引用本文： 楊昆, 閆靜, 黃曉麗. p38絲裂原活化蛋白激酶抑制劑對葡聚糖硫酸鈉誘導的潰瘍性結腸炎大鼠結腸傳輸功能的影響. 華西醫學, 2015, 30(8): 1505-1507. doi: 10.7507/1002-0179.20150431 復制
潰瘍性結腸炎（UC）是一種腸道慢性非特異性炎癥性疾病，病變主要累及結腸的黏膜層及黏膜下層，屬于炎癥性腸病的一種類型[1]。結腸動力障礙是UC的常見并發癥之一[2]，但其具體發病機制尚不十分清楚，也缺乏明確有效的治療方法。因此，對于UC所致腸道動力障礙發病機制的進一步研究并開發新的治療方法在臨床上具有重要意義。
近年來大量研究證實，腸道動力障礙與腸道炎癥之間存在密切聯系[3-6]。p38絲裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶大家族的成員之一，在調節炎癥反應中起著重要作用[7-8]。活化的p38MAPK通過調節基因表達產生大量的炎性介質，因此阻斷p38MAPK信號通路可能有助于治療腸道炎癥，從而改善腸道動力障礙。本研究通過觀察p38MAPK抑制劑SB203580對大鼠結腸炎模型的影響，探討腸道炎癥在腸道動力障礙中的作用以及SB203580是否能改善腸道炎癥及其所導致的腸道動力障礙，并為SB203580作為UC及腸道動力障礙的治療藥物提供實驗依據。現報告如下。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 實驗動物
雄性成年Sprague-Dawley（SD）大鼠34只（購于四川大學實驗動物中心），大鼠體質量為200～250 g。
1.1.2 主要試劑及儀器
SB203580（美國Sigma公司），葡聚糖硫酸鈉（DSS，德國MP Biomedicals公司），分光光度計（CA）。
1.2 方法
1.2.1 分組及給藥
用標準的實驗動物大鼠飼料（由四川大學實驗動物中心生產）喂養大鼠，讓其自由進食。飼養室內的溫度為25℃，濕度為30%～60%，每天光照周期為12 h。用隨機數字表將34只大鼠分為4個組：正常對照組（正常組，n=8），DSS模型組（DSS組，n=8），DSS+生理鹽水組（DSS+NS組，n=9），DSS+SB203580干預組（SB203580組，n=9）。正常組大鼠每日用大鼠飼料和蒸餾水喂養，其余3組的大鼠參照Cooper等[9]的方法構建DSS結腸炎模型：將DSS溶于蒸餾水中配置成5%DSS溶液，讓SD大鼠自由飲用7 d。參照Hollenbach等[10]的方法，SB203580組大鼠在飲用5%DSS溶液72 h以后，每天予以SB203580 （1 mg/kg體質量）進行腹腔注射。DSS+NS組大鼠在飲用5%DSS溶液72 h以后，每天予以相同體積的生理鹽水進行腹腔注射。7 d后麻醉下處死大鼠。該實驗得到四川大學華西醫院醫學倫理委員會批準。
1.2.2 觀察指標
根據Murthy等[11]的方法，通過觀察大鼠的體質量、活動情況、大便性狀及便血情況，對大鼠進行疾病活動指數（DAI）評分，以評估大鼠結腸炎的疾病活動情況，見表 1。大便形狀標準：正常大便：成形大便；松散大便：不黏附于肛門的糊狀、半成形便；稀便：可附于肛門的稀水樣便。DAI=（體質量下降分數+大便性狀分數+便血分數）/3。
表1
DAI評分標準
1.2.3 結腸傳輸功能的測定
根據Izbeki等[12]的方法，用酚紅法測定SD大鼠的結腸傳輸功能：通過插入大鼠結腸內的導管，將1.5 mL酚紅溶液（含不可吸收的酚紅0.75 mg）注入大鼠結腸內，再用0.5 mL生理鹽水沖洗導管。90 min后，在麻醉下處死大鼠，并將大鼠結腸從肛門到盲腸端剪下，均分成6段并編號。同時將每只大鼠肛門排出的內容物編號為第7段以檢測其中可能存在的酚紅。將每個腸段（包括肛門排出物）分別加入100 mL 0.1N 氫氧化鈉（NaOH），勻漿，在室溫下放置1 h后，取混懸液5 mL，加入三氯乙酸（20%W/V）以去蛋白；以3 000 r/min 的速度低溫離心20 min；取上清液2 mL，加入2 mL 0.5N NaOH；用分光光度計在560 nm處比色，檢測吸光率，計算腸道組織中酚紅的含量。SD大鼠的結腸傳輸功能以酚紅分布的幾何中心（Geometric center）來表示，其計算公式為：Geometric center=Σ（counts of phenol red per segment × A segment number） [13]。
1.3 統計學方法
采用SPSS 19.0統計軟件進行數據分析，本實驗所有數據均為計量資料，采用均數±標準差表示，采用單因素方差分析及兩兩比較（SNK-q或Dunnett-t檢驗）。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 實驗動物的觀察和DAI評分
正常組大鼠在精神、飲食、活動及大便性狀方面均正常，體質量有不同程度增加。而飲用5%DSS溶液的各組大鼠在第3天就開始出現精神萎靡，活動量減少、厭食，同時大便松散、隱血陽性，體質量也開始下降；第4天開始出現大便性狀的進一步改變，主要表現為開始出現腹瀉，隱血強陽性，體質量進一步下降；第5天時則出現了水樣便及肉眼血便。隨著時間延長，結腸炎小鼠的癥狀逐漸加重。而在SB203580干預組，小鼠的癥狀明顯減輕。各組大鼠的DAI評分發現：DSS組和DSS+NS組的DAI評分分別為（4.54±0.58）和（4.28±0.53）分，比正常組明顯升高，SB203580組DAI評分為（1.21±0.42）分，較DSS組和DSS+NS組明顯下降（P＜0.05），而DSS組和DSS+NS組之間的DAI評分差異無統計學意義（P＞0.05）。
2.2 結腸傳輸功能的測定
用酚紅法測定SD大鼠的結腸傳輸功能，在給予5%DSS溶液喂養后，SD大鼠的結腸傳輸功能明顯延遲（P＜0.05），經SB203580干預后，大鼠結腸傳輸功能明顯改善（P＜0.05），DSS組和DSS+NS組之間大鼠結腸傳輸功能差異無統計學意義（P＞0.05），見圖 1。
圖1
各組大鼠結腸傳輸功能
*與對照組比較，
3 討論
UC患者常常出現腸道動力障礙，包括平滑肌收縮能力降低、低頻振幅收縮增加、傳輸功能障礙等，其中腸道傳輸功能障礙研究最多[14-15]。腸道動力障礙的病因復雜，其發病機制尚未闡述清楚。大量研究顯示腸道炎癥與腸道動力障礙的發生密切相關。有研究發現，在狗的回腸炎模型中，腸道的移行復合運動頻率減弱[16]。另一項研究也顯示，腸腔內白細胞的募集導致腸道平滑肌功能的抑制，而隨著白細胞募集的衰減，腸道的平滑肌功能可以恢復[17]。這些研究都表明，腸道炎癥參與了腸道傳輸功能障礙的發病過程。因此我們推測，有效控制腸道的炎癥將能顯著改善腸道的傳輸功能障礙。事實上，我們的研究也發現，當用SB203580阻斷p38MAPK信號通路后，DSS誘導的結腸炎大鼠腸道炎癥得到改善，其延緩的結腸傳輸功能得到了顯著改善。
MAPK是細胞外信號引起細胞反應的一個共同通路，參與了細胞生長、發育、分裂、死亡等多種生理過程。p38MAPK作為MAPK家族的重要成員之一，幾乎參與了機體內所有的生理及病理過程，而它在介導炎癥、應激等細胞反應中的作用尤其引人關注。生理情況下，p38MAPK活性很低，主要位于細胞質內。而活化的p38MAPK可進入細胞核，通過磷酸化激活多種轉錄因子，誘導基因轉錄，產生大量的促炎因子，如誘導型一氧化氮合酶、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和白細胞介素-1β等[18-19]。有研究發現，p38MPAK的活性在UC患者中較正常人明顯升高，且與炎癥的程度呈正相關[20]。p38MAPK在調控促炎因子產生的機制中起著重要作用，因此如果抑制該信號通路，可能就會抑制促炎性細胞因子的產生，從而緩解炎癥所致的腸道動力障礙。用SB203580與炎癥性腸病患者的腸黏膜活體檢查組織共同孵育后，其TNF-α的含量明顯下降，且這種下降與SB203580的濃度呈現出劑量正相關關系[20]。我們的研究也發現，SB203580能降低DSS誘導的結腸炎大鼠的DAI評分，抑制腸道炎癥反應，從而改善結腸炎大鼠的腸道動力障礙。眾所周知，SB203580是p38MAPK的特異性抑制劑，是一種人工合成的吡啶咪唑類復合物，對于腸道動力并無直接的藥理學作用。本研究發現SB203580確實能改善DSS誘導的結腸炎大鼠的腸道動力障礙，這可能與SB203580抑制p38MAPK信號通路，減輕腸道炎癥反應有關。SB203580改善腸道傳輸功能的具體的作用機制需要進行進一步研究。
總之，DSS誘導的結腸炎大鼠的DAI評分明顯升高且結腸傳輸功能明顯下降，經SB203580處理后，大鼠的DAI評分下降，結腸傳輸功能也得到改善。說明p38MAPK信號通路可能參與了UC炎癥及腸道動力障礙的發病過程，p38MAPK可能成為治療UC及其腸道動力障礙的新靶點。
潰瘍性結腸炎（UC）是一種腸道慢性非特異性炎癥性疾病，病變主要累及結腸的黏膜層及黏膜下層，屬于炎癥性腸病的一種類型[1]。結腸動力障礙是UC的常見并發癥之一[2]，但其具體發病機制尚不十分清楚，也缺乏明確有效的治療方法。因此，對于UC所致腸道動力障礙發病機制的進一步研究并開發新的治療方法在臨床上具有重要意義。
近年來大量研究證實，腸道動力障礙與腸道炎癥之間存在密切聯系[3-6]。p38絲裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶大家族的成員之一，在調節炎癥反應中起著重要作用[7-8]。活化的p38MAPK通過調節基因表達產生大量的炎性介質，因此阻斷p38MAPK信號通路可能有助于治療腸道炎癥，從而改善腸道動力障礙。本研究通過觀察p38MAPK抑制劑SB203580對大鼠結腸炎模型的影響，探討腸道炎癥在腸道動力障礙中的作用以及SB203580是否能改善腸道炎癥及其所導致的腸道動力障礙，并為SB203580作為UC及腸道動力障礙的治療藥物提供實驗依據。現報告如下。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 實驗動物
雄性成年Sprague-Dawley（SD）大鼠34只（購于四川大學實驗動物中心），大鼠體質量為200～250 g。
1.1.2 主要試劑及儀器
SB203580（美國Sigma公司），葡聚糖硫酸鈉（DSS，德國MP Biomedicals公司），分光光度計（CA）。
1.2 方法
1.2.1 分組及給藥
用標準的實驗動物大鼠飼料（由四川大學實驗動物中心生產）喂養大鼠，讓其自由進食。飼養室內的溫度為25℃，濕度為30%～60%，每天光照周期為12 h。用隨機數字表將34只大鼠分為4個組：正常對照組（正常組，n=8），DSS模型組（DSS組，n=8），DSS+生理鹽水組（DSS+NS組，n=9），DSS+SB203580干預組（SB203580組，n=9）。正常組大鼠每日用大鼠飼料和蒸餾水喂養，其余3組的大鼠參照Cooper等[9]的方法構建DSS結腸炎模型：將DSS溶于蒸餾水中配置成5%DSS溶液，讓SD大鼠自由飲用7 d。參照Hollenbach等[10]的方法，SB203580組大鼠在飲用5%DSS溶液72 h以后，每天予以SB203580 （1 mg/kg體質量）進行腹腔注射。DSS+NS組大鼠在飲用5%DSS溶液72 h以后，每天予以相同體積的生理鹽水進行腹腔注射。7 d后麻醉下處死大鼠。該實驗得到四川大學華西醫院醫學倫理委員會批準。
1.2.2 觀察指標
根據Murthy等[11]的方法，通過觀察大鼠的體質量、活動情況、大便性狀及便血情況，對大鼠進行疾病活動指數（DAI）評分，以評估大鼠結腸炎的疾病活動情況，見表 1。大便形狀標準：正常大便：成形大便；松散大便：不黏附于肛門的糊狀、半成形便；稀便：可附于肛門的稀水樣便。DAI=（體質量下降分數+大便性狀分數+便血分數）/3。
表1
DAI評分標準
1.2.3 結腸傳輸功能的測定
根據Izbeki等[12]的方法，用酚紅法測定SD大鼠的結腸傳輸功能：通過插入大鼠結腸內的導管，將1.5 mL酚紅溶液（含不可吸收的酚紅0.75 mg）注入大鼠結腸內，再用0.5 mL生理鹽水沖洗導管。90 min后，在麻醉下處死大鼠，并將大鼠結腸從肛門到盲腸端剪下，均分成6段并編號。同時將每只大鼠肛門排出的內容物編號為第7段以檢測其中可能存在的酚紅。將每個腸段（包括肛門排出物）分別加入100 mL 0.1N 氫氧化鈉（NaOH），勻漿，在室溫下放置1 h后，取混懸液5 mL，加入三氯乙酸（20%W/V）以去蛋白；以3 000 r/min 的速度低溫離心20 min；取上清液2 mL，加入2 mL 0.5N NaOH；用分光光度計在560 nm處比色，檢測吸光率，計算腸道組織中酚紅的含量。SD大鼠的結腸傳輸功能以酚紅分布的幾何中心（Geometric center）來表示，其計算公式為：Geometric center=Σ（counts of phenol red per segment × A segment number） [13]。
1.3 統計學方法
采用SPSS 19.0統計軟件進行數據分析，本實驗所有數據均為計量資料，采用均數±標準差表示，采用單因素方差分析及兩兩比較（SNK-q或Dunnett-t檢驗）。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 實驗動物的觀察和DAI評分
正常組大鼠在精神、飲食、活動及大便性狀方面均正常，體質量有不同程度增加。而飲用5%DSS溶液的各組大鼠在第3天就開始出現精神萎靡，活動量減少、厭食，同時大便松散、隱血陽性，體質量也開始下降；第4天開始出現大便性狀的進一步改變，主要表現為開始出現腹瀉，隱血強陽性，體質量進一步下降；第5天時則出現了水樣便及肉眼血便。隨著時間延長，結腸炎小鼠的癥狀逐漸加重。而在SB203580干預組，小鼠的癥狀明顯減輕。各組大鼠的DAI評分發現：DSS組和DSS+NS組的DAI評分分別為（4.54±0.58）和（4.28±0.53）分，比正常組明顯升高，SB203580組DAI評分為（1.21±0.42）分，較DSS組和DSS+NS組明顯下降（P＜0.05），而DSS組和DSS+NS組之間的DAI評分差異無統計學意義（P＞0.05）。
2.2 結腸傳輸功能的測定
用酚紅法測定SD大鼠的結腸傳輸功能，在給予5%DSS溶液喂養后，SD大鼠的結腸傳輸功能明顯延遲（P＜0.05），經SB203580干預后，大鼠結腸傳輸功能明顯改善（P＜0.05），DSS組和DSS+NS組之間大鼠結腸傳輸功能差異無統計學意義（P＞0.05），見圖 1。
圖1
各組大鼠結腸傳輸功能
*與對照組比較，
3 討論
UC患者常常出現腸道動力障礙，包括平滑肌收縮能力降低、低頻振幅收縮增加、傳輸功能障礙等，其中腸道傳輸功能障礙研究最多[14-15]。腸道動力障礙的病因復雜，其發病機制尚未闡述清楚。大量研究顯示腸道炎癥與腸道動力障礙的發生密切相關。有研究發現，在狗的回腸炎模型中，腸道的移行復合運動頻率減弱[16]。另一項研究也顯示，腸腔內白細胞的募集導致腸道平滑肌功能的抑制，而隨著白細胞募集的衰減，腸道的平滑肌功能可以恢復[17]。這些研究都表明，腸道炎癥參與了腸道傳輸功能障礙的發病過程。因此我們推測，有效控制腸道的炎癥將能顯著改善腸道的傳輸功能障礙。事實上，我們的研究也發現，當用SB203580阻斷p38MAPK信號通路后，DSS誘導的結腸炎大鼠腸道炎癥得到改善，其延緩的結腸傳輸功能得到了顯著改善。
MAPK是細胞外信號引起細胞反應的一個共同通路，參與了細胞生長、發育、分裂、死亡等多種生理過程。p38MAPK作為MAPK家族的重要成員之一，幾乎參與了機體內所有的生理及病理過程，而它在介導炎癥、應激等細胞反應中的作用尤其引人關注。生理情況下，p38MAPK活性很低，主要位于細胞質內。而活化的p38MAPK可進入細胞核，通過磷酸化激活多種轉錄因子，誘導基因轉錄，產生大量的促炎因子，如誘導型一氧化氮合酶、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和白細胞介素-1β等[18-19]。有研究發現，p38MPAK的活性在UC患者中較正常人明顯升高，且與炎癥的程度呈正相關[20]。p38MAPK在調控促炎因子產生的機制中起著重要作用，因此如果抑制該信號通路，可能就會抑制促炎性細胞因子的產生，從而緩解炎癥所致的腸道動力障礙。用SB203580與炎癥性腸病患者的腸黏膜活體檢查組織共同孵育后，其TNF-α的含量明顯下降，且這種下降與SB203580的濃度呈現出劑量正相關關系[20]。我們的研究也發現，SB203580能降低DSS誘導的結腸炎大鼠的DAI評分，抑制腸道炎癥反應，從而改善結腸炎大鼠的腸道動力障礙。眾所周知，SB203580是p38MAPK的特異性抑制劑，是一種人工合成的吡啶咪唑類復合物，對于腸道動力并無直接的藥理學作用。本研究發現SB203580確實能改善DSS誘導的結腸炎大鼠的腸道動力障礙，這可能與SB203580抑制p38MAPK信號通路，減輕腸道炎癥反應有關。SB203580改善腸道傳輸功能的具體的作用機制需要進行進一步研究。
總之，DSS誘導的結腸炎大鼠的DAI評分明顯升高且結腸傳輸功能明顯下降，經SB203580處理后，大鼠的DAI評分下降，結腸傳輸功能也得到改善。說明p38MAPK信號通路可能參與了UC炎癥及腸道動力障礙的發病過程，p38MAPK可能成為治療UC及其腸道動力障礙的新靶點。
