引用本文： 陳亮, 吳波. Toll樣受體7激動劑刺激腎癌患者外周血單個核細胞中免疫相關因子表達的實驗研究. 華西醫學, 2015, 30(11): 2035-2039. doi: 10.7507/1002-0179.20150580 復制
腎癌是起源于腎小管上皮細胞的惡性腫瘤，可發生于腎實質的多個部位[1]。其發病率在泌尿外科腫瘤中僅次于膀胱癌，且腎癌發病率和死亡率在世界范圍內均呈上升趨勢，2012年世界腎癌新發病例和死亡病例分別為27萬人和11萬人[2]，歐洲腎癌發病率在惡性腫瘤中的比例已增至3.2%[2]；且發病年齡也呈下降趨勢，美國腎癌發病的中位年齡由64.7歲降至62.7歲[2]。腎癌的治療主要采取根治性腎切除術，并采取化學療法（化療）方案，但晚期和轉移性腎癌預后較差，且對放射治療（放療）及化療不敏感[3]。目前針對腎癌的新型療法包括細胞因子治療、過繼細胞免疫治療及腫瘤疫苗等，取得了一定的臨床進展[4]。
Toll樣受體（TLR）是人體內重要的模式識別受體，在識別外源性病原體中起重要作用，并通過在固有免疫及適應性免疫中的橋梁作用誘導免疫反應[5]。人體中TLR家族共有10個成員，分別識別不同的病原體成分。TLR還可識別多個內源性配體，并在體內激活TLR通路產生免疫反應[6]。有研究報道可通過TLR8的激動劑，在體內激活白血病外周血細胞，誘導產生針對白血病細胞的免疫反應[7]。過去的研究曾報道TLR通路激活后可活化多個細胞因子及趨化因子參與免疫反應，但是否有更多的免疫相關因子參與激活反應仍不清楚[8]。2013年6月本研究選取1例在我院確診的腎癌患者血樣，分離其外周血單個核細胞（PBMC）后用TLR7的特異激動劑Gardiquimod刺激，用定量聚合酶鏈式反應（PCR）方法檢測PBMC中多個免疫相關因子的表達。現報告如下。
1 資料與方法
1.1 病例介紹
患者?男，56歲。經CT和活體組織病理檢查確診為腎透明細胞癌Ⅲ期，腎癌確診時間為2013年4月，抽取外周血研究時間為2013年6月，確診時未發現炎癥及其他合并癥。
1.2 PBMC分離及刺激
抽取5 mL乙二胺四乙酸抗凝的腎癌患者血液，離心分離血漿（轉速1 500 r/min，離心半徑10 cm，離心時間10 min），將血漿吸入1.5 mL環氧樹脂管中，-80℃保存用于后續研究。剩余血液用4 mL磷酸鹽緩沖液稀釋后，加入淋巴細胞分離液進行梯度離心分離PBMC（轉速2 200 r/min，離心半徑10 cm，離心時間20 min），小心吸取單個核細胞層加入15 mL離心管中，用磷酸鹽緩沖液洗2次（轉速1 500 r/min，離心半徑10 cm，離心時間5 min），將PBMC計數后加入24孔中（2×106/孔）。
TLR7特異激動劑Gardiquimod購自美國Enzo Life Science公司（ALX-420-040），按照操作說明書進行溶解，并按照終濃度10 μg/mL加入腎癌患者PBMC中。
1.3 RNA提取及cDNA合成
Gardiquimod刺激PBMC 4 h后，收集細胞并離心（轉速1 200 r/min，離心半徑10 cm，離心時間5 min），將細胞上清收集并凍存（-80℃）以用于后續實驗。用Trizol法提取細胞總RNA，具體步驟如下：① 在細胞中加入1 mL Trizol，槍尖混勻；② 室溫（15～30 ℃）下靜置5 min后加入0.2 mL氯仿；③ 室溫靜置3 min后離心（離心力12 000×g，離心時間15 min）；④ 吸取上清液至一干凈的管子中加入0.5 mL異丙醇并混勻；⑤ 室溫靜置10 min后離心（離心力12 000×g，離心時間10 min）；⑥ 棄上清液并在沉淀中加入75%乙醇并離心（離心力12 000×g，離心時間5 min）；⑦ 棄上清液，空氣中干燥后，加入100 μL滅菌后的超純水溶解。逆轉錄試劑盒試劑盒（FSQ101）購自北京天根生物公司以完成cDNA合成，逆轉錄程序為：65℃ 5 min，37 ℃15 min，98℃ 5 min，反應體系為：5×RT buffer 4 μL，Primer mix 1 μL，Enzyme mix 1 μL，RNA 14 μL。
1.4 定量PCR檢測
腎癌患者cDNA用超純水按1︰50稀釋后使用。反應體系為20 μL，其中RealMix Master 9 μL，引物1 μL（上游及下游引物各0.5 μL），超純水5 μL，cDNA 5 μL。定量PCR試劑盒購自北京天根生物公司（FP202），反應程序為：第1步：95℃ 30 s；第2步：95℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 30 s（循環40次）；第3步：55～95℃采集熔解曲線。所有反應在貝克曼定量PCR反應儀中完成。所有實驗均重復3次，本實驗采用甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）為PCR反應的內參基因，未刺激的PBMC為實驗的陰性對照。定量PCR檢測的因子有：黏附因子，包括細胞間黏附因子（ICAM）、整合素β（ITGB）、睪丸細胞黏附因子（TCAM）；細胞因子，包括干擾素（IFN）、轉化生長因子（TGF）-β、腫瘤壞死因子（TNF）-α、核因子κB（NF-κB）；白細胞介素（IL）類因子；趨化因子配體，包括CCL和CXCL。PCR擴增引物見表 1。
表1
定量PCR 檢測所用引物
1.5 統計學方法
在Excel軟件中完成均數及標準差的計算；SPSS 17.0軟件進行統計學分析，組間比較采用t檢驗，檢驗水準α=0.05。GraphPad Prism軟件用于圖片制作。
2 結果
2.1 TLR7激動劑對腎癌患者PBMC黏附因子和細胞因子表達的影響
TLR7激動劑刺激下，黏附因子ICAM-1、ICAM-4、ITGB3、ITGB8表達抑制程度有統計學意義（P＜0.05），TCAM-1的表達變化無統計學意義（P＞0.05）。細胞因子檢測時，發現多個重要的細胞因子表達被誘導表達程度有統計學意義（P＜0.05），包括IFN-β、IFN-γ、TGF-β、TNF-α、NF-κB。見圖 1。
圖1
黏附因子和細胞因子的定量PCR檢測
陰性對照為未經TLR7刺激的PBMC，*
2.2 TLR7通路活化上調多個IL類因子表達
經TLR7激動劑Gardiquimod刺激后，腎癌患者PBMC多個IL表達受到明顯的影響，其中被誘導表達具有統計學意義的因子包括IL-1β、IL-2、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10（P＜0.05）；IL-11表達被抑制（P＜0.05），而IL-12和IL-23的表達受影響程度無統計學意義（P＞0.05）。見圖 2。
圖2
IL類因子的基因表達檢測
陰性對照為未經TLR7刺激的PBMC，*
2.3 Gardiquimod影響多個趨化因子的基因表達
Gardiquimod刺激腎癌患者TLR7通路后，誘導表達因子中有統計學意義的包括CXCL10、CCL4、CCL8、CCL11、CCL15、CCL18、CCL20和CCL24（P＜0.05）；而CXCL2、CCL1、CCL7和CCL22的表達被抑制，結果具有統計學意義（P＜0.05）。見圖 3。
圖3
趨化因子表達的定量PCR檢測
陰性對照為未經TLR7刺激的PBMC，*
3 討論
腎癌約占原發性腎臟惡性腫瘤的85%，約占成人惡性腫瘤的5%[9]。在中國泌尿系統腫瘤中，腎癌發病率僅次于膀胱癌，高發年齡段為50～70歲，男性發病率是女性的1.8倍，城市是農村的5.2倍[10]。腎癌的高危發病因素包括肥胖、血液透析，也包括某些高危職業如從事皮革、石棉等工作，另外少數腎癌患者的發病還與遺傳相關[11]。腎癌典型的臨床癥狀是血尿、疼痛和腹部包塊，也稱“腎癌三聯位”，且多發于一側腎臟，僅20%左右為多發腫瘤[2]。腎癌瘤體為外有假包膜的類圓形實性腫瘤，有出血、壞死和鈣化現象[12]。無癥狀腎癌比例約30%，另外約40%患者出現高血壓、體質量減輕、肝細胞異常、凝血機制異常等癥狀，稱為副腫瘤綜合征[13]。腎癌的臨床診斷目前主要依靠影像學檢查，B型超聲是最簡便的方法，常表達為不均質的中低回聲實性腫塊；X線檢查時可見腎體積增大，并可見鈣化現象；CT可顯示腎癌的腫瘤大小、部位及鄰近器官是否受累，因此是目前診斷腎癌的最可靠的影像學方法，增加CT具有表像性及良惡腫瘤的鑒別，并在多數情況下可對腫瘤進行分期；MRI跟CT有相似的診斷準確率，T1加權像腎癌表現不均質的低信號或等信號；T2加權像則為高信號改變[14]。
目前除常規放療和化療外，已有多種治療方式用于腎癌的治療，其中最重要的包括免疫治療和分子靶向治療。免疫治療包括：① 細胞因子治療，目前研究較多的是TNF-α，其通過誘導腫瘤細胞凋亡、改變腫瘤血管通透性來實現抗腫瘤目的。Rosenberg[15]將TNF-α轉染入腫瘤細胞，經體外IL-2擴增后回輸患者，通過高表達外源性TNF-α增加抗腫瘤反應；IFN-α的抗腫瘤機制是進行免疫調節，抑制新血管生成，促進惡性腫瘤細胞表型轉化[16]；IL-2被發現可部分緩解腎癌患者癥狀，但有一定的毒副作用[17]。② 過繼細胞免疫治療，該方法是通過將具有抗腎癌腫瘤細胞的免疫活性細胞輸注給腎癌患者，激發機體免疫反應，主要包括細胞毒性T淋巴細胞、細胞因子誘導的殺傷細胞和樹突狀細胞[18]。③ 腫瘤疫苗，包括自身或同源的腎癌細胞疫苗和樹突狀細胞疫苗[19]。④ 免疫基因治療，包括細胞因子基因治療和自殺基因治療[20]。分子靶向治療中，已開發出多個分子靶向藥物并進入臨床應用：① 多靶點酪氨酸激酶抑制劑，主要有舒尼替尼、埃羅替尼、索拉非尼、吉非替尼等，可通過抑制細胞外信號調節激酶（RAF/MEK/ERK）信號通路直接抑制腫瘤生長，又可通過抑制血管內皮生長因子受體阻斷腫瘤新生血管形成間接抑制腫瘤細胞生長，其中索拉非尼已證實在治療晚期或轉移性肺癌中有效果明顯，有廣譜的抗腫瘤作用；舒拉替尼對多個酪氨酸激酶活性具有抑制作用，這些酪氨酸激酶受體均為跨膜蛋白，功能異常后常導致腎癌發生及轉移，舒尼替尼可阻斷腫瘤生長所需的營養供給，抑制腫瘤生長和血管形成[21]。② 哺乳動物雷帕霉素靶蛋白抑制劑，代表性藥物有雷帕霉素和依維莫司，其中雷帕霉素通過抑制細胞G0期和G1期抑制腫瘤細胞增殖，還可通過凋亡和自噬作用誘導腫瘤細胞死亡，依維莫司通過抑制腫瘤組織和外周循環的單核細胞達到抗腫瘤目的[21]。
TLR是體內重要的模式識別受體，人TLR家族包括10個成員，其中TLR1/2、TLR4、TLR5、TLR6和TLR10定位于細胞表面，可識別多種微生物來源的配體分子；TLR3、TLR7、TLR8和TLR9位于細胞內，主要識別病毒核酸[22]。另外體內組織在損傷狀態下可產生多個內源性配體可活化TLR通路，在調節炎癥反應方面起重要作用，包括熱休克蛋白60/70、硫酸乙酰肝素、透明質酸、纖維連接蛋白、尿酸、氧化低密度脂蛋白、部分內源性細胞碎片、粒細胞蛋白8和14、嗜酸性粒細胞來源神經毒素、抵抗素3等[22]。
TLR的信號通路活化除TLR3外均需髓樣細胞分化蛋白（MyD88）參與。MyD88包含N-端死亡區域，與IL-1R相關激酶（IRAK）4結合，接著磷酸化IRAK1和IRAK2，再活化TNF受體相關因子（TRAF6），被另一IRAK成員IRAK-M抑制。TRAF6是E3泛素結合酶，與泛素連接酶（UBC13）和泛素連接酶1A（UEV1A）結合形成多泛素鏈。TRAF6還可活化TGF-β活化激酶（TAK）并與2個調節蛋白接頭蛋白（TAB）1和TAB 2有關，TAB 2是多泛素鏈受體，使TRAF6和NF-κB必需調節蛋白結合，TAK1磷酸化NF-κB激酶，同時活化MAPK，導致效應元件結合因子磷酸化，最終導致NF-κB的核內轉位。另外還可磷酸化P105（另一個NF-κB家族成員），并使其降解后活化MAP3K8，最后誘導多個炎癥反應因子表達[23]。
以前的研究中發現TLR7的激動劑之一R848可通過增加多個細胞因子表達（IL-6、IL-8、IFN-γ等）來增強慢性粒細胞的免疫原性，從而在體內增強針對白血病腫瘤細胞的免疫反應[24]。本研究分離腎癌患者的PBMC，用TLR7特異激動劑Gardiquimod處理后，檢測PBMC中多個免疫相關因子的變化，以研究TLR7通路在腎癌治療中的潛在價值。本研究選取多個黏附因子、細胞因子和趨化因子，在體內起多種重要的作用，包括免疫和炎癥反應、調節細胞增殖、調節細胞遷移等重要的生物學功能。腎癌患者的PBMC經TLR7激動劑刺激4 h后，多個免疫相關因子明顯受影響，其中黏附相關因子均表現為下調趨勢，提示TLR7活化可增加PBMC的遷移能力；同時上調多個細胞因子、IL類因子和趨化因子表達，表明TLR7活化可明顯增加PBMC的免疫反應。本研究的不足之處在于：① 樣本量過少，本研究選取1例腎癌患者進行初步研究，上調或下調的因子需要在大樣本中進行證實；② 刺激時間為4 h，因此部分遲發性表達因子還未有明顯的變化。
綜上所述，本研究表明腎癌患者PBMC經TLR7激動劑刺激后，多個免疫相關因子被明顯誘導。未來的研究將探索表達受影響的免疫相關因子中哪些是與增強體內抗腫瘤反應相關的，并有望通過活化TLR7通路達到部分抑制腫瘤生長的作用，為腎癌治療提供新的思路。
腎癌是起源于腎小管上皮細胞的惡性腫瘤，可發生于腎實質的多個部位[1]。其發病率在泌尿外科腫瘤中僅次于膀胱癌，且腎癌發病率和死亡率在世界范圍內均呈上升趨勢，2012年世界腎癌新發病例和死亡病例分別為27萬人和11萬人[2]，歐洲腎癌發病率在惡性腫瘤中的比例已增至3.2%[2]；且發病年齡也呈下降趨勢，美國腎癌發病的中位年齡由64.7歲降至62.7歲[2]。腎癌的治療主要采取根治性腎切除術，并采取化學療法（化療）方案，但晚期和轉移性腎癌預后較差，且對放射治療（放療）及化療不敏感[3]。目前針對腎癌的新型療法包括細胞因子治療、過繼細胞免疫治療及腫瘤疫苗等，取得了一定的臨床進展[4]。
Toll樣受體（TLR）是人體內重要的模式識別受體，在識別外源性病原體中起重要作用，并通過在固有免疫及適應性免疫中的橋梁作用誘導免疫反應[5]。人體中TLR家族共有10個成員，分別識別不同的病原體成分。TLR還可識別多個內源性配體，并在體內激活TLR通路產生免疫反應[6]。有研究報道可通過TLR8的激動劑，在體內激活白血病外周血細胞，誘導產生針對白血病細胞的免疫反應[7]。過去的研究曾報道TLR通路激活后可活化多個細胞因子及趨化因子參與免疫反應，但是否有更多的免疫相關因子參與激活反應仍不清楚[8]。2013年6月本研究選取1例在我院確診的腎癌患者血樣，分離其外周血單個核細胞（PBMC）后用TLR7的特異激動劑Gardiquimod刺激，用定量聚合酶鏈式反應（PCR）方法檢測PBMC中多個免疫相關因子的表達。現報告如下。
1 資料與方法
1.1 病例介紹
患者?男，56歲。經CT和活體組織病理檢查確診為腎透明細胞癌Ⅲ期，腎癌確診時間為2013年4月，抽取外周血研究時間為2013年6月，確診時未發現炎癥及其他合并癥。
1.2 PBMC分離及刺激
抽取5 mL乙二胺四乙酸抗凝的腎癌患者血液，離心分離血漿（轉速1 500 r/min，離心半徑10 cm，離心時間10 min），將血漿吸入1.5 mL環氧樹脂管中，-80℃保存用于后續研究。剩余血液用4 mL磷酸鹽緩沖液稀釋后，加入淋巴細胞分離液進行梯度離心分離PBMC（轉速2 200 r/min，離心半徑10 cm，離心時間20 min），小心吸取單個核細胞層加入15 mL離心管中，用磷酸鹽緩沖液洗2次（轉速1 500 r/min，離心半徑10 cm，離心時間5 min），將PBMC計數后加入24孔中（2×106/孔）。
TLR7特異激動劑Gardiquimod購自美國Enzo Life Science公司（ALX-420-040），按照操作說明書進行溶解，并按照終濃度10 μg/mL加入腎癌患者PBMC中。
1.3 RNA提取及cDNA合成
Gardiquimod刺激PBMC 4 h后，收集細胞并離心（轉速1 200 r/min，離心半徑10 cm，離心時間5 min），將細胞上清收集并凍存（-80℃）以用于后續實驗。用Trizol法提取細胞總RNA，具體步驟如下：① 在細胞中加入1 mL Trizol，槍尖混勻；② 室溫（15～30 ℃）下靜置5 min后加入0.2 mL氯仿；③ 室溫靜置3 min后離心（離心力12 000×g，離心時間15 min）；④ 吸取上清液至一干凈的管子中加入0.5 mL異丙醇并混勻；⑤ 室溫靜置10 min后離心（離心力12 000×g，離心時間10 min）；⑥ 棄上清液并在沉淀中加入75%乙醇并離心（離心力12 000×g，離心時間5 min）；⑦ 棄上清液，空氣中干燥后，加入100 μL滅菌后的超純水溶解。逆轉錄試劑盒試劑盒（FSQ101）購自北京天根生物公司以完成cDNA合成，逆轉錄程序為：65℃ 5 min，37 ℃15 min，98℃ 5 min，反應體系為：5×RT buffer 4 μL，Primer mix 1 μL，Enzyme mix 1 μL，RNA 14 μL。
1.4 定量PCR檢測
腎癌患者cDNA用超純水按1︰50稀釋后使用。反應體系為20 μL，其中RealMix Master 9 μL，引物1 μL（上游及下游引物各0.5 μL），超純水5 μL，cDNA 5 μL。定量PCR試劑盒購自北京天根生物公司（FP202），反應程序為：第1步：95℃ 30 s；第2步：95℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 30 s（循環40次）；第3步：55～95℃采集熔解曲線。所有反應在貝克曼定量PCR反應儀中完成。所有實驗均重復3次，本實驗采用甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）為PCR反應的內參基因，未刺激的PBMC為實驗的陰性對照。定量PCR檢測的因子有：黏附因子，包括細胞間黏附因子（ICAM）、整合素β（ITGB）、睪丸細胞黏附因子（TCAM）；細胞因子，包括干擾素（IFN）、轉化生長因子（TGF）-β、腫瘤壞死因子（TNF）-α、核因子κB（NF-κB）；白細胞介素（IL）類因子；趨化因子配體，包括CCL和CXCL。PCR擴增引物見表 1。
表1
定量PCR 檢測所用引物
1.5 統計學方法
在Excel軟件中完成均數及標準差的計算；SPSS 17.0軟件進行統計學分析，組間比較采用t檢驗，檢驗水準α=0.05。GraphPad Prism軟件用于圖片制作。
2 結果
2.1 TLR7激動劑對腎癌患者PBMC黏附因子和細胞因子表達的影響
TLR7激動劑刺激下，黏附因子ICAM-1、ICAM-4、ITGB3、ITGB8表達抑制程度有統計學意義（P＜0.05），TCAM-1的表達變化無統計學意義（P＞0.05）。細胞因子檢測時，發現多個重要的細胞因子表達被誘導表達程度有統計學意義（P＜0.05），包括IFN-β、IFN-γ、TGF-β、TNF-α、NF-κB。見圖 1。
圖1
黏附因子和細胞因子的定量PCR檢測
陰性對照為未經TLR7刺激的PBMC，*
2.2 TLR7通路活化上調多個IL類因子表達
經TLR7激動劑Gardiquimod刺激后，腎癌患者PBMC多個IL表達受到明顯的影響，其中被誘導表達具有統計學意義的因子包括IL-1β、IL-2、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10（P＜0.05）；IL-11表達被抑制（P＜0.05），而IL-12和IL-23的表達受影響程度無統計學意義（P＞0.05）。見圖 2。
圖2
IL類因子的基因表達檢測
陰性對照為未經TLR7刺激的PBMC，*
2.3 Gardiquimod影響多個趨化因子的基因表達
Gardiquimod刺激腎癌患者TLR7通路后，誘導表達因子中有統計學意義的包括CXCL10、CCL4、CCL8、CCL11、CCL15、CCL18、CCL20和CCL24（P＜0.05）；而CXCL2、CCL1、CCL7和CCL22的表達被抑制，結果具有統計學意義（P＜0.05）。見圖 3。
圖3
趨化因子表達的定量PCR檢測
陰性對照為未經TLR7刺激的PBMC，*
3 討論
腎癌約占原發性腎臟惡性腫瘤的85%，約占成人惡性腫瘤的5%[9]。在中國泌尿系統腫瘤中，腎癌發病率僅次于膀胱癌，高發年齡段為50～70歲，男性發病率是女性的1.8倍，城市是農村的5.2倍[10]。腎癌的高危發病因素包括肥胖、血液透析，也包括某些高危職業如從事皮革、石棉等工作，另外少數腎癌患者的發病還與遺傳相關[11]。腎癌典型的臨床癥狀是血尿、疼痛和腹部包塊，也稱“腎癌三聯位”，且多發于一側腎臟，僅20%左右為多發腫瘤[2]。腎癌瘤體為外有假包膜的類圓形實性腫瘤，有出血、壞死和鈣化現象[12]。無癥狀腎癌比例約30%，另外約40%患者出現高血壓、體質量減輕、肝細胞異常、凝血機制異常等癥狀，稱為副腫瘤綜合征[13]。腎癌的臨床診斷目前主要依靠影像學檢查，B型超聲是最簡便的方法，常表達為不均質的中低回聲實性腫塊；X線檢查時可見腎體積增大，并可見鈣化現象；CT可顯示腎癌的腫瘤大小、部位及鄰近器官是否受累，因此是目前診斷腎癌的最可靠的影像學方法，增加CT具有表像性及良惡腫瘤的鑒別，并在多數情況下可對腫瘤進行分期；MRI跟CT有相似的診斷準確率，T1加權像腎癌表現不均質的低信號或等信號；T2加權像則為高信號改變[14]。
目前除常規放療和化療外，已有多種治療方式用于腎癌的治療，其中最重要的包括免疫治療和分子靶向治療。免疫治療包括：① 細胞因子治療，目前研究較多的是TNF-α，其通過誘導腫瘤細胞凋亡、改變腫瘤血管通透性來實現抗腫瘤目的。Rosenberg[15]將TNF-α轉染入腫瘤細胞，經體外IL-2擴增后回輸患者，通過高表達外源性TNF-α增加抗腫瘤反應；IFN-α的抗腫瘤機制是進行免疫調節，抑制新血管生成，促進惡性腫瘤細胞表型轉化[16]；IL-2被發現可部分緩解腎癌患者癥狀，但有一定的毒副作用[17]。② 過繼細胞免疫治療，該方法是通過將具有抗腎癌腫瘤細胞的免疫活性細胞輸注給腎癌患者，激發機體免疫反應，主要包括細胞毒性T淋巴細胞、細胞因子誘導的殺傷細胞和樹突狀細胞[18]。③ 腫瘤疫苗，包括自身或同源的腎癌細胞疫苗和樹突狀細胞疫苗[19]。④ 免疫基因治療，包括細胞因子基因治療和自殺基因治療[20]。分子靶向治療中，已開發出多個分子靶向藥物并進入臨床應用：① 多靶點酪氨酸激酶抑制劑，主要有舒尼替尼、埃羅替尼、索拉非尼、吉非替尼等，可通過抑制細胞外信號調節激酶（RAF/MEK/ERK）信號通路直接抑制腫瘤生長，又可通過抑制血管內皮生長因子受體阻斷腫瘤新生血管形成間接抑制腫瘤細胞生長，其中索拉非尼已證實在治療晚期或轉移性肺癌中有效果明顯，有廣譜的抗腫瘤作用；舒拉替尼對多個酪氨酸激酶活性具有抑制作用，這些酪氨酸激酶受體均為跨膜蛋白，功能異常后常導致腎癌發生及轉移，舒尼替尼可阻斷腫瘤生長所需的營養供給，抑制腫瘤生長和血管形成[21]。② 哺乳動物雷帕霉素靶蛋白抑制劑，代表性藥物有雷帕霉素和依維莫司，其中雷帕霉素通過抑制細胞G0期和G1期抑制腫瘤細胞增殖，還可通過凋亡和自噬作用誘導腫瘤細胞死亡，依維莫司通過抑制腫瘤組織和外周循環的單核細胞達到抗腫瘤目的[21]。
TLR是體內重要的模式識別受體，人TLR家族包括10個成員，其中TLR1/2、TLR4、TLR5、TLR6和TLR10定位于細胞表面，可識別多種微生物來源的配體分子；TLR3、TLR7、TLR8和TLR9位于細胞內，主要識別病毒核酸[22]。另外體內組織在損傷狀態下可產生多個內源性配體可活化TLR通路，在調節炎癥反應方面起重要作用，包括熱休克蛋白60/70、硫酸乙酰肝素、透明質酸、纖維連接蛋白、尿酸、氧化低密度脂蛋白、部分內源性細胞碎片、粒細胞蛋白8和14、嗜酸性粒細胞來源神經毒素、抵抗素3等[22]。
TLR的信號通路活化除TLR3外均需髓樣細胞分化蛋白（MyD88）參與。MyD88包含N-端死亡區域，與IL-1R相關激酶（IRAK）4結合，接著磷酸化IRAK1和IRAK2，再活化TNF受體相關因子（TRAF6），被另一IRAK成員IRAK-M抑制。TRAF6是E3泛素結合酶，與泛素連接酶（UBC13）和泛素連接酶1A（UEV1A）結合形成多泛素鏈。TRAF6還可活化TGF-β活化激酶（TAK）并與2個調節蛋白接頭蛋白（TAB）1和TAB 2有關，TAB 2是多泛素鏈受體，使TRAF6和NF-κB必需調節蛋白結合，TAK1磷酸化NF-κB激酶，同時活化MAPK，導致效應元件結合因子磷酸化，最終導致NF-κB的核內轉位。另外還可磷酸化P105（另一個NF-κB家族成員），并使其降解后活化MAP3K8，最后誘導多個炎癥反應因子表達[23]。
以前的研究中發現TLR7的激動劑之一R848可通過增加多個細胞因子表達（IL-6、IL-8、IFN-γ等）來增強慢性粒細胞的免疫原性，從而在體內增強針對白血病腫瘤細胞的免疫反應[24]。本研究分離腎癌患者的PBMC，用TLR7特異激動劑Gardiquimod處理后，檢測PBMC中多個免疫相關因子的變化，以研究TLR7通路在腎癌治療中的潛在價值。本研究選取多個黏附因子、細胞因子和趨化因子，在體內起多種重要的作用，包括免疫和炎癥反應、調節細胞增殖、調節細胞遷移等重要的生物學功能。腎癌患者的PBMC經TLR7激動劑刺激4 h后，多個免疫相關因子明顯受影響，其中黏附相關因子均表現為下調趨勢，提示TLR7活化可增加PBMC的遷移能力；同時上調多個細胞因子、IL類因子和趨化因子表達，表明TLR7活化可明顯增加PBMC的免疫反應。本研究的不足之處在于：① 樣本量過少，本研究選取1例腎癌患者進行初步研究，上調或下調的因子需要在大樣本中進行證實；② 刺激時間為4 h，因此部分遲發性表達因子還未有明顯的變化。
綜上所述，本研究表明腎癌患者PBMC經TLR7激動劑刺激后，多個免疫相關因子被明顯誘導。未來的研究將探索表達受影響的免疫相關因子中哪些是與增強體內抗腫瘤反應相關的，并有望通過活化TLR7通路達到部分抑制腫瘤生長的作用，為腎癌治療提供新的思路。
