引用本文： 孔祥云, 胡朝陽, 劉進, 羅朝志. 乳化異氟醚后處理對在體大鼠心臟缺血-再灌注損傷的保護作用及機制研究. 華西醫學, 2015, 30(8): 1461-1464. doi: 10.7507/1002-0179.20150418 復制
缺血性心血管疾病是嚴重危害人類健康的常見病，心肌缺血性損傷常發生于冠狀動脈部分或完全閉塞及需要心臟停搏的心臟外科手術情況下。盡早恢復血供是減輕缺血組織損傷的根本措施，但研究發現，經過一定時間缺血的組織器官在恢復血液灌注后，其功能代謝及組織結構的損傷反而加重，甚至出現不可逆性再灌注損傷，稱之為缺血-再灌注損傷（IRI）[1-2]。近年，探索新的治療途徑和藥物,減輕IRI已經成為心臟保護領域的研究熱點。異氟醚注射液（8%，容積比）是由四川大學華西醫院麻醉與危重醫學研究室擁有自主知識產權的一種處于臨床Ⅲ期前研究階段的新藥（屬化學藥品注冊分類Ⅱ）[3-4]。我們的前期研究證實，乳化異氟醚預處理能夠對抗大鼠心肌的IRI，改善缺血心肌的血流動力學，有效緩解其損傷程度[5-7]。然而，由于疾病發生的不可預知性，藥物后處理的處理方式更具臨床實用性。2012年3月-10月，本課題組將8%乳化異氟醚進行后處理，探討其在心肌IRI過程發揮的心肌保護作用及其機制，為開發乳化異氟醚的藥用價值提供理論依據。
1 材料與方法
1.1 實驗對象
成年Sprague Dawley大鼠32只，雄性，體質量250～280 g，由四川簡陽達碩動物科技有限公司提供（蜀ICP 備09003144號）。
1.2 主要試劑和儀器
液態異氟醚（體積比為8%，批號050917，華瑞制藥有限公司）。30%脂肪乳（由華瑞制藥有限公司提供，批號050501701）；肝素鈉注射液（上海生物化學制藥廠，批號050923，使用前用生理鹽水稀釋為≥140 U/mL濃度）。腫瘤壞死因子-α（TNF-α）放射免疫試劑盒（中國人民解放軍總醫院科技開發中心放射免疫研究所）。羊抗鼠TNF-α一抗（美國Santa Cruz公司）、生物素標記二抗（武漢博士德生物工程公司）。多通道生理記錄儀（420E+，成都泰盟儀器有限公司）；動物呼吸機（DH-150型，浙江大學醫學儀器廠）；微量注射泵（WZ-505，浙江大學醫學儀器廠）；20 G靜脈留置針（美國Spacelabs Medical公司）；γ-放射免疫計數器（西安儀器廠）。丙二醛、超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒（南京建成生物公司）。Image-ProPlus 5.1圖象分析系統（美國Media Cybernetics公司）。
1.3 實驗方法
1.3.1 動物分組及模型制備
采用結扎冠狀動脈左前降支的方法制備心肌缺血-再灌注模型。各組大鼠試驗前禁食12 h，用1%戊巴比妥鈉5 mL/kg腹腔麻醉后，仰臥位固定。氣管切開，機械通氣。將心電圖針狀電極插入相應部位，用二導聯記錄心電圖。切開大鼠左胸部皮膚，于第4肋間隙鈍性分離肌肉，輕壓右胸，暴露心臟，剪開心包膜，于左心耳與肺動脈圓錐之間左起始點下方1～2 mm處，用穿有6-0縫合線的彎針鉤繞左冠狀動脈前降支（LAD）中段，拉緊結扎線，造成心肌缺血。ST段抬高＞0.1 mV為結扎成功標志。隨后立即把心臟送回胸腔內，結扎30 min后松開線，進行再灌注。除假手術組外，其他各組大鼠結扎左冠狀動脈前降支30 min后再灌注180 min，假手術組只穿線不結扎。采用隨機數字表法，隨機將大鼠分為4組，每組8只，在再灌注早期靜脈給藥30 min：① 假手術組：假手術組只穿線而不結扎。② 模型組：給予生理鹽水30 min。③ 脂肪乳組：給予30%的脂肪乳。④ 乳化異氟醚組：給予8%的乳化異氟醚。各組給藥容量相同，給藥速度相同，均為4 mL/（kg·h）。
1.3.2 血漿TNF-α濃度測定
再灌注3 h后，處死動物，EP管加入10%乙二胺四乙酸二鈉（EDTA-Na）40 μL和抑肽酶10 μL，抽取血樣4 mL，4 000 r/min離心，離心后分離血漿，吸取上清放入含10% EDTA-Na 40 μL和抑肽酶10 μL的離心管，-20℃冰箱中備用。采用放射免疫分析法，按照說明書操作測定TNF-α含量，使用放射免疫計數器測定血漿TNF-α濃度。
1.3.3 心肌梗死面積測定
抽取大鼠血液后，每組將5只大鼠再次結扎LAD，經主動脈逆行灌注2%Evans Blue（美國Sigma公司）2 mL，分離無藍染缺血區（風險區）和藍染非缺血區，在-20℃冰箱中，將無藍染缺血心肌靜置10 min后，切成1 mm薄片，在37℃恒溫水浴箱中，心肌切片在含有1%四氮唑藍（TTC，美國Sigma公司）的0.1 mol/L磷酸緩沖液中染色20 min后，將切片以4%多聚甲醛固定24 h，將灰白色壞死區和深紅色非壞死區分離，干燥后置于電子天平上稱重，梗死范圍以壞死心肌質量與風險區心肌質量之比表示。
1.3.4 心肌組織過氧化指標檢測
每組余下的3只大鼠，剪下含有心尖部分的左心室，用生理鹽水沖洗后，心尖部分浸泡于4%多聚甲醛中行固定24 h后，常規石蠟包埋行免疫組織化學檢測。其余左心室部分，放于-80℃冰箱中凍存備用。嚴格按照試劑盒說明書的要求操作，制備10%組織勻漿，SOD活性測定采用黃嘌呤氧化酶法，丙二醛采用硫化巴比妥酶法測定。
1.3.5 心肌組織TNF-α免疫組織化學檢測
石蠟切片每隔1 mm連續切取數個5 μm厚的切片，采用免疫組織化學鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物連結法（SP）法進行TNF-α蛋白表達檢測。依次加入羊抗鼠TNF-α一抗（美國Santa Cruz公司）、生物素標記二抗（武漢博士德生物工程公司產品）、二氨基聯苯胺顯色。蘇木素復染，脫水，樹膠封片，鏡檢。以細胞質著棕黃色為陽性，細胞核藍色為陰性標準。用計算機圖像處理系統，每次隨機選10個視野，測定細胞陽性染色的TNF-α蛋白陽性表達指數（PEI）反映蛋白表達情況。
1.4 統計學方法
所有數據均用SPSS 13.0軟件包進行統計學處理。結果用均數±標準差表示，心肌梗死面積、TNF-α含量與蛋白表達比較均采用單因素方差分析，兩兩比較用Bonferroni Post-hoc test。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 血漿TNF-α濃度測定
與假手術組比較，模型組、脂肪乳組和乳化異氟醚組血漿TNF-α濃度升高（P＜0.05）。與模型組比較，乳化異氟醚組血漿TNF-α濃度降低（P＜0.05）。假手術組和脂肪乳組各指標比較差異無統計學意義（P＞0.05）。見表 1。
表1
各組大鼠心肌梗死面積、脂質過氧化指標和TNF-α表達（n=8，2.2 心肌梗死面積測定
與假手術組相比，乳化異氟醚組心肌梗死面積明顯減少，差異有統計學意義（P＜0.01）。假手術組和脂肪乳組間相比差異無統計學意義，見表 1。
2.3 心肌組織過氧化指標檢測
與假手術組比較，模型組、脂肪乳組和乳化異氟醚組血漿丙二醛升高，SOD降低（P＜0.05）。相比模型組，乳化異氟醚組心肌丙二醛含量降低（P＜0.05）；同時，增加了心肌SOD活性（P＜0.05）。模型組和脂肪乳組差異無統計學意義（P＞0.05），見表 1。
2.4 心肌組織TNF-α免疫組織化學檢測
TNF-α陽性反應產物呈棕黃色。與假手術組相比，模型組和脂肪乳組TNF-α蛋白表達增加（P＜0.01）。
模型組與脂肪乳組間相比差異無統計學意義（P＞0.05）。乳化異氟醚組與模型組相比，細胞質TNF-α蛋白表達降低（P＜0.05）。見表 1、圖 1。
圖1
各組大鼠心肌組織TNF-α蛋白表達（SP×40）
a. 假手術組 b. 模型組 c. 脂肪乳組 d. 乳化異氟醚組
3 討論
心肌再灌注損傷是一個多因素的復雜過程，受到多因子的調控，多條細胞信號途徑參與了IRI的病理生理過程[8-9]。在臨床上，異氟烷等揮發性麻醉藥被廣泛用于外科麻醉。異氟醚在臨床上的心肌保護作用近來得到更多的證實[10]。研究顯示，吸入性麻醉藥對缺血心肌具有保護作用，可以減輕缺血心肌細胞內鈣離子超載，減少細胞凋亡，增強心功能和減小心肌梗死面積，對缺血-再灌注心肌能夠產生良好的保護效應。
異氟醚注射液（8%，容積比）是由四川大學華西醫院麻醉與危重醫學研究室研制，擁有自主知識產權的新藥，這種將吸入麻醉藥經乳化后靜脈注射的方法，開創了術中麻醉給藥途徑的新思路。相比異氟醚，注射用乳化異氟醚不僅可應用于全身麻醉手術中的心肌保護，更能在門診手術和非全身麻醉狀態下進行心肌保護。本實驗室針對乳化異氟醚進行探索性研究，發現8%乳化異氟醚預處理具有抗IRI作用，這與6.9%乳化異氟醚能減小兔心肌梗死面積的報道一致[11]，并且我們還發現其保護心肌的機制與抑制細胞凋亡有關。然而，由于預處理的不可預知性，后處理的方式應用于疾病發生后，更具臨床價值。本次實驗采用后處理的給藥方式，驗證出乳化異氟醚后處理能夠在缺血后，再灌注期間有效緩解心肌損傷，雖然其臨床試驗還有待研究，但本次研究提示，在心肌梗死之后，選用乳化異氟醚能產生心臟保護作用。
氧自由基的產生與心肌缺血損傷的病理過程有關。隨著心肌缺血損傷機制研究的深入，發現大量氧自由基生成及脂質過氧化物反應增強是心肌缺血損傷的主要機制之一[12-13]。SOD是清除氧自由基的酶，能反映機體抗自由基的能力。丙二醛是自由基損傷機體的最終產物，可嚴重破壞細胞膜的結構，導致細胞腫脹、壞死，其含量間接反映機體細胞受自由基攻擊的嚴重程度。本研究結果表明，IRI可很快引起心肌細胞損害，心肌脂質過氧化明顯增加，而相比模型組和脂肪乳組，乳化異氟醚能改善心肌細胞脂質過氧化程度，保護心肌細胞內SOD活性，增強SOD對氧自由基的清除能力，減少丙二醛生成，具有明顯的抗自由基損傷作用。乳化異氟醚抗氧自由基的作用一方面可能是它對氧自由基生成體系的直接抑制，減少自由基的產生；另一方面也可能是通過提高SOD含量并增強其活力，加強對氧自由基的清除，從而發揮抗脂質氧化使用，減輕心肌損傷。
TNF-α參與了多種心血管疾病的發生發展，是機體應激反應產生最早和最起核心作用的炎癥介質，也是IRI細胞因子連鎖反應中的一個關鍵性介質[14-15]。TNF-α的大量產生與心肌收縮功能抑制以及心肌細胞壞死的程度密切相關，可誘導造成心肌微循環障礙，細胞缺血缺氧和大量炎性細胞浸潤和聚集，并出現心肌細胞的水腫和炎性壞死。本次實驗發現，假手術組的血漿只有較低水平的TNF-α含量，而IRI后，細胞質TNF-α明顯增加，說明缺血-再灌注確實上調了TNF-α的表達。而乳化異氟醚能夠有效緩解其升高，降低由于IRI引發的TNF-α含量增加，從而緩解心肌損傷。
綜上所述，本實驗結果表明，乳化異氟醚后處理可以改善大鼠心肌IRI后的心肌梗死面積，減少脂質過氧化，降低TNF-α含量，保護心肌。
缺血性心血管疾病是嚴重危害人類健康的常見病，心肌缺血性損傷常發生于冠狀動脈部分或完全閉塞及需要心臟停搏的心臟外科手術情況下。盡早恢復血供是減輕缺血組織損傷的根本措施，但研究發現，經過一定時間缺血的組織器官在恢復血液灌注后，其功能代謝及組織結構的損傷反而加重，甚至出現不可逆性再灌注損傷，稱之為缺血-再灌注損傷（IRI）[1-2]。近年，探索新的治療途徑和藥物,減輕IRI已經成為心臟保護領域的研究熱點。異氟醚注射液（8%，容積比）是由四川大學華西醫院麻醉與危重醫學研究室擁有自主知識產權的一種處于臨床Ⅲ期前研究階段的新藥（屬化學藥品注冊分類Ⅱ）[3-4]。我們的前期研究證實，乳化異氟醚預處理能夠對抗大鼠心肌的IRI，改善缺血心肌的血流動力學，有效緩解其損傷程度[5-7]。然而，由于疾病發生的不可預知性，藥物后處理的處理方式更具臨床實用性。2012年3月-10月，本課題組將8%乳化異氟醚進行后處理，探討其在心肌IRI過程發揮的心肌保護作用及其機制，為開發乳化異氟醚的藥用價值提供理論依據。
1 材料與方法
1.1 實驗對象
成年Sprague Dawley大鼠32只，雄性，體質量250～280 g，由四川簡陽達碩動物科技有限公司提供（蜀ICP 備09003144號）。
1.2 主要試劑和儀器
液態異氟醚（體積比為8%，批號050917，華瑞制藥有限公司）。30%脂肪乳（由華瑞制藥有限公司提供，批號050501701）；肝素鈉注射液（上海生物化學制藥廠，批號050923，使用前用生理鹽水稀釋為≥140 U/mL濃度）。腫瘤壞死因子-α（TNF-α）放射免疫試劑盒（中國人民解放軍總醫院科技開發中心放射免疫研究所）。羊抗鼠TNF-α一抗（美國Santa Cruz公司）、生物素標記二抗（武漢博士德生物工程公司）。多通道生理記錄儀（420E+，成都泰盟儀器有限公司）；動物呼吸機（DH-150型，浙江大學醫學儀器廠）；微量注射泵（WZ-505，浙江大學醫學儀器廠）；20 G靜脈留置針（美國Spacelabs Medical公司）；γ-放射免疫計數器（西安儀器廠）。丙二醛、超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒（南京建成生物公司）。Image-ProPlus 5.1圖象分析系統（美國Media Cybernetics公司）。
1.3 實驗方法
1.3.1 動物分組及模型制備
采用結扎冠狀動脈左前降支的方法制備心肌缺血-再灌注模型。各組大鼠試驗前禁食12 h，用1%戊巴比妥鈉5 mL/kg腹腔麻醉后，仰臥位固定。氣管切開，機械通氣。將心電圖針狀電極插入相應部位，用二導聯記錄心電圖。切開大鼠左胸部皮膚，于第4肋間隙鈍性分離肌肉，輕壓右胸，暴露心臟，剪開心包膜，于左心耳與肺動脈圓錐之間左起始點下方1～2 mm處，用穿有6-0縫合線的彎針鉤繞左冠狀動脈前降支（LAD）中段，拉緊結扎線，造成心肌缺血。ST段抬高＞0.1 mV為結扎成功標志。隨后立即把心臟送回胸腔內，結扎30 min后松開線，進行再灌注。除假手術組外，其他各組大鼠結扎左冠狀動脈前降支30 min后再灌注180 min，假手術組只穿線不結扎。采用隨機數字表法，隨機將大鼠分為4組，每組8只，在再灌注早期靜脈給藥30 min：① 假手術組：假手術組只穿線而不結扎。② 模型組：給予生理鹽水30 min。③ 脂肪乳組：給予30%的脂肪乳。④ 乳化異氟醚組：給予8%的乳化異氟醚。各組給藥容量相同，給藥速度相同，均為4 mL/（kg·h）。
1.3.2 血漿TNF-α濃度測定
再灌注3 h后，處死動物，EP管加入10%乙二胺四乙酸二鈉（EDTA-Na）40 μL和抑肽酶10 μL，抽取血樣4 mL，4 000 r/min離心，離心后分離血漿，吸取上清放入含10% EDTA-Na 40 μL和抑肽酶10 μL的離心管，-20℃冰箱中備用。采用放射免疫分析法，按照說明書操作測定TNF-α含量，使用放射免疫計數器測定血漿TNF-α濃度。
1.3.3 心肌梗死面積測定
抽取大鼠血液后，每組將5只大鼠再次結扎LAD，經主動脈逆行灌注2%Evans Blue（美國Sigma公司）2 mL，分離無藍染缺血區（風險區）和藍染非缺血區，在-20℃冰箱中，將無藍染缺血心肌靜置10 min后，切成1 mm薄片，在37℃恒溫水浴箱中，心肌切片在含有1%四氮唑藍（TTC，美國Sigma公司）的0.1 mol/L磷酸緩沖液中染色20 min后，將切片以4%多聚甲醛固定24 h，將灰白色壞死區和深紅色非壞死區分離，干燥后置于電子天平上稱重，梗死范圍以壞死心肌質量與風險區心肌質量之比表示。
1.3.4 心肌組織過氧化指標檢測
每組余下的3只大鼠，剪下含有心尖部分的左心室，用生理鹽水沖洗后，心尖部分浸泡于4%多聚甲醛中行固定24 h后，常規石蠟包埋行免疫組織化學檢測。其余左心室部分，放于-80℃冰箱中凍存備用。嚴格按照試劑盒說明書的要求操作，制備10%組織勻漿，SOD活性測定采用黃嘌呤氧化酶法，丙二醛采用硫化巴比妥酶法測定。
1.3.5 心肌組織TNF-α免疫組織化學檢測
石蠟切片每隔1 mm連續切取數個5 μm厚的切片，采用免疫組織化學鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物連結法（SP）法進行TNF-α蛋白表達檢測。依次加入羊抗鼠TNF-α一抗（美國Santa Cruz公司）、生物素標記二抗（武漢博士德生物工程公司產品）、二氨基聯苯胺顯色。蘇木素復染，脫水，樹膠封片，鏡檢。以細胞質著棕黃色為陽性，細胞核藍色為陰性標準。用計算機圖像處理系統，每次隨機選10個視野，測定細胞陽性染色的TNF-α蛋白陽性表達指數（PEI）反映蛋白表達情況。
1.4 統計學方法
所有數據均用SPSS 13.0軟件包進行統計學處理。結果用均數±標準差表示，心肌梗死面積、TNF-α含量與蛋白表達比較均采用單因素方差分析，兩兩比較用Bonferroni Post-hoc test。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 血漿TNF-α濃度測定
與假手術組比較，模型組、脂肪乳組和乳化異氟醚組血漿TNF-α濃度升高（P＜0.05）。與模型組比較，乳化異氟醚組血漿TNF-α濃度降低（P＜0.05）。假手術組和脂肪乳組各指標比較差異無統計學意義（P＞0.05）。見表 1。
表1
各組大鼠心肌梗死面積、脂質過氧化指標和TNF-α表達（n=8，2.2 心肌梗死面積測定
與假手術組相比，乳化異氟醚組心肌梗死面積明顯減少，差異有統計學意義（P＜0.01）。假手術組和脂肪乳組間相比差異無統計學意義，見表 1。
2.3 心肌組織過氧化指標檢測
與假手術組比較，模型組、脂肪乳組和乳化異氟醚組血漿丙二醛升高，SOD降低（P＜0.05）。相比模型組，乳化異氟醚組心肌丙二醛含量降低（P＜0.05）；同時，增加了心肌SOD活性（P＜0.05）。模型組和脂肪乳組差異無統計學意義（P＞0.05），見表 1。
2.4 心肌組織TNF-α免疫組織化學檢測
TNF-α陽性反應產物呈棕黃色。與假手術組相比，模型組和脂肪乳組TNF-α蛋白表達增加（P＜0.01）。
模型組與脂肪乳組間相比差異無統計學意義（P＞0.05）。乳化異氟醚組與模型組相比，細胞質TNF-α蛋白表達降低（P＜0.05）。見表 1、圖 1。
圖1
各組大鼠心肌組織TNF-α蛋白表達（SP×40）
a. 假手術組 b. 模型組 c. 脂肪乳組 d. 乳化異氟醚組
3 討論
心肌再灌注損傷是一個多因素的復雜過程，受到多因子的調控，多條細胞信號途徑參與了IRI的病理生理過程[8-9]。在臨床上，異氟烷等揮發性麻醉藥被廣泛用于外科麻醉。異氟醚在臨床上的心肌保護作用近來得到更多的證實[10]。研究顯示，吸入性麻醉藥對缺血心肌具有保護作用，可以減輕缺血心肌細胞內鈣離子超載，減少細胞凋亡，增強心功能和減小心肌梗死面積，對缺血-再灌注心肌能夠產生良好的保護效應。
異氟醚注射液（8%，容積比）是由四川大學華西醫院麻醉與危重醫學研究室研制，擁有自主知識產權的新藥，這種將吸入麻醉藥經乳化后靜脈注射的方法，開創了術中麻醉給藥途徑的新思路。相比異氟醚，注射用乳化異氟醚不僅可應用于全身麻醉手術中的心肌保護，更能在門診手術和非全身麻醉狀態下進行心肌保護。本實驗室針對乳化異氟醚進行探索性研究，發現8%乳化異氟醚預處理具有抗IRI作用，這與6.9%乳化異氟醚能減小兔心肌梗死面積的報道一致[11]，并且我們還發現其保護心肌的機制與抑制細胞凋亡有關。然而，由于預處理的不可預知性，后處理的方式應用于疾病發生后，更具臨床價值。本次實驗采用后處理的給藥方式，驗證出乳化異氟醚后處理能夠在缺血后，再灌注期間有效緩解心肌損傷，雖然其臨床試驗還有待研究，但本次研究提示，在心肌梗死之后，選用乳化異氟醚能產生心臟保護作用。
氧自由基的產生與心肌缺血損傷的病理過程有關。隨著心肌缺血損傷機制研究的深入，發現大量氧自由基生成及脂質過氧化物反應增強是心肌缺血損傷的主要機制之一[12-13]。SOD是清除氧自由基的酶，能反映機體抗自由基的能力。丙二醛是自由基損傷機體的最終產物，可嚴重破壞細胞膜的結構，導致細胞腫脹、壞死，其含量間接反映機體細胞受自由基攻擊的嚴重程度。本研究結果表明，IRI可很快引起心肌細胞損害，心肌脂質過氧化明顯增加，而相比模型組和脂肪乳組，乳化異氟醚能改善心肌細胞脂質過氧化程度，保護心肌細胞內SOD活性，增強SOD對氧自由基的清除能力，減少丙二醛生成，具有明顯的抗自由基損傷作用。乳化異氟醚抗氧自由基的作用一方面可能是它對氧自由基生成體系的直接抑制，減少自由基的產生；另一方面也可能是通過提高SOD含量并增強其活力，加強對氧自由基的清除，從而發揮抗脂質氧化使用，減輕心肌損傷。
TNF-α參與了多種心血管疾病的發生發展，是機體應激反應產生最早和最起核心作用的炎癥介質，也是IRI細胞因子連鎖反應中的一個關鍵性介質[14-15]。TNF-α的大量產生與心肌收縮功能抑制以及心肌細胞壞死的程度密切相關，可誘導造成心肌微循環障礙，細胞缺血缺氧和大量炎性細胞浸潤和聚集，并出現心肌細胞的水腫和炎性壞死。本次實驗發現，假手術組的血漿只有較低水平的TNF-α含量，而IRI后，細胞質TNF-α明顯增加，說明缺血-再灌注確實上調了TNF-α的表達。而乳化異氟醚能夠有效緩解其升高，降低由于IRI引發的TNF-α含量增加，從而緩解心肌損傷。
綜上所述，本實驗結果表明，乳化異氟醚后處理可以改善大鼠心肌IRI后的心肌梗死面積，減少脂質過氧化，降低TNF-α含量，保護心肌。
