引用本文： 肖準, 張曜曜, 李靈玲, 李尚為. 人卵巢組織慢速冷凍保護液中添加抗凋亡劑研究. 華西醫學, 2016, 31(3): 507-510. doi: 10.7507/1002-0179.201600134 復制
隨著低溫生物學技術在輔助生殖領域中的運用，卵巢組織冷凍對于女性生育力保存有著重要的臨床意義和深遠的應用前景[1-2]。2004年，有研究首次報道凍存卵巢組織，解凍后自體盆腔內移植分娩一個健康女嬰以來，世界范圍內約有30多例卵巢凍存移植后出生的嬰兒[3-6]。但該技術在我國處于起步階段，尚需深入研究[7]。其中，建立理想的人卵巢組織冷凍保存法是保證該技術成功的關鍵，而減少冷凍后凋亡的發生，對于成功冷凍保存卵巢組織具有重要意義。在本研究中，我們將通過在人卵巢組織慢速冷凍保護液中添加抗凋亡劑，探討抗凋亡劑對始基卵泡及周圍間質細胞的保存效果。現報告如下。
1 資料與方法
1.1 一般資料
收集2012年3月－2013年4月在我院行婦科手術的患者卵巢組織，共9例，年齡23～35歲；其中6例因卵巢囊腫行囊腫剝除術，3例因子宮惡性腫瘤行附件切除術。收集送病理檢查后剩余的卵巢皮質組織，病理檢查證實卵巢組織有癌細胞轉移者已剔除。本研究涉及的人體標本收集過程以及知情同意書經四川大學倫理委員會專家審核批準。將收集的卵巢組織標本置于4℃預冷的含10%胎牛血清的L-15培養液中，室溫下在超凈工作臺內，快速用眼科剪剔除卵巢組織髓質后，將卵巢組織皮質塊分割成面積為2～3 mm2大小的組織塊，每例患者標本隨機等量分配到實驗組及對照組（未添加抗凋亡劑組）。對照組中冷凍保護液采用1.5 mmol/L二甲亞砜+0.1 mmol/L蔗糖的程序化冷凍保護液；實驗組冷凍保護液采用1.5 mmol/L二甲亞砜+0.1 mmol/L蔗糖+100 mg/L維生素C的程序化冷凍保護液。
1.2 方法
1.2.1 慢速冷凍及復蘇方法
兩組均采用慢速冷凍法[8]，并按照目前國際上通常使用的稍作修改的程序操作。將預處理后的人卵巢組織皮質片放置于含1 mL程序化冷凍保護液的1.8 mL冷凍管中，每管裝入2～3片卵巢皮質。使組織塊在4℃的冷凍保護液中平衡30 min后，將冷凍管放入程序降溫儀中，按設定程序，首先以-2℃/min的降溫速率降至-7℃，保持5 min，用浸過液氮的鑷子夾在冷凍管保護液與空氣的交界面，人工植冰，誘導產生冰晶，在-7℃維持10 min；再以-0.3℃/min的降溫速率降至-40℃；進一步以-30℃/min的降溫速率降至-150℃，最后快速將冷凍管投入液氮罐儲存備用。
解凍復蘇時，將冷凍管從液氮中取出，在空氣中晃動20～30 s，置于37℃水浴中震蕩30 s，取出冷凍管中卵巢組織片，將其放入1.0 mmol/L二甲亞砜+ 0.1 mmol/L蔗糖的溶液內5 min，然后依次放入0.5 mmol/L二甲亞砜+ 0.1 mmol/L蔗糖、0.25 mmol/L二甲亞砜+0.1 mmol/L蔗糖、0.1 mmol/L 蔗糖；含10%胎牛血清的L-15培養液各5 min，逐步置換去除組織內保護液后，進行下一步試驗。
1.2.2 光學顯微鏡形態學分析
兩組冷凍復蘇后的卵巢組織均通過常規固定、脫水、二甲苯透明、石蠟包埋，按5 μm厚度連續切片，間隔10張進行蘇木精-伊紅（HE）染色，光學顯微鏡下觀察始基卵泡的形態并計數始基卵泡個數。為了避免重復計數，只有卵母細胞核深染的卵泡被計數在內。形態分析采用Gougeon分級標準：① 始基卵泡：指僅由單層扁平或扁平與立方混合的顆粒細胞包繞卵母細胞的卵泡。② 形態正常的始基卵泡：卵母細胞呈圓形或橢圓形態，包膜完整，無皺縮，細胞核大而圓；顆粒細胞分布均勻，顆粒細胞與基膜之間連接緊密，基膜完整，卵母細胞和顆粒細胞均未見濃縮核。③ 形態異常的始基卵泡：卵泡和卵母細胞形態不規則，卵母細胞細胞質內出現大量的空泡，核濃縮；顆粒細胞排列極為紊亂、缺失、塌陷或出現多個核濃縮[9]。
1.2.3 凋亡測定（TUNEL法檢測）
兩組冷凍復蘇后的卵巢組織經常規脫水、二甲苯透明、石蠟包埋，按5 μm連續切片（選取同HE染色不同位置切片），間隔10張進行末端脫氧核苷酸轉移酶介導的缺口末端標記法（TUNEL）凋亡細胞染色。試驗室步驟按Enzo Life Sciences公司生產的TUNEL檢測試劑盒說明書操作。
凋亡卵泡的判斷標準：① 凋亡陽性細胞：以細胞核呈棕黃色顆粒為陽性細胞。② 凋亡陽性始基卵泡：若1個始基卵泡中卵母細胞染色陽性和（或）卵泡周圍超過50%顆粒細胞染色陽性，則記錄為凋亡陽性卵泡[10] 。計數TUNEL陽性始基卵泡數量和總始基卵泡數，計數始基卵泡凋亡百分率（凋亡始基卵泡數/總始基卵泡數）。③ 間質細胞凋亡陽性率＝染色陽性的間質細胞面積/組織總面積×100%；當評判間質細胞凋亡面積時，用圖像分析軟件半定量測定[11]。
1.3 統計學方法
采用SPSS 13.0統計軟件進行統計學分析。計量資料采用均數±標準差表示，計數資料采用例數和百分比表示。采用χ2檢驗分析實驗組和對照組形態學正常始基卵泡的百分率和凋亡卵泡百分率以及間質細胞凋亡百分率。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 兩組始基卵泡形態學觀察
在光學顯微鏡下觀察兩組始基卵泡形態，經冷凍復蘇后，兩組中均有部分始基卵泡出現卵泡和卵母細胞形態不規則，細胞質內出現空泡，核濃縮；或者顆粒細胞排列紊亂、缺失、塌陷等損傷表現，冷凍復蘇過程對始基卵泡有一定損傷作用。見圖 1。實驗組中始基卵泡形態正常126個，異常28個，正常百分率為81.8%（126/154），異常百分率為18.2%（28/154）；對照組中始基卵泡形態正常103個，異常46個，正常百分率為69.1%（103/149），異常百分率為30.9%（46/149）；實驗組中始基卵泡形態正常百分率高于對照組（P＜0.05）。
圖1
實驗組和對照組始基卵泡形態比較（HE ×400） 1a. 實驗組中形態正常始基卵泡，表現為橢圓形卵泡形態，顆粒細胞分布均勻，卵母細胞未見核濃縮 1b.對照組中形態異常始基卵泡，表現為卵泡結構不完整，卵母細胞和顆粒細胞出現核濃縮，顆粒細胞排列紊亂? ?圖 2實驗組和對照組凋亡比較（TUNEL法×400） 2a.實驗組中未發生凋亡始基卵泡，表現為卵母細胞和卵泡周圍顆粒細胞未見棕色陽性染色 2b.對照組中發生凋亡始基卵泡，表現為卵母細胞和卵泡周圍顆粒細胞見棕色陽性染色
2.2 兩組始基卵泡和卵巢間質細胞凋亡發生率
在光學顯微鏡下對兩組卵巢皮質解凍復蘇后始基卵泡進行凋亡分析，兩組中均有始基卵泡卵母細胞染色陽性，或者卵泡周圍顆粒細胞染色陽性；實驗組中，總始基卵泡207個，凋亡始基卵泡73個，凋亡發生率為35.3% （73/207）；對照組中，總始基卵泡196個，凋亡始基卵泡86個，凋亡發生率為43.9% （86/196）；對照組中凋亡發生率較對照組明顯增加，兩組比較差異有統計學意義（P＜0.05）。對于兩組卵巢間質細胞凋亡分析，實驗組的凋亡發生率為（29.76±3.52）%，對照組的凋亡發生率為（35.37±3.16）%，兩組卵巢間質細胞凋亡比較，實驗組的凋亡發生率降低，差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖 2。
3 討論
目前，人卵巢組織深低溫保存中采取的方法主要為程序化慢速冷凍法。在慢速冷凍過程中，細胞內冰晶形成是造成組織細胞損傷的主要原因，而添加冷凍保護劑是阻止慢速冷凍中由于冰晶造成組織損傷的主要方法。冷凍保護劑分為滲透性和非滲透性兩類，常用的滲透性保護劑包括二甲亞砜、乙二醇和丙三醇等。蔗糖是目前使用的主要非滲透性保護劑。近年來，在冷凍中同時使用滲透性和非滲透性保護劑可以降低滲透性保護劑濃度和毒性，改善冷凍效果[12-13]。為了提高冷凍保護劑的保護效果，有研究在冷凍保護劑中添加小牛血清、人體白蛋白和等均取得了較好的卵巢組織保存效果[14]。如何進一步優化冷凍保護劑配伍，減少冷凍造成的組織損傷，是改善冷凍效果的主要途徑。
有研究發現，冷凍損傷能誘導人卵巢組織中形態正常的始基卵泡凋亡的出現，提示凋亡在卵巢組織凍融復蘇后始基卵泡發育潛能方面具有重要意義[15]。而通過凋亡抑制劑選擇性干預凋亡因子Bax的表達，能增加雌性小鼠卵巢中始基卵泡數量和卵巢儲備[16]。我們前期研究也發現，卵巢組織冷凍能誘導形態正常的始基卵泡中Fas/Fas配體通路的表達[17]。最近，有研究在人卵巢組織異種移植中，將卵巢皮質移植到裸鼠體內前，給與宿主抗凋亡劑維生素E預處理，或者將準備移植的人卵巢皮質片給與含維生素E的培養液預培養，均能通過維生素E的抗凋亡作用改善卵巢組織移植后效果[18]。以上研究提示在人卵巢組織冷凍中，抑制凋亡的發生可能是重要的促進卵巢組織冷凍保存效果的途徑。目前，在慢速冷凍保護劑中，是否可以通過在冷凍保護液中添加抗凋亡劑改善冷凍保存效果，尚未見報道。
抗氧化劑維生素C能通過其抗氧化作用，阻止死亡受體介導的凋亡過程的發生，是一種重要的抗凋亡劑[11, 18]。本研究中，我們首次在人卵巢組織慢速冷凍保護液中添加抗凋亡劑維生素C，探討維生素C是否能在慢速冷凍過程中通過抗凋亡作用實現對始基卵泡及周圍間質細胞的保護。研究結果發現添加抗凋亡劑的實驗組中始基卵泡形態正常百分率高于對照組（P＜0.05），提示實驗組能更好地保存始基卵泡的形態；而在凋亡發生率檢測中，添加抗凋亡劑的實驗組與對照組相比較，始基卵泡和間質細胞凋亡發生率均降低（P＜0.05），提示實驗組可能更好地保護卵巢組織及始基卵泡的發育潛能，為卵巢組織凍融后的臨床應用提供更好的卵巢組織樣本。以上研究結果提示，慢速冷凍保護劑中添加抗凋亡劑能通過抗凋亡作用促進始基卵泡及周圍間質細胞的保存效果。
總之，冷凍保護劑中使用凋亡抑制劑干預凋亡的發生，能通過抗凋亡作用改善卵巢組織保存效果。這為如何提高慢速冷凍中人卵巢組織的保存效果提供了重要的思路，具有較廣闊的應用前景，值得進一步深入研究。
隨著低溫生物學技術在輔助生殖領域中的運用，卵巢組織冷凍對于女性生育力保存有著重要的臨床意義和深遠的應用前景[1-2]。2004年，有研究首次報道凍存卵巢組織，解凍后自體盆腔內移植分娩一個健康女嬰以來，世界范圍內約有30多例卵巢凍存移植后出生的嬰兒[3-6]。但該技術在我國處于起步階段，尚需深入研究[7]。其中，建立理想的人卵巢組織冷凍保存法是保證該技術成功的關鍵，而減少冷凍后凋亡的發生，對于成功冷凍保存卵巢組織具有重要意義。在本研究中，我們將通過在人卵巢組織慢速冷凍保護液中添加抗凋亡劑，探討抗凋亡劑對始基卵泡及周圍間質細胞的保存效果。現報告如下。
1 資料與方法
1.1 一般資料
收集2012年3月－2013年4月在我院行婦科手術的患者卵巢組織，共9例，年齡23～35歲；其中6例因卵巢囊腫行囊腫剝除術，3例因子宮惡性腫瘤行附件切除術。收集送病理檢查后剩余的卵巢皮質組織，病理檢查證實卵巢組織有癌細胞轉移者已剔除。本研究涉及的人體標本收集過程以及知情同意書經四川大學倫理委員會專家審核批準。將收集的卵巢組織標本置于4℃預冷的含10%胎牛血清的L-15培養液中，室溫下在超凈工作臺內，快速用眼科剪剔除卵巢組織髓質后，將卵巢組織皮質塊分割成面積為2～3 mm2大小的組織塊，每例患者標本隨機等量分配到實驗組及對照組（未添加抗凋亡劑組）。對照組中冷凍保護液采用1.5 mmol/L二甲亞砜+0.1 mmol/L蔗糖的程序化冷凍保護液；實驗組冷凍保護液采用1.5 mmol/L二甲亞砜+0.1 mmol/L蔗糖+100 mg/L維生素C的程序化冷凍保護液。
1.2 方法
1.2.1 慢速冷凍及復蘇方法
兩組均采用慢速冷凍法[8]，并按照目前國際上通常使用的稍作修改的程序操作。將預處理后的人卵巢組織皮質片放置于含1 mL程序化冷凍保護液的1.8 mL冷凍管中，每管裝入2～3片卵巢皮質。使組織塊在4℃的冷凍保護液中平衡30 min后，將冷凍管放入程序降溫儀中，按設定程序，首先以-2℃/min的降溫速率降至-7℃，保持5 min，用浸過液氮的鑷子夾在冷凍管保護液與空氣的交界面，人工植冰，誘導產生冰晶，在-7℃維持10 min；再以-0.3℃/min的降溫速率降至-40℃；進一步以-30℃/min的降溫速率降至-150℃，最后快速將冷凍管投入液氮罐儲存備用。
解凍復蘇時，將冷凍管從液氮中取出，在空氣中晃動20～30 s，置于37℃水浴中震蕩30 s，取出冷凍管中卵巢組織片，將其放入1.0 mmol/L二甲亞砜+ 0.1 mmol/L蔗糖的溶液內5 min，然后依次放入0.5 mmol/L二甲亞砜+ 0.1 mmol/L蔗糖、0.25 mmol/L二甲亞砜+0.1 mmol/L蔗糖、0.1 mmol/L 蔗糖；含10%胎牛血清的L-15培養液各5 min，逐步置換去除組織內保護液后，進行下一步試驗。
1.2.2 光學顯微鏡形態學分析
兩組冷凍復蘇后的卵巢組織均通過常規固定、脫水、二甲苯透明、石蠟包埋，按5 μm厚度連續切片，間隔10張進行蘇木精-伊紅（HE）染色，光學顯微鏡下觀察始基卵泡的形態并計數始基卵泡個數。為了避免重復計數，只有卵母細胞核深染的卵泡被計數在內。形態分析采用Gougeon分級標準：① 始基卵泡：指僅由單層扁平或扁平與立方混合的顆粒細胞包繞卵母細胞的卵泡。② 形態正常的始基卵泡：卵母細胞呈圓形或橢圓形態，包膜完整，無皺縮，細胞核大而圓；顆粒細胞分布均勻，顆粒細胞與基膜之間連接緊密，基膜完整，卵母細胞和顆粒細胞均未見濃縮核。③ 形態異常的始基卵泡：卵泡和卵母細胞形態不規則，卵母細胞細胞質內出現大量的空泡，核濃縮；顆粒細胞排列極為紊亂、缺失、塌陷或出現多個核濃縮[9]。
1.2.3 凋亡測定（TUNEL法檢測）
兩組冷凍復蘇后的卵巢組織經常規脫水、二甲苯透明、石蠟包埋，按5 μm連續切片（選取同HE染色不同位置切片），間隔10張進行末端脫氧核苷酸轉移酶介導的缺口末端標記法（TUNEL）凋亡細胞染色。試驗室步驟按Enzo Life Sciences公司生產的TUNEL檢測試劑盒說明書操作。
凋亡卵泡的判斷標準：① 凋亡陽性細胞：以細胞核呈棕黃色顆粒為陽性細胞。② 凋亡陽性始基卵泡：若1個始基卵泡中卵母細胞染色陽性和（或）卵泡周圍超過50%顆粒細胞染色陽性，則記錄為凋亡陽性卵泡[10] 。計數TUNEL陽性始基卵泡數量和總始基卵泡數，計數始基卵泡凋亡百分率（凋亡始基卵泡數/總始基卵泡數）。③ 間質細胞凋亡陽性率＝染色陽性的間質細胞面積/組織總面積×100%；當評判間質細胞凋亡面積時，用圖像分析軟件半定量測定[11]。
1.3 統計學方法
采用SPSS 13.0統計軟件進行統計學分析。計量資料采用均數±標準差表示，計數資料采用例數和百分比表示。采用χ2檢驗分析實驗組和對照組形態學正常始基卵泡的百分率和凋亡卵泡百分率以及間質細胞凋亡百分率。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 兩組始基卵泡形態學觀察
在光學顯微鏡下觀察兩組始基卵泡形態，經冷凍復蘇后，兩組中均有部分始基卵泡出現卵泡和卵母細胞形態不規則，細胞質內出現空泡，核濃縮；或者顆粒細胞排列紊亂、缺失、塌陷等損傷表現，冷凍復蘇過程對始基卵泡有一定損傷作用。見圖 1。實驗組中始基卵泡形態正常126個，異常28個，正常百分率為81.8%（126/154），異常百分率為18.2%（28/154）；對照組中始基卵泡形態正常103個，異常46個，正常百分率為69.1%（103/149），異常百分率為30.9%（46/149）；實驗組中始基卵泡形態正常百分率高于對照組（P＜0.05）。
圖1
實驗組和對照組始基卵泡形態比較（HE ×400） 1a. 實驗組中形態正常始基卵泡，表現為橢圓形卵泡形態，顆粒細胞分布均勻，卵母細胞未見核濃縮 1b.對照組中形態異常始基卵泡，表現為卵泡結構不完整，卵母細胞和顆粒細胞出現核濃縮，顆粒細胞排列紊亂? ?圖 2實驗組和對照組凋亡比較（TUNEL法×400） 2a.實驗組中未發生凋亡始基卵泡，表現為卵母細胞和卵泡周圍顆粒細胞未見棕色陽性染色 2b.對照組中發生凋亡始基卵泡，表現為卵母細胞和卵泡周圍顆粒細胞見棕色陽性染色
2.2 兩組始基卵泡和卵巢間質細胞凋亡發生率
在光學顯微鏡下對兩組卵巢皮質解凍復蘇后始基卵泡進行凋亡分析，兩組中均有始基卵泡卵母細胞染色陽性，或者卵泡周圍顆粒細胞染色陽性；實驗組中，總始基卵泡207個，凋亡始基卵泡73個，凋亡發生率為35.3% （73/207）；對照組中，總始基卵泡196個，凋亡始基卵泡86個，凋亡發生率為43.9% （86/196）；對照組中凋亡發生率較對照組明顯增加，兩組比較差異有統計學意義（P＜0.05）。對于兩組卵巢間質細胞凋亡分析，實驗組的凋亡發生率為（29.76±3.52）%，對照組的凋亡發生率為（35.37±3.16）%，兩組卵巢間質細胞凋亡比較，實驗組的凋亡發生率降低，差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖 2。
3 討論
目前，人卵巢組織深低溫保存中采取的方法主要為程序化慢速冷凍法。在慢速冷凍過程中，細胞內冰晶形成是造成組織細胞損傷的主要原因，而添加冷凍保護劑是阻止慢速冷凍中由于冰晶造成組織損傷的主要方法。冷凍保護劑分為滲透性和非滲透性兩類，常用的滲透性保護劑包括二甲亞砜、乙二醇和丙三醇等。蔗糖是目前使用的主要非滲透性保護劑。近年來，在冷凍中同時使用滲透性和非滲透性保護劑可以降低滲透性保護劑濃度和毒性，改善冷凍效果[12-13]。為了提高冷凍保護劑的保護效果，有研究在冷凍保護劑中添加小牛血清、人體白蛋白和等均取得了較好的卵巢組織保存效果[14]。如何進一步優化冷凍保護劑配伍，減少冷凍造成的組織損傷，是改善冷凍效果的主要途徑。
有研究發現，冷凍損傷能誘導人卵巢組織中形態正常的始基卵泡凋亡的出現，提示凋亡在卵巢組織凍融復蘇后始基卵泡發育潛能方面具有重要意義[15]。而通過凋亡抑制劑選擇性干預凋亡因子Bax的表達，能增加雌性小鼠卵巢中始基卵泡數量和卵巢儲備[16]。我們前期研究也發現，卵巢組織冷凍能誘導形態正常的始基卵泡中Fas/Fas配體通路的表達[17]。最近，有研究在人卵巢組織異種移植中，將卵巢皮質移植到裸鼠體內前，給與宿主抗凋亡劑維生素E預處理，或者將準備移植的人卵巢皮質片給與含維生素E的培養液預培養，均能通過維生素E的抗凋亡作用改善卵巢組織移植后效果[18]。以上研究提示在人卵巢組織冷凍中，抑制凋亡的發生可能是重要的促進卵巢組織冷凍保存效果的途徑。目前，在慢速冷凍保護劑中，是否可以通過在冷凍保護液中添加抗凋亡劑改善冷凍保存效果，尚未見報道。
抗氧化劑維生素C能通過其抗氧化作用，阻止死亡受體介導的凋亡過程的發生，是一種重要的抗凋亡劑[11, 18]。本研究中，我們首次在人卵巢組織慢速冷凍保護液中添加抗凋亡劑維生素C，探討維生素C是否能在慢速冷凍過程中通過抗凋亡作用實現對始基卵泡及周圍間質細胞的保護。研究結果發現添加抗凋亡劑的實驗組中始基卵泡形態正常百分率高于對照組（P＜0.05），提示實驗組能更好地保存始基卵泡的形態；而在凋亡發生率檢測中，添加抗凋亡劑的實驗組與對照組相比較，始基卵泡和間質細胞凋亡發生率均降低（P＜0.05），提示實驗組可能更好地保護卵巢組織及始基卵泡的發育潛能，為卵巢組織凍融后的臨床應用提供更好的卵巢組織樣本。以上研究結果提示，慢速冷凍保護劑中添加抗凋亡劑能通過抗凋亡作用促進始基卵泡及周圍間質細胞的保存效果。
總之，冷凍保護劑中使用凋亡抑制劑干預凋亡的發生，能通過抗凋亡作用改善卵巢組織保存效果。這為如何提高慢速冷凍中人卵巢組織的保存效果提供了重要的思路，具有較廣闊的應用前景，值得進一步深入研究。
