引用本文： 陳學兵, 楊家紅, 張浩, 陳皋, 王秀, 羅萬蓉. 乙型肝炎病毒YMDD自然變異合并B、C基因型與乙型肝炎病毒相關肝細胞癌的關系. 華西醫學, 2015, 30(9): 1650-1653. doi: 10.7507/1002-0179.20150471 復制
全球有3.5億人為慢性乙型肝炎病毒（HBV）感染者[1-3]，我國是HBV感染的高流行區，一般人群乙型肝炎表面抗原攜帶率為7.18%，現有慢性HBV感染者約9 300萬人[4-6]。慢性HBV感染可引起一系列從HBV攜帶、慢性肝炎、肝硬化到肝細胞癌（HCC）的肝臟疾病譜[7-8]，也是我國HBV相關HCC的最主要病因[9]。
HBV復制活躍且HBV DNA聚合酶逆轉錄功能區不具備校正功能，使該病毒具有較高的基因突變率。YMDD位點是HBV DNA聚合酶的活性部分，屬高度保守序列。HBV YMDD變異是發生于HBV聚合酶（P基因）中逆轉錄區（RT）C區M204V/I的變異，即HBV野生株YMDD基序中的蛋氨酸（M）被纈氨酸（V）或異亮氨酸（I）所取代，形成YVDD或YIDD變異[10]。目前有關HBV YMDD變異的研究主要集中于拉米夫定治療相關YMDD變異的發生以及該變異對抗病毒療效的影響等方面[11]。近年發現在未經抗病毒治療的慢性HBV感染者中也存在YMDD自然變異[12-14]，而YMDD自然變異與HCC的關系少有文獻報道。HBV基因型也是HBV發生點突變累積而形成的病毒變異模式，文獻報道C基因型與HCC亦存在一定相關性[15-18]，而YMDD自然變異合并不同HBV基因型與HCC的關系目前在國內外尚未見文獻報道。本研究同期納入未經抗病毒治療的HBV相關HCC患者110例以及慢性HBV感染者1 079例，以了解HBV YMDD自然變異合并B、C基因型與HCC的關系。現報告如下。
1 資料與方法
1.1 一般資料
2010年5月－2012年5月在我院感染科診治的慢性HBV感染者及HBV相關HCC患者共1 357例。為保證檢測出HBV基因型及YMDD，設定血清HBV DNA載量≥5.0×103 copies/mL，共1 189例納入本研究。HBV相關HCC患者110例，男92例（83.6%），女18例（16.4%）；年齡30～78歲，平均（52.8±11.2）歲，符合我國《原發性肝癌診療規范（2011年）》的診斷標準[19]。慢性HBV感染者1 079例，男754例，女325例；年齡18～79歲，平均（38.3±12.8）歲，符合我國2000年中華醫學會西安會議修訂的《病毒性肝炎防治方案》的診斷標準[20]。所有納入患者未經任何核苷（酸）類似物治療，排除甲型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、戊型肝炎病毒感染及酒精性肝炎、脂肪性肝病、藥物性肝炎和自身免疫性肝病等其他因素引起的肝臟損傷。本研究經我院醫學倫理委員會審核并批準。
1.2 標本采集
采集患者空腹靜脈血標本，送本院分子生物學實驗室分離血清并于?70℃凍存待測，避免反復凍融。
1.3 儀器與方法
HBV DNA聚合酶鏈式反應（PCR）定量、YMDD突變型核酸檢測試劑盒購自凱杰生物工程（深圳）有限公司，采用瑞士羅氏LightCyclerTM實時熒光定量PCR儀檢測。HBV基因分型PCR檢測試劑盒購自上海復星醫學科技發展有限公司，采用型特異性探針Taqman熒光PCR技術進行HBV B、C基因型分型。HBV血清學標志物檢測試劑盒購自上海華美生物工程公司，采用酶聯免疫吸附試驗檢測。
1.4 統計學方法
應用SPSS 17.0軟件進行統計分析。符合正態分布的計量資料以均數±標準差表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗；計數資料采用例數和百分數表示，組間比較采用獨立樣本χ2檢驗，四格表資料中當1≤T＜5時，采用連續性校正χ2值；采用非條件logistic回歸進行多因素分析，計算比值比（OR）及其95%置信區間（CI）。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 影響HBV相關HCC發生的單因素分析
HBV相關HCC組患者的平均年齡及男性患者比例均高于慢性HBV感染者（P＜0.01）。HBV相關HCC組患者的乙型肝炎e抗原（HBeAg）陽性率低于慢性HBV感染者（P＜0.01）。在110例HBV相關HCC患者中檢出存在YMDD自然變異者16例（14.5%），在1 079例慢性HBV感染者中檢出YMDD自然變異者46例（4.3%），兩組間差異有統計學意義（P＜0.05）。在110例HBV相關HCC患者中檢測出HBV C型基因感染者39例（35.5%），B型基因感染者68例（61.8%）；在1 079例慢性HBV感染患者中檢測出HBV C型基因感染者153例（14.2%），B型基因感染者912例（84.5%）。HBV相關HCC組中C型基因所占比例高于慢性HBV感染組，而B型基因所占比例低于慢性HBV感染組，兩組間差異均有統計學意義（P＜0.05）。在HBV相關HCC組和慢性HBV感染組中分別檢測出YMDD自然變異合并C型基因的比例為12.7% （14/110） 和1.6%（17/1 079），檢測出YMDD自然變異合并B型基因的比例為1.8%（2/110）和2.7%（29/1 079）。HBV相關HCC組中HBV YMDD自然變異合并 C型基因感染者所占的比例明顯高于慢性HBV感染組（P＜0.001），而HBV YMDD自然變異合并 B型基因感染者的比例在兩組間差異無統計學意義（P＞0.05）。見表 1。
表1
影響HBV相關HCC發生的單因素分析結果
2.2 影響HBV相關HCC發生的多因素分析
按P≥0.05作為剔除標準進行非條件logistic 逐步回歸分析顯示，男性患者發生HBV相關HCC的風險高于女性患者[OR=2.719，95%CI（1.530，4.833），P=0.001]，年齡≥40歲患者的風險高于＜40歲患者[OR=7.327，95%CI（4.201，12.782），P＜0.001]，HBV C型基因感染者的風險高于非C型基因[OR=2.943，95%CI（1.778，4.872），P＜0.001]，YMDD自然變異合并C型基因的感染者發生HBV相關HCC的風險高于不具有該特征的患者[OR=5.989，95%CI（2.394，14.980），P＜0.001]。而患者的HBeAg狀態、HBV DNA載量、YMDD自然變異以及YMDD自然變異合并B型基因未能進入回歸模型。見表 2。
表2
影響HBV相關HBV相關HCC發生的多因素分析結果
3 討論
HBV復制活躍且HBV DNA聚合酶逆轉錄區不具備校正功能，因此該病毒易發生基因突變。最初的研究認為拉米夫定可導致HBV P基因逆轉錄區C區YMDD基序發生變異，但發生變異的機制目前尚不清楚。進一步的研究發現，在未經拉米夫定治療的慢性HBV感染者中也存在一定比例的HBV YMDD變異株[12-14]。Hosaka等[21]研究表明拉米夫定相關YMDD變異與HCC的發生有關。本研究結果顯示HCC患者的YMDD自然變異率明顯高于慢性HBV感染者，提示HBV YMDD自然變異與HCC的發生可能有關。進一步的非條件logistic回歸分析顯示，HBV YMDD自然變異并非HCC發生的獨立危險因素，與Hosaka等[21]的研究結果存在差異。本研究中納入患者均為YMDD自然變異患者，藥物誘導YMDD變異與自然YMDD變異在致癌性方面是否存在一定的差異，還有待進一步深入研究。
文獻報道HBV C基因型可引發肝臟出現持續的壞死性炎癥反應，從而導致HCC的發生[22]。本研究1 079例慢性HBV感染患者中C型基因構成比為14.2%，110例HBV相關HCC患者中HBVC型基因構成比為35.5%。HCC患者中HBV C型基因比例顯著高于慢性HBV感染者，差異有統計學意義（P＜0.05），表明HBV C型基因與HCC的發生可能有關。進一步的非條件logistic回歸分析顯示，HBV C型基因感染者發生HCC的風險高于非C型基因[OR=2.943，95%CI（1.778，4.872），P＜0.001]，表明HBV C型基因感染是HBV相關HCC的獨立危險因素，與既往文獻報道結果[15-18]相似。推測原因可能由于HBV基因型的不同而存在不同的病毒表型，影響其生物學特性及致病性，從而在臨床中表現出不同的致癌性。
本研究結果顯示，HCC組中HBV YMDD自然變異合并C型基因感染者所占的比例明顯高于慢性HBV感染者，差異有統計學顯意義（P＜0.05）。進一步非條件logistic回歸分析發現，HBV YMDD自然變異合并C型基因發生HCC的風險明顯高于不具有該特征的患者[OR=5.989，95%CI（2.394，14.980），P＜0.001]，表明YMDD自然變異合并C型基因是HBV相關HCC發生的獨立危險因素。HBV YMDD自然變異及基因型均是因HBV發生變異而形成的。HBV聚合酶（P基因）逆轉錄區的突變及不同基因型可能導致HBV相應氨基酸及其蛋白質空間構象發生改變，從而引起HBV生物學特性發生變化，進而對疾病的發生發展產生影響，增加致癌性。
本研究提示HBV YMDD自然變異合并C型基因感染是HBV相關HCC發生的獨立危險因素，為下一步深入研究慢性HBV感染發生HBV相關HCC的分子生物學機制提供了重要的研究基礎，對早期篩查HBV相關HCC高危人群具有重要的臨床應用價值。
全球有3.5億人為慢性乙型肝炎病毒（HBV）感染者[1-3]，我國是HBV感染的高流行區，一般人群乙型肝炎表面抗原攜帶率為7.18%，現有慢性HBV感染者約9 300萬人[4-6]。慢性HBV感染可引起一系列從HBV攜帶、慢性肝炎、肝硬化到肝細胞癌（HCC）的肝臟疾病譜[7-8]，也是我國HBV相關HCC的最主要病因[9]。
HBV復制活躍且HBV DNA聚合酶逆轉錄功能區不具備校正功能，使該病毒具有較高的基因突變率。YMDD位點是HBV DNA聚合酶的活性部分，屬高度保守序列。HBV YMDD變異是發生于HBV聚合酶（P基因）中逆轉錄區（RT）C區M204V/I的變異，即HBV野生株YMDD基序中的蛋氨酸（M）被纈氨酸（V）或異亮氨酸（I）所取代，形成YVDD或YIDD變異[10]。目前有關HBV YMDD變異的研究主要集中于拉米夫定治療相關YMDD變異的發生以及該變異對抗病毒療效的影響等方面[11]。近年發現在未經抗病毒治療的慢性HBV感染者中也存在YMDD自然變異[12-14]，而YMDD自然變異與HCC的關系少有文獻報道。HBV基因型也是HBV發生點突變累積而形成的病毒變異模式，文獻報道C基因型與HCC亦存在一定相關性[15-18]，而YMDD自然變異合并不同HBV基因型與HCC的關系目前在國內外尚未見文獻報道。本研究同期納入未經抗病毒治療的HBV相關HCC患者110例以及慢性HBV感染者1 079例，以了解HBV YMDD自然變異合并B、C基因型與HCC的關系。現報告如下。
1 資料與方法
1.1 一般資料
2010年5月－2012年5月在我院感染科診治的慢性HBV感染者及HBV相關HCC患者共1 357例。為保證檢測出HBV基因型及YMDD，設定血清HBV DNA載量≥5.0×103 copies/mL，共1 189例納入本研究。HBV相關HCC患者110例，男92例（83.6%），女18例（16.4%）；年齡30～78歲，平均（52.8±11.2）歲，符合我國《原發性肝癌診療規范（2011年）》的診斷標準[19]。慢性HBV感染者1 079例，男754例，女325例；年齡18～79歲，平均（38.3±12.8）歲，符合我國2000年中華醫學會西安會議修訂的《病毒性肝炎防治方案》的診斷標準[20]。所有納入患者未經任何核苷（酸）類似物治療，排除甲型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、戊型肝炎病毒感染及酒精性肝炎、脂肪性肝病、藥物性肝炎和自身免疫性肝病等其他因素引起的肝臟損傷。本研究經我院醫學倫理委員會審核并批準。
1.2 標本采集
采集患者空腹靜脈血標本，送本院分子生物學實驗室分離血清并于?70℃凍存待測，避免反復凍融。
1.3 儀器與方法
HBV DNA聚合酶鏈式反應（PCR）定量、YMDD突變型核酸檢測試劑盒購自凱杰生物工程（深圳）有限公司，采用瑞士羅氏LightCyclerTM實時熒光定量PCR儀檢測。HBV基因分型PCR檢測試劑盒購自上海復星醫學科技發展有限公司，采用型特異性探針Taqman熒光PCR技術進行HBV B、C基因型分型。HBV血清學標志物檢測試劑盒購自上海華美生物工程公司，采用酶聯免疫吸附試驗檢測。
1.4 統計學方法
應用SPSS 17.0軟件進行統計分析。符合正態分布的計量資料以均數±標準差表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗；計數資料采用例數和百分數表示，組間比較采用獨立樣本χ2檢驗，四格表資料中當1≤T＜5時，采用連續性校正χ2值；采用非條件logistic回歸進行多因素分析，計算比值比（OR）及其95%置信區間（CI）。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 影響HBV相關HCC發生的單因素分析
HBV相關HCC組患者的平均年齡及男性患者比例均高于慢性HBV感染者（P＜0.01）。HBV相關HCC組患者的乙型肝炎e抗原（HBeAg）陽性率低于慢性HBV感染者（P＜0.01）。在110例HBV相關HCC患者中檢出存在YMDD自然變異者16例（14.5%），在1 079例慢性HBV感染者中檢出YMDD自然變異者46例（4.3%），兩組間差異有統計學意義（P＜0.05）。在110例HBV相關HCC患者中檢測出HBV C型基因感染者39例（35.5%），B型基因感染者68例（61.8%）；在1 079例慢性HBV感染患者中檢測出HBV C型基因感染者153例（14.2%），B型基因感染者912例（84.5%）。HBV相關HCC組中C型基因所占比例高于慢性HBV感染組，而B型基因所占比例低于慢性HBV感染組，兩組間差異均有統計學意義（P＜0.05）。在HBV相關HCC組和慢性HBV感染組中分別檢測出YMDD自然變異合并C型基因的比例為12.7% （14/110） 和1.6%（17/1 079），檢測出YMDD自然變異合并B型基因的比例為1.8%（2/110）和2.7%（29/1 079）。HBV相關HCC組中HBV YMDD自然變異合并 C型基因感染者所占的比例明顯高于慢性HBV感染組（P＜0.001），而HBV YMDD自然變異合并 B型基因感染者的比例在兩組間差異無統計學意義（P＞0.05）。見表 1。
表1
影響HBV相關HCC發生的單因素分析結果
2.2 影響HBV相關HCC發生的多因素分析
按P≥0.05作為剔除標準進行非條件logistic 逐步回歸分析顯示，男性患者發生HBV相關HCC的風險高于女性患者[OR=2.719，95%CI（1.530，4.833），P=0.001]，年齡≥40歲患者的風險高于＜40歲患者[OR=7.327，95%CI（4.201，12.782），P＜0.001]，HBV C型基因感染者的風險高于非C型基因[OR=2.943，95%CI（1.778，4.872），P＜0.001]，YMDD自然變異合并C型基因的感染者發生HBV相關HCC的風險高于不具有該特征的患者[OR=5.989，95%CI（2.394，14.980），P＜0.001]。而患者的HBeAg狀態、HBV DNA載量、YMDD自然變異以及YMDD自然變異合并B型基因未能進入回歸模型。見表 2。
表2
影響HBV相關HBV相關HCC發生的多因素分析結果
3 討論
HBV復制活躍且HBV DNA聚合酶逆轉錄區不具備校正功能，因此該病毒易發生基因突變。最初的研究認為拉米夫定可導致HBV P基因逆轉錄區C區YMDD基序發生變異，但發生變異的機制目前尚不清楚。進一步的研究發現，在未經拉米夫定治療的慢性HBV感染者中也存在一定比例的HBV YMDD變異株[12-14]。Hosaka等[21]研究表明拉米夫定相關YMDD變異與HCC的發生有關。本研究結果顯示HCC患者的YMDD自然變異率明顯高于慢性HBV感染者，提示HBV YMDD自然變異與HCC的發生可能有關。進一步的非條件logistic回歸分析顯示，HBV YMDD自然變異并非HCC發生的獨立危險因素，與Hosaka等[21]的研究結果存在差異。本研究中納入患者均為YMDD自然變異患者，藥物誘導YMDD變異與自然YMDD變異在致癌性方面是否存在一定的差異，還有待進一步深入研究。
文獻報道HBV C基因型可引發肝臟出現持續的壞死性炎癥反應，從而導致HCC的發生[22]。本研究1 079例慢性HBV感染患者中C型基因構成比為14.2%，110例HBV相關HCC患者中HBVC型基因構成比為35.5%。HCC患者中HBV C型基因比例顯著高于慢性HBV感染者，差異有統計學意義（P＜0.05），表明HBV C型基因與HCC的發生可能有關。進一步的非條件logistic回歸分析顯示，HBV C型基因感染者發生HCC的風險高于非C型基因[OR=2.943，95%CI（1.778，4.872），P＜0.001]，表明HBV C型基因感染是HBV相關HCC的獨立危險因素，與既往文獻報道結果[15-18]相似。推測原因可能由于HBV基因型的不同而存在不同的病毒表型，影響其生物學特性及致病性，從而在臨床中表現出不同的致癌性。
本研究結果顯示，HCC組中HBV YMDD自然變異合并C型基因感染者所占的比例明顯高于慢性HBV感染者，差異有統計學顯意義（P＜0.05）。進一步非條件logistic回歸分析發現，HBV YMDD自然變異合并C型基因發生HCC的風險明顯高于不具有該特征的患者[OR=5.989，95%CI（2.394，14.980），P＜0.001]，表明YMDD自然變異合并C型基因是HBV相關HCC發生的獨立危險因素。HBV YMDD自然變異及基因型均是因HBV發生變異而形成的。HBV聚合酶（P基因）逆轉錄區的突變及不同基因型可能導致HBV相應氨基酸及其蛋白質空間構象發生改變，從而引起HBV生物學特性發生變化，進而對疾病的發生發展產生影響，增加致癌性。
本研究提示HBV YMDD自然變異合并C型基因感染是HBV相關HCC發生的獨立危險因素，為下一步深入研究慢性HBV感染發生HBV相關HCC的分子生物學機制提供了重要的研究基礎，對早期篩查HBV相關HCC高危人群具有重要的臨床應用價值。
