引用本文： 石華, 劉麗紅, 董濤, 王建新, 王泉武. 乙型肝炎病毒e抗體檢測中和試驗的應用評價. 華西醫學, 2015, 30(10): 1930-1932. doi: 10.7507/1002-0179.20150551 復制
乙型肝炎病毒e抗體（抗-HBe）是乙型肝炎病毒（HBV）感染的重要血清學標志物，乙型肝炎病毒e抗原（HBeAg）的消失、抗-HBe的出現，被稱為血清學轉換，是HBV復制水平降低的標志。目前，由于缺少抗-HBe檢測的標準方法，臨床實驗室對可疑標本通常采用不同的方法進行復檢，然而不同檢測方法，甚至相同方法不同試劑檢測抗-HBe常出現不一致的結果[1-2]，給臨床決策造成困擾。參考乙型肝炎病毒表面抗原（HBeAg）和表面抗體以中和試驗作為臨床確認實驗的做法[3]，我們建立了抗-HBe檢測的中和試驗，并初步探討其臨床應用價值。現報告如下。
1 資料與方法
1.1 標本來源
將2013年2月－5月本實驗室采用酶聯免疫吸附試驗（ELISA）法檢測的103份抗-HBe樣本吸光度[A，舊稱光密度（OD）]值與臨界值的比值（S/CO）界于0.8～1.5的標本作為待確認標本，剔除溶血、乳糜及嚴重黃疸標本后將血清儲存于-20℃，其中S/CO界于0.8～1.0的陰性標本44份（S/CO=1.0時為陰性），S/CO界于1.0～1.5的陽性標本59份。
1.2 方法
1.2.1 儀器與試劑
Multiskan Ascent酶標儀（芬蘭雷勃公司）；ROCHE Cobas E-601全自動免疫分析儀而及配套試劑（德國羅氏公司），批號：16799204；科華洗板機（上海科華公司）；HBeAg檢測試劑（上海科華公司），試劑批號：201212021；抗-HBe檢測試劑（上海科華公司），試劑批號：201211020。
1.2.2 試驗方法
① 中和試驗檢測103例抗-HBe待確認血清。② 選取乙型肝炎5項結果均為陰性的標本25份，剔除溶血、乳糜及嚴重黃疸標本，且其他感染性指標均為陰性，充分混勻，作為陰性對照血清。③ 用HBeAg強陽性、抗-HBe陰性的急性乙型肝炎患者血清作為HBeAg陽性中和血清。充分混合后用陰性對照血清將其稀釋為A450 nm 1.5～2.0之間。④ 取50 mL配制好的HBeAg陽性血清與50 mL待測標本充分混勻作為中和組。將50 mL配制好的HBeAg陽性血清與50 mL陰性對照血清充分混勻作為對照組。兩組均在微量振蕩器上充分混勻15 s，然后置37℃ 1 h，再用HBeAg檢測試劑進行檢測，即待測血清中的抗-HBe與微孔板上包被的抗-HBe，及試劑中的酶標抗-HBe，共同競爭結合中和血清中的HBeAg。中和組用復孔檢測，對照組檢測20孔，檢測步驟參照試劑說明書進行。⑤ 結果判定：該方法為中和競爭法，標本中抗-HBe的含量與A值呈反比。以中和組A450 nm≤對照組A450 nm（取20個孔的均值）的50%判斷為抗-HBe具有反應性。⑥ 電化學發光法驗證實驗：將留取的103份標本編號，用隨機數字表法隨機選取72份標本，用ROCHE Cobas E-601 全自動免疫分析儀及配套試劑（德國羅氏公司）進行抗-HBe檢測，檢測步驟及結果判斷依照說明書進行，室內質量控制均應在控。
1.3 統計學方法
本研究為配對設計的計數資料，制作四格表，用SPSS 20.0統計軟件進行數據分析，計算一致性系數（Kappa值）分析不同檢測方法間的一致性[4]，相關計算公式：檢測結果一致率（P0）=（真陽性+真陰性）/n；期望一致率（Pe）=1/n[（真陽性+假陰性）（真陽性+假陽性）+（假陽性+真陰性）（假陰性+真陰性）]；Kappa值=（P0-Pe）/（1-Pe）。再用μ檢驗做假設檢驗（α=0.05），相關計算公式為[5]：
| $\mu = \frac{K}{{Se\left( K \right)}},Se\left( K \right) = \sqrt {\frac{{{P_0}\left( {1 - {P_0}} \right)}}{{N\left( {1 - {P_e}} \right)}}}。$ |
2 結果
2.1 中和試驗確認抗-HBe待確認血清的結果
20個對照孔的A450 nm均值為1.105 6，以其50%（0.552 8）作為臨界點，＜0.552 8為中和試驗有反應性；＞0.552 8為中和試驗無反應性。103份ELISA法抗-HBe處于檢測灰區標本，經中和試驗確認為真陽性的有57份，假陽性2份，真陰性18份，假陰性26份。見表 1。
表1
ELISA與中和試驗檢測結果的比較（份）
2.2 中和試驗經電化學發光法驗證的結果
從103例待確認標本中隨機抽取72份，用電化學發光法對中和試驗的結果進行驗證，將兩種方法的檢測結果制成診斷試驗四格表，經電化學發光法確認為真陽性的34份，假陽性3份，真陰性29份，假陰性6份。見表 2。
表2
電化學發光和中和試驗檢測結果的比較（份）
2.3 統計分析的結果
以中和試驗為基準，ELISA方法檢測抗-HBe的靈敏度為68.67%，特異度為90.00%，總符合率為72.82%。
中和試驗和電化學發光法檢測抗-HBe的P0=87.50%，Pe=50.15%，Kappa值=0.749。μ=13.64，＞95%標準正態分位數1.96，故P＜0.05，可認為兩種檢測方法結果具有一致性。
3 討論
在HBV感染的自然病程中，抗-HBe陰性的HBsAg和乙型肝炎病毒c抗體（抗-HBc）低滴度者被認為是急性期感染，而伴隨抗-HBe陽性者多為恢復期患者。抗-HBe處于檢測灰區的可疑標本，尤其是伴隨HBsAg和抗-HBc低滴度者，其感染狀態較難判斷。灰區的存在是ELISA方法學的重要特征，常導致臨床標本初篩和復檢時結果不一致[6]，用濃度接近臨界值的標本作為評價材料，比用強陽性或低陰性標本更能發現檢測誤差[7]。因此，本研究選擇ELISA法檢測抗-HBe的S/CO值界于0.8～1.5的標本來評價自建中和試驗檢測系統的臨床應用價值。
本研究結果顯示，59份ELISA法抗-HBe陽性標本經中和試驗確認為57份具有反應性；無反應性的2份經電化學發光法檢測也顯示陰性，認為是ELISA法檢測抗-HBe的非特異性反應，為假陽性結果。44份ELISA法抗-HBe陰性標本經中和試驗確認后有26份顯示有反應性，表明該ELISA試劑檢測抗-HBe的漏診率較高。我們的前期研究也表明臨床實驗室用于檢測抗-HBe的不同方法間檢出率差距較大[8]，亟需建立標準化的檢測方法用于確認各實驗室間的不一致結果。
在無“金標準”的情況下，兩種檢測方法的一致性評價常用Kappa檢驗。電化學發光法檢測抗-HBe 是一項成熟的技術，靈敏度和特異度均較好，因此我們將中和試驗與電化學發光法相比較，評價中和試驗的性能。經計算，Kappa值為0.75，說明兩種方法的一致性較好。值得注意的是有4份中和試驗顯示有反應性的標本用電化學發光檢測時為陰性結果，結合病史及其他HBV感染標志物，分析可能是基因重組抗原/抗體的反應特異性較野生株較差所致[9]。
用于中和抗-HBe的HBeAg陽性血清選自抗-HBe陰性的急性HBV感染者的混合血清，血清型較多，有利于不同亞型及變異株的檢出；待測血清與HBeAg陽性血清的預反應形成“優勢競爭”也是自建中和試驗檢測較為靈敏的原因；更加重要的是取自急性感染者的HBeAg與抗-HBe結合的特異性優于基因重組方式制備的抗原[10]；因此，該自建中和試驗檢測系統用于抗-HBe檢測實用、經濟、操作簡便，可作為補充試驗對不確定結果進行確認。
乙型肝炎病毒e抗體（抗-HBe）是乙型肝炎病毒（HBV）感染的重要血清學標志物，乙型肝炎病毒e抗原（HBeAg）的消失、抗-HBe的出現，被稱為血清學轉換，是HBV復制水平降低的標志。目前，由于缺少抗-HBe檢測的標準方法，臨床實驗室對可疑標本通常采用不同的方法進行復檢，然而不同檢測方法，甚至相同方法不同試劑檢測抗-HBe常出現不一致的結果[1-2]，給臨床決策造成困擾。參考乙型肝炎病毒表面抗原（HBeAg）和表面抗體以中和試驗作為臨床確認實驗的做法[3]，我們建立了抗-HBe檢測的中和試驗，并初步探討其臨床應用價值。現報告如下。
1 資料與方法
1.1 標本來源
將2013年2月－5月本實驗室采用酶聯免疫吸附試驗（ELISA）法檢測的103份抗-HBe樣本吸光度[A，舊稱光密度（OD）]值與臨界值的比值（S/CO）界于0.8～1.5的標本作為待確認標本，剔除溶血、乳糜及嚴重黃疸標本后將血清儲存于-20℃，其中S/CO界于0.8～1.0的陰性標本44份（S/CO=1.0時為陰性），S/CO界于1.0～1.5的陽性標本59份。
1.2 方法
1.2.1 儀器與試劑
Multiskan Ascent酶標儀（芬蘭雷勃公司）；ROCHE Cobas E-601全自動免疫分析儀而及配套試劑（德國羅氏公司），批號：16799204；科華洗板機（上海科華公司）；HBeAg檢測試劑（上海科華公司），試劑批號：201212021；抗-HBe檢測試劑（上海科華公司），試劑批號：201211020。
1.2.2 試驗方法
① 中和試驗檢測103例抗-HBe待確認血清。② 選取乙型肝炎5項結果均為陰性的標本25份，剔除溶血、乳糜及嚴重黃疸標本，且其他感染性指標均為陰性，充分混勻，作為陰性對照血清。③ 用HBeAg強陽性、抗-HBe陰性的急性乙型肝炎患者血清作為HBeAg陽性中和血清。充分混合后用陰性對照血清將其稀釋為A450 nm 1.5～2.0之間。④ 取50 mL配制好的HBeAg陽性血清與50 mL待測標本充分混勻作為中和組。將50 mL配制好的HBeAg陽性血清與50 mL陰性對照血清充分混勻作為對照組。兩組均在微量振蕩器上充分混勻15 s，然后置37℃ 1 h，再用HBeAg檢測試劑進行檢測，即待測血清中的抗-HBe與微孔板上包被的抗-HBe，及試劑中的酶標抗-HBe，共同競爭結合中和血清中的HBeAg。中和組用復孔檢測，對照組檢測20孔，檢測步驟參照試劑說明書進行。⑤ 結果判定：該方法為中和競爭法，標本中抗-HBe的含量與A值呈反比。以中和組A450 nm≤對照組A450 nm（取20個孔的均值）的50%判斷為抗-HBe具有反應性。⑥ 電化學發光法驗證實驗：將留取的103份標本編號，用隨機數字表法隨機選取72份標本，用ROCHE Cobas E-601 全自動免疫分析儀及配套試劑（德國羅氏公司）進行抗-HBe檢測，檢測步驟及結果判斷依照說明書進行，室內質量控制均應在控。
1.3 統計學方法
本研究為配對設計的計數資料，制作四格表，用SPSS 20.0統計軟件進行數據分析，計算一致性系數（Kappa值）分析不同檢測方法間的一致性[4]，相關計算公式：檢測結果一致率（P0）=（真陽性+真陰性）/n；期望一致率（Pe）=1/n[（真陽性+假陰性）（真陽性+假陽性）+（假陽性+真陰性）（假陰性+真陰性）]；Kappa值=（P0-Pe）/（1-Pe）。再用μ檢驗做假設檢驗（α=0.05），相關計算公式為[5]：
| $\mu = \frac{K}{{Se\left( K \right)}},Se\left( K \right) = \sqrt {\frac{{{P_0}\left( {1 - {P_0}} \right)}}{{N\left( {1 - {P_e}} \right)}}}。$ |
2 結果
2.1 中和試驗確認抗-HBe待確認血清的結果
20個對照孔的A450 nm均值為1.105 6，以其50%（0.552 8）作為臨界點，＜0.552 8為中和試驗有反應性；＞0.552 8為中和試驗無反應性。103份ELISA法抗-HBe處于檢測灰區標本，經中和試驗確認為真陽性的有57份，假陽性2份，真陰性18份，假陰性26份。見表 1。
表1
ELISA與中和試驗檢測結果的比較（份）
2.2 中和試驗經電化學發光法驗證的結果
從103例待確認標本中隨機抽取72份，用電化學發光法對中和試驗的結果進行驗證，將兩種方法的檢測結果制成診斷試驗四格表，經電化學發光法確認為真陽性的34份，假陽性3份，真陰性29份，假陰性6份。見表 2。
表2
電化學發光和中和試驗檢測結果的比較（份）
2.3 統計分析的結果
以中和試驗為基準，ELISA方法檢測抗-HBe的靈敏度為68.67%，特異度為90.00%，總符合率為72.82%。
中和試驗和電化學發光法檢測抗-HBe的P0=87.50%，Pe=50.15%，Kappa值=0.749。μ=13.64，＞95%標準正態分位數1.96，故P＜0.05，可認為兩種檢測方法結果具有一致性。
3 討論
在HBV感染的自然病程中，抗-HBe陰性的HBsAg和乙型肝炎病毒c抗體（抗-HBc）低滴度者被認為是急性期感染，而伴隨抗-HBe陽性者多為恢復期患者。抗-HBe處于檢測灰區的可疑標本，尤其是伴隨HBsAg和抗-HBc低滴度者，其感染狀態較難判斷。灰區的存在是ELISA方法學的重要特征，常導致臨床標本初篩和復檢時結果不一致[6]，用濃度接近臨界值的標本作為評價材料，比用強陽性或低陰性標本更能發現檢測誤差[7]。因此，本研究選擇ELISA法檢測抗-HBe的S/CO值界于0.8～1.5的標本來評價自建中和試驗檢測系統的臨床應用價值。
本研究結果顯示，59份ELISA法抗-HBe陽性標本經中和試驗確認為57份具有反應性；無反應性的2份經電化學發光法檢測也顯示陰性，認為是ELISA法檢測抗-HBe的非特異性反應，為假陽性結果。44份ELISA法抗-HBe陰性標本經中和試驗確認后有26份顯示有反應性，表明該ELISA試劑檢測抗-HBe的漏診率較高。我們的前期研究也表明臨床實驗室用于檢測抗-HBe的不同方法間檢出率差距較大[8]，亟需建立標準化的檢測方法用于確認各實驗室間的不一致結果。
在無“金標準”的情況下，兩種檢測方法的一致性評價常用Kappa檢驗。電化學發光法檢測抗-HBe 是一項成熟的技術，靈敏度和特異度均較好，因此我們將中和試驗與電化學發光法相比較，評價中和試驗的性能。經計算，Kappa值為0.75，說明兩種方法的一致性較好。值得注意的是有4份中和試驗顯示有反應性的標本用電化學發光檢測時為陰性結果，結合病史及其他HBV感染標志物，分析可能是基因重組抗原/抗體的反應特異性較野生株較差所致[9]。
用于中和抗-HBe的HBeAg陽性血清選自抗-HBe陰性的急性HBV感染者的混合血清，血清型較多，有利于不同亞型及變異株的檢出；待測血清與HBeAg陽性血清的預反應形成“優勢競爭”也是自建中和試驗檢測較為靈敏的原因；更加重要的是取自急性感染者的HBeAg與抗-HBe結合的特異性優于基因重組方式制備的抗原[10]；因此，該自建中和試驗檢測系統用于抗-HBe檢測實用、經濟、操作簡便，可作為補充試驗對不確定結果進行確認。
