引用本文： 張德雙, 陳娟. 人臍帶間充質干細胞的體外獲取、鑒定及標記. 華西醫學, 2015, 30(11): 2067-2070. doi: 10.7507/1002-0179.20150586 復制
干細胞是一類具有高度分化潛能和自我復制能力的細胞群體，在特定條件下，可分化為多種功能細胞。間充質干細胞（MSC）除具有干細胞的一般特征外，尚有明顯的抗炎、調節免疫、神經保護等多重作用[1-2]，主要來源于骨髓、脂肪、臍帶、臍血等組織，其中，人臍帶間充質干細胞（hUC-MSC）與其他源性MSC相比，具有來源豐富、容易提取、倍增時間短、免疫原性低、移植后長期存活、不涉及倫理問題等多種優點[3]。近年來對hUC-MSC的研究越來越多，其臨床應用已受到醫學研究者們的極大關注。臍帶膠、臍靜脈內皮下及臍血管周圍均富含MSC[4]，其分離成功率高達100%，可作為極佳的MSC來源。但目前hUC-MSC分離方法未有統一標準。我們采用組織塊貼壁法，分離人臍帶MSC，探討該法的可行性。現報告如下。
1 材料與方法
1.1 主要材料、試劑與儀器
臍帶組織購自于四川省干細胞庫。達爾伯克改良Eagle培養基/F12（DMEM/F12培養基）、0.05% 胰蛋白酶/乙二胺四乙酸（0.05% Trpsin/EDTA）購于美國Gibco公司，地塞米松、吲哚美辛、β-磷酸甘油、1-甲基-3-異丁基-黃嘌呤、0.05%胰蛋白酶購于美國Sigma公司，小鼠抗人抗體藻紅蛋白（PE）標記的CD14、CD34、CD45、CD73、CD90、CD79a及異硫氰酸熒光素（FITC）標記的CD105、人類白細胞抗原（HLA）-DR均購于美國BD公司，Brd U、山羊抗小鼠IgG/TRITC購于北京中杉金橋生物技術有限公司，小鼠抗人Brd U抗體購于英國Abcam公司，流式細胞儀購于美國BD公司，5%二氧化碳恒溫培養箱購于美國Thermo公司，DMI4000B倒置熒光顯微鏡、圖像采集系統購于德國徠卡公司。
1.2 實驗方法
1.2.1 細胞的分離、培養
運用組織塊貼壁法[5]從臍帶中分離MSC。在超凈臺上，將臍帶從含雙抗（青霉素100 U/mL + 鏈霉素100 μg/mL）的磷酸鹽緩沖液（PBS）中取出，于平皿中用解剖刀分割成1 cm長的小段，剔除血凝塊，用PBS反復沖洗，洗凈殘血。然后用剪刀剪碎成為1～2 mm3的組織塊，將組織塊平鋪于90 mm細胞培養皿上，加入10 mL DMEM/F12含10%胎牛血清的培養液。根據細胞的生長情況，每3～5天全量換液1次，待細胞達到70%匯合度時，用0.05% Trpsin/EDTA消化，然后按104個/cm2的密度進行傳代接種。傳代培養過程中，每3天全量換液，直至貼壁細胞達到90%匯合度時，重復上述操作進行傳代。
1.2.2 細胞的形態學觀察
將細胞生長良好的培養皿，于倒置顯微鏡下觀察。
1.2.3 細胞表型鑒定
收集P5代培養細胞，棄去培養液，PBS洗滌2次，加入0.05% Trpsin/EDTA常規消化，PBS洗滌后制成濃度為3.0×109/L的單細胞懸液，每個1.5 mL離心管中加入50 μL單細胞懸液，共10管，1號管、2號管為陰性對照，分別加入10 μL抗鼠IgG1-FITC和IgG1-PE單克隆抗體（單抗），其余分別加入抗人PE標記的CD73、CD79a、CD105及FITC標記的CD14、CD34、CD45、CD90、HLA-DR單抗各10 μL，4 ℃孵育30 min。孵育結束后，加入1 mL PBS，洗滌細胞2次。500 μL PBS重懸細胞，流式細胞儀檢測。
1.2.4 體外誘導分化
① 成脂細胞的誘導分化。收集P5代培養細胞，分別以104個/cm2的密度接種到置有血蓋片的24孔板中，待生長至70%匯合度時，在培養基中加入成脂分化誘導物（含0.5 mmol/L的1-甲基-3-異丁基-黃嘌呤，50 μmol/L吲哚辛美與 0.5 μmol/L地塞米松）。每3天更換1次培養基，至2周左右時，取出血蓋片，PBS洗滌2次，4%多聚甲醛固定20 min，油紅O染色30 min后，雙蒸水下沖洗5～10 min，自然晾干，中性樹膠封片。倒置顯微鏡下觀察并采圖。
② 成骨細胞的誘導分化。收集P5代培養細胞，分別以104個/cm2的密度接種到置有血蓋片的24孔板中，待長至70%匯合度時，在培養基中加入成骨分化誘導物（含100 nmol/L地塞米松，2 mmol/L 的β-磷酸甘油與50 μmol/L抗壞血酸），每3天更換1次培養基，至3周左右時，于顯微鏡下觀察，見到不透明區域時，取出血蓋片，PBS洗滌2次，4%多聚甲醛固定20 min，用茜素紅染色 30 min以檢測鈣化基質沉淀，雙蒸水下沖洗5～10 min，自然晾干，中性樹膠封片。倒置顯微鏡下觀察并采圖。
1.2.5 細胞體外標記
細胞傳代后，將Brd U以200 μmol/L加入培養液中。48 h后，進行Brd U免疫熒光檢測其標記是否成功。0.05% Trpsin/ EDTA消化細胞后，將Brd U標記的hUC-MSC用生理鹽水制成濃度為4×104/μL的單細胞混懸液備用。
2 結果
2.1 形態學觀察
臍帶組織塊貼壁后1周左右，于倒置顯微鏡下觀察，可見梭形細胞由組織塊邊緣爬出，細胞折光良好，向外增殖生長，形成集落。見圖 1。
圖1
原代培養第7天倒置顯微鏡下hUC-MSC的形態學觀察（×100）? ?圖 2流式細胞儀檢測hUC-MSC的表面標志物? ?圖 3經成脂誘導后倒置顯微鏡下hUC-MSC的形態學鑒定（油紅O×400） 3a. 油紅O染色陽性 3b. 陰性對照? ?圖 4經成骨誘導后倒置顯微鏡下hUC-MSC的形態學鑒定（茜素紅×400） 4a. 茜素紅染色陽性 4b. 陰性對照 ? ?圖 5免疫熒光鑒定Brd U標記的hUC-MSC（×400） 5a. Brd U標記的hUC-MSC可見紅色熒光 5b. 陰性對照
2.2 免疫表型分析
流式細胞儀檢測結果顯示，hUC-MSC均一地高表達間質細胞特異性標志物CD73、CD90及CD105，不表達或低表達造血系細胞標志物CD14、CD34、CD45及免疫排斥相關性抗原標志物CD79a、HLA-DR。見圖 2。
2.3 體外誘導分化檢測
2.3.1 成脂誘導分化鑒定
P5代細胞，經成脂分化誘導物誘導后，2周左右時，于倒置顯微鏡下觀察，可見細胞質內出現油滴，經油紅O染色后為紅色（圖 3a）；而對照組無油滴出現，經油紅O染色后為陰性（圖 3b）。
2.3.2 成骨誘導分化鑒定
P5代細胞，經成骨分化誘導物誘導后，3周左右時，于倒置顯微鏡下觀察，可見不透明區域，經茜素紅染色后可見密集的紅色沉淀物呈結節狀（圖 4a）；而對照組經茜素紅染色后未見紅色沉淀物沉積（圖 4b）。
2.4 體外標記鑒定
經Brd U標記的hUC-MSC，于熒光顯微鏡下可見紅色熒光（圖 5a）；而對照組未見紅色熒光（圖 5b）。
3 討論
干細胞依據其細胞來源，可分為胚胎干細胞與成體干細胞；依據其分化潛能可分為全能干細胞、多潛能干細胞以及單能干細胞。胚胎干細胞為全能干細胞，于特定培養條件下，具有分化為各種組織的潛能。但隨著近年來研究的不斷深入，人們發現[6]：① 應用胚胎干細胞進行異體移植超越了人類倫理、道德學的范疇；② 應用胚胎干細胞進行異體移植可產生明顯的免疫排斥反應；③ 由于胚胎干細胞的原始性，其具有潛在致瘤性的風險；④ 胚胎干細胞的分離與純化技術存在較大困難[6]。鑒于胚胎干細胞的上述不足，其研究應用受到了一定限制。成體干細胞屬于多潛能干細胞，包括神經干細胞、造血干細胞、脂肪干細胞、內皮干細胞、MSC等多種組織細胞，于特定培養條件下可分化為多種組織。近年來，關于MSC的研究越來越多，其主要來源于骨髓組織，稱為骨髓MSC，但因其數量少、數量及其增殖分化能力隨年齡的增長而逐漸下降、病毒感染率高、取材時易對身體造成損害等不足而限制了其在細胞移植領域中的廣泛應用。而hUC-MSC作為妊娠分娩廢棄物，具有優于其他源性MSC的諸多優點[7-8]，尤其是近年來hUC-MSC研究的諸多突破[9-11]，其有望取代骨髓MSC而成為細胞移植領域中理想的細胞來源。
目前，hUC-MSC的分離方法尚未有統一標準，各實驗室所用方法存在著較大差異。但大多數均能分離出MSC，只是在分離的難易程度、時間與培養條件等方面存在著部分差異。現在國內外常用的分離方法包括組織塊貼壁法[5]、酶消化法[12-14]以及兩種方法的結合使用[15]。本實驗通過組織塊貼壁法成功分離出了MSC，該法經濟、操作簡單，且能很好地保持細胞活力[16]。國內外研究尚未明確臍帶MSC的特異性抗原標志物，通常以細胞形態、流式細胞檢測結果以及多向分化潛能作為其判斷的標準[17]。本研究中，分離所得的hUC-MSC呈貼壁生長，形態似成纖維細胞，流式細胞儀檢測結果示其高表達間質細胞特異性標志物CD73、CD90及CD105，不表達或低表達造血系細胞標志物CD14、CD34、CD45及免疫排斥相關性抗原標志物CD79a、HLA-DR。成脂、成骨分化誘導物誘導后，經油紅O及茜素紅染色后結果表明，其具有脂肪細胞及成骨細胞的分化潛能。由此可見，按照國際細胞治療協會制定的最低標準[18]，我們所分離的細胞是符合MSC的鑒定標準及要求的。實驗中還發現，hUC-MSC可成功于體外被熒光染料Brd U標記，故hUC-MSC可作為極佳的細胞來源用于細胞移植領域的實驗與臨床研究。
綜上所述，運用組織塊貼壁法可成功從人臍帶中分離出MSC，經培養鑒定表明分離所得細胞具備MSC的細胞形態學特點、表面抗原性以及多潛能誘導分化能力。由此，成功獲取hUC-MSC并可于體外被成功標記，可用于臨床移植治療研究與應用。
干細胞是一類具有高度分化潛能和自我復制能力的細胞群體，在特定條件下，可分化為多種功能細胞。間充質干細胞（MSC）除具有干細胞的一般特征外，尚有明顯的抗炎、調節免疫、神經保護等多重作用[1-2]，主要來源于骨髓、脂肪、臍帶、臍血等組織，其中，人臍帶間充質干細胞（hUC-MSC）與其他源性MSC相比，具有來源豐富、容易提取、倍增時間短、免疫原性低、移植后長期存活、不涉及倫理問題等多種優點[3]。近年來對hUC-MSC的研究越來越多，其臨床應用已受到醫學研究者們的極大關注。臍帶膠、臍靜脈內皮下及臍血管周圍均富含MSC[4]，其分離成功率高達100%，可作為極佳的MSC來源。但目前hUC-MSC分離方法未有統一標準。我們采用組織塊貼壁法，分離人臍帶MSC，探討該法的可行性。現報告如下。
1 材料與方法
1.1 主要材料、試劑與儀器
臍帶組織購自于四川省干細胞庫。達爾伯克改良Eagle培養基/F12（DMEM/F12培養基）、0.05% 胰蛋白酶/乙二胺四乙酸（0.05% Trpsin/EDTA）購于美國Gibco公司，地塞米松、吲哚美辛、β-磷酸甘油、1-甲基-3-異丁基-黃嘌呤、0.05%胰蛋白酶購于美國Sigma公司，小鼠抗人抗體藻紅蛋白（PE）標記的CD14、CD34、CD45、CD73、CD90、CD79a及異硫氰酸熒光素（FITC）標記的CD105、人類白細胞抗原（HLA）-DR均購于美國BD公司，Brd U、山羊抗小鼠IgG/TRITC購于北京中杉金橋生物技術有限公司，小鼠抗人Brd U抗體購于英國Abcam公司，流式細胞儀購于美國BD公司，5%二氧化碳恒溫培養箱購于美國Thermo公司，DMI4000B倒置熒光顯微鏡、圖像采集系統購于德國徠卡公司。
1.2 實驗方法
1.2.1 細胞的分離、培養
運用組織塊貼壁法[5]從臍帶中分離MSC。在超凈臺上，將臍帶從含雙抗（青霉素100 U/mL + 鏈霉素100 μg/mL）的磷酸鹽緩沖液（PBS）中取出，于平皿中用解剖刀分割成1 cm長的小段，剔除血凝塊，用PBS反復沖洗，洗凈殘血。然后用剪刀剪碎成為1～2 mm3的組織塊，將組織塊平鋪于90 mm細胞培養皿上，加入10 mL DMEM/F12含10%胎牛血清的培養液。根據細胞的生長情況，每3～5天全量換液1次，待細胞達到70%匯合度時，用0.05% Trpsin/EDTA消化，然后按104個/cm2的密度進行傳代接種。傳代培養過程中，每3天全量換液，直至貼壁細胞達到90%匯合度時，重復上述操作進行傳代。
1.2.2 細胞的形態學觀察
將細胞生長良好的培養皿，于倒置顯微鏡下觀察。
1.2.3 細胞表型鑒定
收集P5代培養細胞，棄去培養液，PBS洗滌2次，加入0.05% Trpsin/EDTA常規消化，PBS洗滌后制成濃度為3.0×109/L的單細胞懸液，每個1.5 mL離心管中加入50 μL單細胞懸液，共10管，1號管、2號管為陰性對照，分別加入10 μL抗鼠IgG1-FITC和IgG1-PE單克隆抗體（單抗），其余分別加入抗人PE標記的CD73、CD79a、CD105及FITC標記的CD14、CD34、CD45、CD90、HLA-DR單抗各10 μL，4 ℃孵育30 min。孵育結束后，加入1 mL PBS，洗滌細胞2次。500 μL PBS重懸細胞，流式細胞儀檢測。
1.2.4 體外誘導分化
① 成脂細胞的誘導分化。收集P5代培養細胞，分別以104個/cm2的密度接種到置有血蓋片的24孔板中，待生長至70%匯合度時，在培養基中加入成脂分化誘導物（含0.5 mmol/L的1-甲基-3-異丁基-黃嘌呤，50 μmol/L吲哚辛美與 0.5 μmol/L地塞米松）。每3天更換1次培養基，至2周左右時，取出血蓋片，PBS洗滌2次，4%多聚甲醛固定20 min，油紅O染色30 min后，雙蒸水下沖洗5～10 min，自然晾干，中性樹膠封片。倒置顯微鏡下觀察并采圖。
② 成骨細胞的誘導分化。收集P5代培養細胞，分別以104個/cm2的密度接種到置有血蓋片的24孔板中，待長至70%匯合度時，在培養基中加入成骨分化誘導物（含100 nmol/L地塞米松，2 mmol/L 的β-磷酸甘油與50 μmol/L抗壞血酸），每3天更換1次培養基，至3周左右時，于顯微鏡下觀察，見到不透明區域時，取出血蓋片，PBS洗滌2次，4%多聚甲醛固定20 min，用茜素紅染色 30 min以檢測鈣化基質沉淀，雙蒸水下沖洗5～10 min，自然晾干，中性樹膠封片。倒置顯微鏡下觀察并采圖。
1.2.5 細胞體外標記
細胞傳代后，將Brd U以200 μmol/L加入培養液中。48 h后，進行Brd U免疫熒光檢測其標記是否成功。0.05% Trpsin/ EDTA消化細胞后，將Brd U標記的hUC-MSC用生理鹽水制成濃度為4×104/μL的單細胞混懸液備用。
2 結果
2.1 形態學觀察
臍帶組織塊貼壁后1周左右，于倒置顯微鏡下觀察，可見梭形細胞由組織塊邊緣爬出，細胞折光良好，向外增殖生長，形成集落。見圖 1。
圖1
原代培養第7天倒置顯微鏡下hUC-MSC的形態學觀察（×100）? ?圖 2流式細胞儀檢測hUC-MSC的表面標志物? ?圖 3經成脂誘導后倒置顯微鏡下hUC-MSC的形態學鑒定（油紅O×400） 3a. 油紅O染色陽性 3b. 陰性對照? ?圖 4經成骨誘導后倒置顯微鏡下hUC-MSC的形態學鑒定（茜素紅×400） 4a. 茜素紅染色陽性 4b. 陰性對照 ? ?圖 5免疫熒光鑒定Brd U標記的hUC-MSC（×400） 5a. Brd U標記的hUC-MSC可見紅色熒光 5b. 陰性對照
2.2 免疫表型分析
流式細胞儀檢測結果顯示，hUC-MSC均一地高表達間質細胞特異性標志物CD73、CD90及CD105，不表達或低表達造血系細胞標志物CD14、CD34、CD45及免疫排斥相關性抗原標志物CD79a、HLA-DR。見圖 2。
2.3 體外誘導分化檢測
2.3.1 成脂誘導分化鑒定
P5代細胞，經成脂分化誘導物誘導后，2周左右時，于倒置顯微鏡下觀察，可見細胞質內出現油滴，經油紅O染色后為紅色（圖 3a）；而對照組無油滴出現，經油紅O染色后為陰性（圖 3b）。
2.3.2 成骨誘導分化鑒定
P5代細胞，經成骨分化誘導物誘導后，3周左右時，于倒置顯微鏡下觀察，可見不透明區域，經茜素紅染色后可見密集的紅色沉淀物呈結節狀（圖 4a）；而對照組經茜素紅染色后未見紅色沉淀物沉積（圖 4b）。
2.4 體外標記鑒定
經Brd U標記的hUC-MSC，于熒光顯微鏡下可見紅色熒光（圖 5a）；而對照組未見紅色熒光（圖 5b）。
3 討論
干細胞依據其細胞來源，可分為胚胎干細胞與成體干細胞；依據其分化潛能可分為全能干細胞、多潛能干細胞以及單能干細胞。胚胎干細胞為全能干細胞，于特定培養條件下，具有分化為各種組織的潛能。但隨著近年來研究的不斷深入，人們發現[6]：① 應用胚胎干細胞進行異體移植超越了人類倫理、道德學的范疇；② 應用胚胎干細胞進行異體移植可產生明顯的免疫排斥反應；③ 由于胚胎干細胞的原始性，其具有潛在致瘤性的風險；④ 胚胎干細胞的分離與純化技術存在較大困難[6]。鑒于胚胎干細胞的上述不足，其研究應用受到了一定限制。成體干細胞屬于多潛能干細胞，包括神經干細胞、造血干細胞、脂肪干細胞、內皮干細胞、MSC等多種組織細胞，于特定培養條件下可分化為多種組織。近年來，關于MSC的研究越來越多，其主要來源于骨髓組織，稱為骨髓MSC，但因其數量少、數量及其增殖分化能力隨年齡的增長而逐漸下降、病毒感染率高、取材時易對身體造成損害等不足而限制了其在細胞移植領域中的廣泛應用。而hUC-MSC作為妊娠分娩廢棄物，具有優于其他源性MSC的諸多優點[7-8]，尤其是近年來hUC-MSC研究的諸多突破[9-11]，其有望取代骨髓MSC而成為細胞移植領域中理想的細胞來源。
目前，hUC-MSC的分離方法尚未有統一標準，各實驗室所用方法存在著較大差異。但大多數均能分離出MSC，只是在分離的難易程度、時間與培養條件等方面存在著部分差異。現在國內外常用的分離方法包括組織塊貼壁法[5]、酶消化法[12-14]以及兩種方法的結合使用[15]。本實驗通過組織塊貼壁法成功分離出了MSC，該法經濟、操作簡單，且能很好地保持細胞活力[16]。國內外研究尚未明確臍帶MSC的特異性抗原標志物，通常以細胞形態、流式細胞檢測結果以及多向分化潛能作為其判斷的標準[17]。本研究中，分離所得的hUC-MSC呈貼壁生長，形態似成纖維細胞，流式細胞儀檢測結果示其高表達間質細胞特異性標志物CD73、CD90及CD105，不表達或低表達造血系細胞標志物CD14、CD34、CD45及免疫排斥相關性抗原標志物CD79a、HLA-DR。成脂、成骨分化誘導物誘導后，經油紅O及茜素紅染色后結果表明，其具有脂肪細胞及成骨細胞的分化潛能。由此可見，按照國際細胞治療協會制定的最低標準[18]，我們所分離的細胞是符合MSC的鑒定標準及要求的。實驗中還發現，hUC-MSC可成功于體外被熒光染料Brd U標記，故hUC-MSC可作為極佳的細胞來源用于細胞移植領域的實驗與臨床研究。
綜上所述，運用組織塊貼壁法可成功從人臍帶中分離出MSC，經培養鑒定表明分離所得細胞具備MSC的細胞形態學特點、表面抗原性以及多潛能誘導分化能力。由此，成功獲取hUC-MSC并可于體外被成功標記，可用于臨床移植治療研究與應用。
