引用本文： 唐潔, 蔣能剛, 梁效功, 薛麗, 薛冰蓉. 四色十抗體流式免疫表型分析方案在多發性骨髓瘤診斷中的價值. 華西醫學, 2017, 32(3): 419-424. doi: 10.7507/1002-0179.201512161 復制
多發性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）是常見的血液系統惡性腫瘤，發病率高，卻無法治愈，但早期診斷并干預可明顯延長患者的生存期[1-2]。骨髓形態學檢查和血清蛋白電泳等實驗室檢查是重要的 MM 輔助診斷手段，但由于不同患者瘤細胞在增生程度、浸潤范圍和副蛋白分泌量等方面差異大，傳統實驗室檢查易造成漏診[3]。多參數流式細胞術（multiparameter flow cytometry，MFC）具有分析速度快、靈敏度高、客觀、準確等特點，用于 MM 檢測有獨特優勢。本研究對 2013 年 12 月—2015 年 3 月我院收治的 45 例 MM 患者骨髓細胞運用由藻紅蛋白（R-phycoerythrin，PE）、異硫氰酸（fluorescein isothiocyanate，FITC）、多甲藻葉綠素蛋白（peridinin chlorophyⅡprotein，PerCP）和別藻青蛋白（allophycocyanin，APC）4 種熒光素標記的抗 CD45、CD38、CD19、CD56、CD20、CD5、CD10、人白細胞抗原-DR（human leukocyte antigen-DR，HLA-DR）、κ 和 λ 輕鏈等抗體組成的 4 色 10 抗體方案進行流式免疫表型分析，并結合形態學檢查結果，分析探討該方案在 MM 診斷中的的價值。現報告如下。
1 資料與方法
1.1 一般資料
收集 2013 年 12 月—2015 年 3 月綿陽市中心醫院血液科收治的 MM 患者 45 例。所有患者入院即行骨髓穿刺液流式細胞術檢查和細胞形態學檢查。MM 的診斷和分期由我院血液科醫生參照《中國多發性骨髓瘤診治指南》（2013 年修訂）[4] 確定。排除標準：① 意義未定的單克隆免疫球蛋白病；② 冒煙骨髓瘤；③ 合并其他腫瘤的 MM 患者。入選的 45 例患者中，男 23 例，女 22 例；年齡 40～80 歲，中位年齡 66 歲；血鈣增高 6 例；腎功損害 31 例；貧血 34 例；骨病變（僅 36 例進行了骨影像學檢查）25 例；Durie-Salmon（DS）分期：ⅠA 1 例，ⅠB 4 例，ⅡA 4 例，ⅡB 期 5 例，ⅢA 9 例，ⅢB 22 例。
1.2 儀器與試劑
FACS Calibur 型流式細胞儀（美國 Becton Dickison 公司）及其配套的各型熒光標記鼠抗人單克隆抗體、同型對照鼠抗人免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）G1 抗體及破膜劑（FACS Permeabilizing Solution 2）。
1.3 方法
1.3.1 流式細胞術分析 ① 樣本前處理：無菌操作抽取肝素抗凝骨髓液約 2 mL，用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）調整為（5～10）×106 個細胞/mL 的單細胞懸液（借助血細胞計數儀計數后估算稀釋比例）。每 100 μL 單細胞懸液與 20 μL 組合好的抗體室溫避光孵育 20 min，加入氯化銨溶血劑待液體透亮，1 500 r/min 離心 10 min，棄去上清液，用 0.5 mL PBS 重懸后上機。胞漿輕鏈抗體孵育需先染胞膜抗體，步驟如前所述，溶血后需用 PBS 洗滌 2 遍，破膜劑室溫避光破膜 15 min，再加入胞漿抗體孵育 30 min，洗滌 1 遍后用 0.5 mL PBS 重懸后上機。抗體組合方案見表 1。
表1
MFC 免疫表型分析的 4 色抗體組合方案
② 流式細胞儀收集分析：用流式細胞儀及其配套 Cell Quest 軟件獲取、記錄和分析數據。設定每管收集 30 000 個細胞。熒光強度軸設為對數模式，以 CD45/側向散射（side scatter，SSC）或 前向散射（forward scatter，FSC）散點圖作為評估骨髓取材、各主要細胞群有無異常的基線圖。以 CD45dim/－/CD38high 設門，配合 CD19－、CD56high、CD10－、CD5－，結合胞漿 Ig 輕鏈（κ 或 λ）的限制性表達（κ/λ>3︰1）確定骨髓瘤細胞。用各熒光素標記的同型對照設本底基線。MFC 檢測結果判讀標準：與已知的陰性細胞相比，熒光強度與陰性細胞無差別為陰性（－）；稍強于陰性細胞但強度差別<101 為弱陽性（dim）；與陰性細胞相比在 101～102 之間為陽性；與陰性細胞相比≥102 為強陽性（high）。以固定的門計算抗原陽性率。
1.3.2 骨髓涂片檢查 取骨髓穿刺液約 0.5 mL 制作 2 張涂片備選，室溫晾干后用瑞氏-姬姆薩染液染色 15 min，去離子水沖去染液晾干，由經驗豐富的專職骨髓形態學工作人員在顯微鏡下檢查。方法為在涂片、染色良好的體尾交界處按一定順序向尾部迂回漸進分類計數 200 個有核細胞，計算骨髓瘤細胞百分率。
1.4 統計學方法
應用 SPSS 17.0 軟件中行×列表的χ2 檢驗進行率的比較分析，用 Medcalc 軟件中 Bland-Altman 圖進行流式細胞術法與形態學法對骨髓瘤細胞檢出率的一致性分析。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 MM 患者骨髓標本流式細胞術圖形分析
在 CD45/SSC 散點圖上，骨髓樣本的細胞大致可分為淋巴細胞（P1）、單核細胞（P2）、髓細胞（P3）、原始細胞（P4）和有核紅細胞（P5）5 群，見圖 1。在 MM 患者，以 CD45dim/－/CD38high 設門可較為準確地圈出骨髓瘤細胞群（P6），該群細胞在 CD45/SSC 散點圖中多位于有核紅區域或幼稚細胞區域。準確設門后可對骨髓瘤細胞進行免疫表型分析，見圖 2。本研究 45 例 MM 患者流式法檢測到的骨髓瘤細胞比例為 1.17%～72.31%。
圖1
正常骨髓細胞 CD45/SSC 流式散點圖
圖2
1 例 MM 患者骨髓流式分析散點圖 a. CD45/CD38；b. CD45/SSC；c. CD19/CD38；d. CD56/CD38；e. CD20/CD10；f. CD56/HLA-DR；g. cκ/ cλ。黑箭指示骨髓瘤細胞（P6），其表型特點為 CD38high、CD45dim、CD19－、CD56high、CD10－、CD5－，限制性表達胞漿 λ 輕鏈。CD20 和 HLA-DR 在骨髓瘤細胞的表達從陰性到弱陽性不定，本例 CD20 陰性，HLA-DR 部分陽性
2.2 45 例 MM 患者骨髓瘤細胞流式細胞術免疫表型分析
45 例 MM 患者骨髓標本經 4 色 10 抗體流式方案檢測后，骨髓瘤細胞免疫表型陽性率從高到低依次為 CD38 100.00%、CD56 73.33%、HLA-DR 42.22%、CD20 17.78%、CD45 11.11%、CD19 2.22%。所有患者瘤細胞均不表達 CD5 和 CD10。16 例（35.56%）患者瘤細胞限制性表達 κ 輕鏈，29 例（64.44%）患者限制性表達 λ 輕鏈，見表 2。骨髓瘤細胞的一般表型特征為表達 CD38high、CD45dim/－、CD19dim/－、CD56high，不定表達 CD20 和 HLA-DR，不表達 CD5 和 CD10，限制性表達一種胞漿Ig輕鏈 κ 或 λ。
表2
MM 患者 MFC 免疫表型分析（n=45）
2.3 MM 患者骨髓瘤細胞不同 DS 分期各抗原表達率的比較分析
根據 DS 分期法將 45 例 MM 患者分為 3 期，本研究流式方案所針對的各抗原在 DS 3 個分期的患者中表達差異無統計學意義（P>0.05）。見表 3。
表3
MM 患者各 DS 分期 MFC 免疫表型分析（%）
2.4 MM 患者不同 Ig 類型抗原表達結果分析
45 例 MM 患者不同 Ig 類型抗原表達結果分析顯示，僅 CD56 的陽性率在各 Ig 分型間差異有統計學意義（P<0.05），其中不分泌型最高，其次為 IgA 型和 IgG 型，輕鏈型最低。其余抗原在各型 Ig 瘤細胞間表達差異無統計學意義（P>0.05）。見表 4。
表4
MM 患者不同 Ig 類型免疫表型分析（n=45）
2.5 流式細胞術法與形態學法對 MM 患者骨髓瘤細胞檢出率的 Bland-Altman 一致性分析
45 例 MM 患者骨髓形態學檢查骨髓瘤細胞比例范圍為 7.5%～90.0%，流式細胞術檢測瘤細胞比例范圍為 1.17%～72.31%。Bland-Altman 一致性分析顯示，兩組數據有 95.56%（43/45）的點在一致性界限內，說明流式細胞術法計數的瘤細胞數與形態學法計數結果有良好的一致性。
3 討論
骨髓瘤細胞來源于漿細胞，但二者免疫表型有差異，流式細胞術通過檢測細胞表面抗原表達強弱、異常抗原的出現以及胞漿內輕鏈的限制性表達，能夠客觀準確地實現正常和異常漿細胞的鑒別，是 MM 診斷和分型的重要工具[5]。CD38 和 CD138 在正常髓內漿細胞極強表達，被認為是漿細胞最特異的標志。此外，正常漿細胞表達 CD45、CD19，不表達 CD56 和 CD20，無限制性胞漿輕鏈表達[6]。骨髓瘤細胞仍強表達 CD38，但 CD138 時常失標[7-8]，同時不表達或弱表達 CD45、CD19，強表達 CD56，有胞漿輕鏈限制性表達。故本研究選用 CD45dim/－/CD38high 作為設門抗體識別骨髓瘤細胞，再結合其他抗體檢測結果驗證瘤細胞，分析其免疫表型特點，并結合形態學檢查結果探討該方案用于 MM 的診斷價值。
CD38 與細胞的激活和增殖有關，在早期髓系、B 系前體細胞、單核細胞、粒細胞和淋巴細胞（特別是激活的 T 細胞）均有不同強度的表達[9]。骨髓瘤細胞 CD38 表達比正常漿細胞有所減弱，但一般仍為髓內最強，可作為骨髓瘤細胞的特異標志物。CD45 廣泛表達于骨髓造血細胞，但從成熟淋巴細胞、單核細胞、粒系細胞到有核紅細胞呈從強到弱的梯度表達，CD45 結合 SSC 是評估骨髓取材優劣、樣本是否新鮮以及大致判斷骨髓細胞群有無異常的常用有力標志物。骨髓瘤細胞不表達或弱表達 CD45[10]。因此對 MM 患者骨髓樣本流式檢測第一步選用 CD45、CD38 結合 SSC 分析，既可以評價骨髓取材情況、大致了解骨髓有無異常細胞群，又能對可疑骨髓瘤細胞精確設門，進而根據其他免疫表型的異常確定瘤細胞。CD19 是 B 系標志，正常漿細胞均表達，但約 95% 的骨髓瘤細胞不表達 CD19[10]。CD56 介導細胞間相互作用，正常漿細胞幾乎不表達，約 70% 以上的骨髓瘤細胞強表達 CD56，其表達缺失的骨髓瘤細胞被認為惡性程度更大[11-12]。此兩種抗體由于在正常、異常漿細胞間顯著的表達差異而被歐洲骨髓瘤網絡工作組（European Myeloma Network，EMN）推薦為 MM 流式檢測的必選抗體。在本研究中，45 例 MM 患者的骨髓以 CD45dim/－/CD38high 設門后，每例均發現一群可疑瘤細胞，其比例在 1.17%～72.31% 之間。隨后分析可疑瘤細胞的相應抗原表達陽性率，CD38 陽性率為 100.00%，CD56 為 73.33%，CD45 為 11.11%，CD19 為 2.22%，CD20 為 17.78%，與 Kumar 等[13] 的報道基本一致。總結可疑瘤細胞的表型特點為 CD38high，CD45dim，CD19－，CD56high，符合 EMN 描述的骨髓瘤細胞表型特點。再結合胞漿輕鏈的限制性表達，進一步證實了可疑瘤細胞為單克隆增殖的骨髓瘤細胞。可見，本流式方案對 MM 患者骨髓瘤細胞篩查靈敏度高，準確性好。
在本研究所選方案中，除了 EMN 推薦的必選抗體，還搭配了 CD5、CD10 和 HLA-DR 等抗體。CD5 屬泛 T 標志，表達減弱或丟失提示 T 系異常，骨髓 B 系表達 CD5 提示 B 系淋巴瘤等疾病[14]。CD10 在前 B 細胞、前 T 細胞、生發中心 B 細胞和成熟粒細胞均有表達，在 B 系急性淋巴細胞白血病、彌漫大 B 細胞淋巴瘤和Burkitt 淋巴瘤等也有表達[15]。HLA-DR 通常在 B 系急性淋巴細胞白血病時表達。以上淋巴瘤均有 CD38 的表達，但一般弱于骨髓瘤細胞。骨髓瘤細胞不表達 CD5、CD10，少部分表達較弱的 HLA-DR。據此既可以實現 MM 與淋巴瘤的鑒別，也可以發現罕見的合并癥患者，發揮鑒別診斷的作用。此外，方案中 CD56 的表達在 MM 不同 Ig 類型患者間有差異，這提示 CD56 或許能在 MM 的 Ig 分型中發揮作用。但是本流式方案對于 MM 不同 DS 分期無幫助，研究顯示 CD27、CD28 和 CD33 等與 MM 的分期和預后相關[13]，因此，若需了解 MM 患者分期和預后信息，流式方案內應加入這些抗體。
骨髓形態學檢查因其經濟、便捷，是目前應用最廣的血液系統疾病篩查方法。也是國際骨髓瘤工作組納入診斷標準的參考方法之一。本研究將骨髓瘤細胞流式計數比例與同時檢測的形態學比例進行比較后，獲得了良好的一致性，進一步說明了本方案檢測骨髓瘤細胞的準確可靠。同時流式檢測瘤細胞建立在免疫表型分析的客觀基礎上，相比形態學更有利于了解骨髓全貌，有利于與正常或反應性漿細胞以及其他漿細胞病的鑒別。但是鑒于瘤細胞流式計數總是低于形態學[16]，兩種方法結合將更有利于診斷。
多發性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）是常見的血液系統惡性腫瘤，發病率高，卻無法治愈，但早期診斷并干預可明顯延長患者的生存期[1-2]。骨髓形態學檢查和血清蛋白電泳等實驗室檢查是重要的 MM 輔助診斷手段，但由于不同患者瘤細胞在增生程度、浸潤范圍和副蛋白分泌量等方面差異大，傳統實驗室檢查易造成漏診[3]。多參數流式細胞術（multiparameter flow cytometry，MFC）具有分析速度快、靈敏度高、客觀、準確等特點，用于 MM 檢測有獨特優勢。本研究對 2013 年 12 月—2015 年 3 月我院收治的 45 例 MM 患者骨髓細胞運用由藻紅蛋白（R-phycoerythrin，PE）、異硫氰酸（fluorescein isothiocyanate，FITC）、多甲藻葉綠素蛋白（peridinin chlorophyⅡprotein，PerCP）和別藻青蛋白（allophycocyanin，APC）4 種熒光素標記的抗 CD45、CD38、CD19、CD56、CD20、CD5、CD10、人白細胞抗原-DR（human leukocyte antigen-DR，HLA-DR）、κ 和 λ 輕鏈等抗體組成的 4 色 10 抗體方案進行流式免疫表型分析，并結合形態學檢查結果，分析探討該方案在 MM 診斷中的的價值。現報告如下。
1 資料與方法
1.1 一般資料
收集 2013 年 12 月—2015 年 3 月綿陽市中心醫院血液科收治的 MM 患者 45 例。所有患者入院即行骨髓穿刺液流式細胞術檢查和細胞形態學檢查。MM 的診斷和分期由我院血液科醫生參照《中國多發性骨髓瘤診治指南》（2013 年修訂）[4] 確定。排除標準：① 意義未定的單克隆免疫球蛋白病；② 冒煙骨髓瘤；③ 合并其他腫瘤的 MM 患者。入選的 45 例患者中，男 23 例，女 22 例；年齡 40～80 歲，中位年齡 66 歲；血鈣增高 6 例；腎功損害 31 例；貧血 34 例；骨病變（僅 36 例進行了骨影像學檢查）25 例；Durie-Salmon（DS）分期：ⅠA 1 例，ⅠB 4 例，ⅡA 4 例，ⅡB 期 5 例，ⅢA 9 例，ⅢB 22 例。
1.2 儀器與試劑
FACS Calibur 型流式細胞儀（美國 Becton Dickison 公司）及其配套的各型熒光標記鼠抗人單克隆抗體、同型對照鼠抗人免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）G1 抗體及破膜劑（FACS Permeabilizing Solution 2）。
1.3 方法
1.3.1 流式細胞術分析 ① 樣本前處理：無菌操作抽取肝素抗凝骨髓液約 2 mL，用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）調整為（5～10）×106 個細胞/mL 的單細胞懸液（借助血細胞計數儀計數后估算稀釋比例）。每 100 μL 單細胞懸液與 20 μL 組合好的抗體室溫避光孵育 20 min，加入氯化銨溶血劑待液體透亮，1 500 r/min 離心 10 min，棄去上清液，用 0.5 mL PBS 重懸后上機。胞漿輕鏈抗體孵育需先染胞膜抗體，步驟如前所述，溶血后需用 PBS 洗滌 2 遍，破膜劑室溫避光破膜 15 min，再加入胞漿抗體孵育 30 min，洗滌 1 遍后用 0.5 mL PBS 重懸后上機。抗體組合方案見表 1。
表1
MFC 免疫表型分析的 4 色抗體組合方案
② 流式細胞儀收集分析：用流式細胞儀及其配套 Cell Quest 軟件獲取、記錄和分析數據。設定每管收集 30 000 個細胞。熒光強度軸設為對數模式，以 CD45/側向散射（side scatter，SSC）或 前向散射（forward scatter，FSC）散點圖作為評估骨髓取材、各主要細胞群有無異常的基線圖。以 CD45dim/－/CD38high 設門，配合 CD19－、CD56high、CD10－、CD5－，結合胞漿 Ig 輕鏈（κ 或 λ）的限制性表達（κ/λ>3︰1）確定骨髓瘤細胞。用各熒光素標記的同型對照設本底基線。MFC 檢測結果判讀標準：與已知的陰性細胞相比，熒光強度與陰性細胞無差別為陰性（－）；稍強于陰性細胞但強度差別<101 為弱陽性（dim）；與陰性細胞相比在 101～102 之間為陽性；與陰性細胞相比≥102 為強陽性（high）。以固定的門計算抗原陽性率。
1.3.2 骨髓涂片檢查 取骨髓穿刺液約 0.5 mL 制作 2 張涂片備選，室溫晾干后用瑞氏-姬姆薩染液染色 15 min，去離子水沖去染液晾干，由經驗豐富的專職骨髓形態學工作人員在顯微鏡下檢查。方法為在涂片、染色良好的體尾交界處按一定順序向尾部迂回漸進分類計數 200 個有核細胞，計算骨髓瘤細胞百分率。
1.4 統計學方法
應用 SPSS 17.0 軟件中行×列表的χ2 檢驗進行率的比較分析，用 Medcalc 軟件中 Bland-Altman 圖進行流式細胞術法與形態學法對骨髓瘤細胞檢出率的一致性分析。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 MM 患者骨髓標本流式細胞術圖形分析
在 CD45/SSC 散點圖上，骨髓樣本的細胞大致可分為淋巴細胞（P1）、單核細胞（P2）、髓細胞（P3）、原始細胞（P4）和有核紅細胞（P5）5 群，見圖 1。在 MM 患者，以 CD45dim/－/CD38high 設門可較為準確地圈出骨髓瘤細胞群（P6），該群細胞在 CD45/SSC 散點圖中多位于有核紅區域或幼稚細胞區域。準確設門后可對骨髓瘤細胞進行免疫表型分析，見圖 2。本研究 45 例 MM 患者流式法檢測到的骨髓瘤細胞比例為 1.17%～72.31%。
圖1
正常骨髓細胞 CD45/SSC 流式散點圖
圖2
1 例 MM 患者骨髓流式分析散點圖 a. CD45/CD38；b. CD45/SSC；c. CD19/CD38；d. CD56/CD38；e. CD20/CD10；f. CD56/HLA-DR；g. cκ/ cλ。黑箭指示骨髓瘤細胞（P6），其表型特點為 CD38high、CD45dim、CD19－、CD56high、CD10－、CD5－，限制性表達胞漿 λ 輕鏈。CD20 和 HLA-DR 在骨髓瘤細胞的表達從陰性到弱陽性不定，本例 CD20 陰性，HLA-DR 部分陽性
2.2 45 例 MM 患者骨髓瘤細胞流式細胞術免疫表型分析
45 例 MM 患者骨髓標本經 4 色 10 抗體流式方案檢測后，骨髓瘤細胞免疫表型陽性率從高到低依次為 CD38 100.00%、CD56 73.33%、HLA-DR 42.22%、CD20 17.78%、CD45 11.11%、CD19 2.22%。所有患者瘤細胞均不表達 CD5 和 CD10。16 例（35.56%）患者瘤細胞限制性表達 κ 輕鏈，29 例（64.44%）患者限制性表達 λ 輕鏈，見表 2。骨髓瘤細胞的一般表型特征為表達 CD38high、CD45dim/－、CD19dim/－、CD56high，不定表達 CD20 和 HLA-DR，不表達 CD5 和 CD10，限制性表達一種胞漿Ig輕鏈 κ 或 λ。
表2
MM 患者 MFC 免疫表型分析（n=45）
2.3 MM 患者骨髓瘤細胞不同 DS 分期各抗原表達率的比較分析
根據 DS 分期法將 45 例 MM 患者分為 3 期，本研究流式方案所針對的各抗原在 DS 3 個分期的患者中表達差異無統計學意義（P>0.05）。見表 3。
表3
MM 患者各 DS 分期 MFC 免疫表型分析（%）
2.4 MM 患者不同 Ig 類型抗原表達結果分析
45 例 MM 患者不同 Ig 類型抗原表達結果分析顯示，僅 CD56 的陽性率在各 Ig 分型間差異有統計學意義（P<0.05），其中不分泌型最高，其次為 IgA 型和 IgG 型，輕鏈型最低。其余抗原在各型 Ig 瘤細胞間表達差異無統計學意義（P>0.05）。見表 4。
表4
MM 患者不同 Ig 類型免疫表型分析（n=45）
2.5 流式細胞術法與形態學法對 MM 患者骨髓瘤細胞檢出率的 Bland-Altman 一致性分析
45 例 MM 患者骨髓形態學檢查骨髓瘤細胞比例范圍為 7.5%～90.0%，流式細胞術檢測瘤細胞比例范圍為 1.17%～72.31%。Bland-Altman 一致性分析顯示，兩組數據有 95.56%（43/45）的點在一致性界限內，說明流式細胞術法計數的瘤細胞數與形態學法計數結果有良好的一致性。
3 討論
骨髓瘤細胞來源于漿細胞，但二者免疫表型有差異，流式細胞術通過檢測細胞表面抗原表達強弱、異常抗原的出現以及胞漿內輕鏈的限制性表達，能夠客觀準確地實現正常和異常漿細胞的鑒別，是 MM 診斷和分型的重要工具[5]。CD38 和 CD138 在正常髓內漿細胞極強表達，被認為是漿細胞最特異的標志。此外，正常漿細胞表達 CD45、CD19，不表達 CD56 和 CD20，無限制性胞漿輕鏈表達[6]。骨髓瘤細胞仍強表達 CD38，但 CD138 時常失標[7-8]，同時不表達或弱表達 CD45、CD19，強表達 CD56，有胞漿輕鏈限制性表達。故本研究選用 CD45dim/－/CD38high 作為設門抗體識別骨髓瘤細胞，再結合其他抗體檢測結果驗證瘤細胞，分析其免疫表型特點，并結合形態學檢查結果探討該方案用于 MM 的診斷價值。
CD38 與細胞的激活和增殖有關，在早期髓系、B 系前體細胞、單核細胞、粒細胞和淋巴細胞（特別是激活的 T 細胞）均有不同強度的表達[9]。骨髓瘤細胞 CD38 表達比正常漿細胞有所減弱，但一般仍為髓內最強，可作為骨髓瘤細胞的特異標志物。CD45 廣泛表達于骨髓造血細胞，但從成熟淋巴細胞、單核細胞、粒系細胞到有核紅細胞呈從強到弱的梯度表達，CD45 結合 SSC 是評估骨髓取材優劣、樣本是否新鮮以及大致判斷骨髓細胞群有無異常的常用有力標志物。骨髓瘤細胞不表達或弱表達 CD45[10]。因此對 MM 患者骨髓樣本流式檢測第一步選用 CD45、CD38 結合 SSC 分析，既可以評價骨髓取材情況、大致了解骨髓有無異常細胞群，又能對可疑骨髓瘤細胞精確設門，進而根據其他免疫表型的異常確定瘤細胞。CD19 是 B 系標志，正常漿細胞均表達，但約 95% 的骨髓瘤細胞不表達 CD19[10]。CD56 介導細胞間相互作用，正常漿細胞幾乎不表達，約 70% 以上的骨髓瘤細胞強表達 CD56，其表達缺失的骨髓瘤細胞被認為惡性程度更大[11-12]。此兩種抗體由于在正常、異常漿細胞間顯著的表達差異而被歐洲骨髓瘤網絡工作組（European Myeloma Network，EMN）推薦為 MM 流式檢測的必選抗體。在本研究中，45 例 MM 患者的骨髓以 CD45dim/－/CD38high 設門后，每例均發現一群可疑瘤細胞，其比例在 1.17%～72.31% 之間。隨后分析可疑瘤細胞的相應抗原表達陽性率，CD38 陽性率為 100.00%，CD56 為 73.33%，CD45 為 11.11%，CD19 為 2.22%，CD20 為 17.78%，與 Kumar 等[13] 的報道基本一致。總結可疑瘤細胞的表型特點為 CD38high，CD45dim，CD19－，CD56high，符合 EMN 描述的骨髓瘤細胞表型特點。再結合胞漿輕鏈的限制性表達，進一步證實了可疑瘤細胞為單克隆增殖的骨髓瘤細胞。可見，本流式方案對 MM 患者骨髓瘤細胞篩查靈敏度高，準確性好。
在本研究所選方案中，除了 EMN 推薦的必選抗體，還搭配了 CD5、CD10 和 HLA-DR 等抗體。CD5 屬泛 T 標志，表達減弱或丟失提示 T 系異常，骨髓 B 系表達 CD5 提示 B 系淋巴瘤等疾病[14]。CD10 在前 B 細胞、前 T 細胞、生發中心 B 細胞和成熟粒細胞均有表達，在 B 系急性淋巴細胞白血病、彌漫大 B 細胞淋巴瘤和Burkitt 淋巴瘤等也有表達[15]。HLA-DR 通常在 B 系急性淋巴細胞白血病時表達。以上淋巴瘤均有 CD38 的表達，但一般弱于骨髓瘤細胞。骨髓瘤細胞不表達 CD5、CD10，少部分表達較弱的 HLA-DR。據此既可以實現 MM 與淋巴瘤的鑒別，也可以發現罕見的合并癥患者，發揮鑒別診斷的作用。此外，方案中 CD56 的表達在 MM 不同 Ig 類型患者間有差異，這提示 CD56 或許能在 MM 的 Ig 分型中發揮作用。但是本流式方案對于 MM 不同 DS 分期無幫助，研究顯示 CD27、CD28 和 CD33 等與 MM 的分期和預后相關[13]，因此，若需了解 MM 患者分期和預后信息，流式方案內應加入這些抗體。
骨髓形態學檢查因其經濟、便捷，是目前應用最廣的血液系統疾病篩查方法。也是國際骨髓瘤工作組納入診斷標準的參考方法之一。本研究將骨髓瘤細胞流式計數比例與同時檢測的形態學比例進行比較后，獲得了良好的一致性，進一步說明了本方案檢測骨髓瘤細胞的準確可靠。同時流式檢測瘤細胞建立在免疫表型分析的客觀基礎上，相比形態學更有利于了解骨髓全貌，有利于與正常或反應性漿細胞以及其他漿細胞病的鑒別。但是鑒于瘤細胞流式計數總是低于形態學[16]，兩種方法結合將更有利于診斷。
