6 h GFAP陽性表達明顯增強，陽性細胞率高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）；傷后48 h GFAP表達達到高峰，傷后96 h時其陽性表達與48 h相比無明顯的減弱（P＞0.05），之后至傷后336 h，陽性細胞率逐漸減少，但其值仍明顯高于對照組（P＜0.05）。見表 1。
表1
腦震蕩傷后不同時間iNOS、GFAP陽性細胞率（n=5，實驗組大鼠腦震蕩傷后腦組織內iNOS和GFAP兩種蛋白指標的陽性細胞率分別有著各自的時間規律性。傷后0.5～3 h表達iNOS的陽性細胞率快速升高，而表達GFAP的陽性細胞率無明顯變化；傷后6 h表達iNOS的陽性細胞率升高的速度開始減慢，表達GFAP的陽性細胞率明顯升高；傷后24 h表達iNOS的陽性細胞率達最大值，表達GFAP的陽性細胞率于傷后12～48 h有快速的升高，并于傷后48 h達到峰值；傷后48 h以后二者的陽性細胞率均呈下降趨勢，持續至傷后336 h，但iNOS的陽性細胞率比GFAP陽性細胞率的下降速度更快。見圖 3。
圖3
腦震蕩后不同時間點iNOS和GFAP陽性細胞率線性圖
2.5 iNOS與GFAP陽性表達的比值關系
iNOS與GFAP陽性細胞率的比值關系呈上升-峰值-下降的趨勢。傷后0.5～3 h，兩者比值呈逐漸升高的趨勢，至傷后3 h時二者的比值達到峰值（10.47）。之后則逐漸降低，傷后12 h兩者比值為4.98，與傷后0.5 h的比值非常接近。傷后12～336 h，iNOS與GFAP陽性細胞率的比值呈逐漸遞減的變化趨勢，其中傷后12～48 h的比值降低的速率較快，而傷后48～336 h二者的比值降低速率減慢。見圖 4。
圖4
腦震蕩后不同時間點iNOS與GFAP陽性細胞率的比值線性圖
3 討論
3.1 腦震蕩傷后iNOS的表達
正常情況下腦組織不表達iNOS，本實驗中對照組大鼠腦組織中即未見iNOS陽性表達細胞。當腦組織受到損傷，或內毒素侵襲時，干擾素γ或腫瘤壞死因子（TNF）-α、白細胞介素-1β等細胞因子通過激活與一氧化氮合酶啟動子相結合的干擾素調節因子1或核因子κB來誘導iNOS基因的轉錄[10-12]，iNOS催化細胞中的左旋精氨酸生成一氧化氮，發揮神經遞質、舒張血管平滑肌、參與免疫反應等一系列生物活性作用[13-14]。基于iNOS在正常組織不表達、僅在受損傷時表達的特性，可以作為判斷是否發生顱腦損傷的一種指標。TNF-α是最早參與炎癥反應的細胞因子之一，其出現可以誘導iNOS在腦損傷早期的快速表達[15]。本研究中，大鼠傷后0.5 h在腦組織中即可觀察到皮質和海馬的部分膠質細胞和個別神經元呈iNOS陽性表達。隨著損傷時間的推移，細胞內iNOS的表達不斷增強，可見陽性細胞逐漸增多，陽性染色不斷加深，0.5～12 h間陽性細胞率逐漸升高，至傷后24 h其值達到高峰，同王煒煜等[3]的研究結果相似。傷后48～96 h，腦組織內iNOS的陽性表達仍然處于較高水平，這可能和Ono等[16]報道的小膠質細胞增生誘導的遲發性神經損傷有關，當發生遲發性神經損傷時，會誘導損傷區周圍小膠質細胞的增生以及iNOS表達水平的升高。腦震蕩168 h后，腦組織內iNOS陽性表達水平不斷下降，但直至336 h在腦組織中仍可見少量iNOS陽性著色細胞；該時間段內iNOS表達的降低可能與神經型一氧化氮合酶催化底物左旋精氨酸和產物一氧化氮的負反饋調節有關[17]，也可能與一氧化氮引起神經細胞凋亡、壞死導致的細胞數目減少和iNOS活性的降低有關[18]。
3.2 腦震蕩傷后GFAP的表達
GFAP屬于Ⅲ型中間絲蛋白，是中樞神經系統中星形膠質細胞的特征標志蛋白，只在成熟的星形膠質細胞中表達。GFAP最主要的功能是和波形蛋白、外周蛋白等一起參與星形膠質細胞細胞骨架的構成，并維持星形膠質細胞的機械強度和細胞形態，發揮著神經保護和損害兩種矛盾的作用。當腦組織受到損傷或者外界刺激時，星形膠質細胞會呈現反應性的增生，同時GFAP的表達也會發生上調[19]。本研究中實驗組大鼠在傷后3 h內GFAP陽性表達水平無明顯升高，可能與腦組織損傷早期星形膠質細胞形成緩慢有關，與Hozumi等[20]報道一致；傷后6 h陽性細胞數目與對照組比較明顯增多，陽性染色強度增加，星狀突起增粗變長，至傷后48 h達到峰值，并維持高峰至96 h，與李玉紅等[21]報道達到峰值的時間不同，考慮這種差異可能與致傷方式、打擊力量和顱腦損傷的輕重不同有關。傷后168～336 h期間陽性表達逐漸減弱，但與對照組比較始終維持在較高水平，可能與損傷后期GFAP有促進膠質瘢痕形成有關，膠質瘢痕又是損傷后期神經元的再生和神經突生長過程中的重要障礙，從這點來說，GFAP在腦組織損傷后的表達中又扮演著損害的角色，具體作用機制尚有待于研究。
3.3 iNOS與GFAP表達比值與腦震蕩損傷時間的推斷
iNOS及GFAP在腦震蕩傷后的表達均表現為先升高再降低的變化趨勢，與國內外的學者們有關的研究[1-4]類似，利用單一指標的表達曲線來推斷損傷時間，可能出現同一個表達值對應曲線上兩個時間點的情況，因此不能用于腦震蕩損傷時間的推斷。本研究發現，傷后0.5～3 h，iNOS與GFAP陽性細胞率的比值呈逐漸升高的趨勢，至傷后3 h時二者的比值達到峰值（10.47）；之后則逐漸降低。兩者比值關系盡管仍然呈上升-峰值-下降的變化規律，但是如同時結合同一時間范圍內iNOS與GFAP陽性細胞率的變化情況，對于損傷時間推斷有重要價值。如二者比值處于比值曲線的上升段，且iNOS陽性細胞率亦顯著升高，但GFAP的陽性細胞率無明顯升高時，可判斷腦震蕩傷后時間在0.5～3 h區間；如二者比值處于比值曲線下降段，同時iNOS陽性細胞率與GFAP的陽性細胞率均顯著升高，可判斷腦震蕩傷后時間在3～12 h區間；如二者比值呈單調遞減的變化趨勢，且均小于0.5～12 h之間二者比值，可判斷腦震蕩傷時間在12～336 h區間。
綜上所述，腦震蕩傷后iNOS與GFAP的各自表達雖然存在時間變化規律性，但單一表達指標不能提供損傷時間推斷的區間；而采用iNOS與GFAP比值，同時結合iNOS與GFAP各自變化規律，可為腦震蕩損傷時間劃定時間范圍。說明采用兩個或多個生物化學指標的比值研究，可望為損傷時間的推斷提供可行的研究思路。
