近年來大量研究認為腫瘤浸潤淋巴細胞是宿主免疫系統對腫瘤抗原存在免疫反應的標志，并且可以作為預測乳腺癌患者對蒽環/紫杉類新輔助化學療法反應的有效指標。在三陰乳腺癌患者中，乳腺癌浸潤淋巴細胞可作為一項判斷預后的可靠指標。
引用本文： 楊菁, 李宏江, 羊曉勤. 乳腺癌浸潤淋巴細胞對新輔助化學療法反應的預測及與預后的關系. 華西醫學, 2015, 30(6): 1179-1182. doi: 10.7507/1002-0179.20150340 復制
乳腺癌是全球女性最常見的惡性腫瘤[1]，新輔助化學療法（化療）作為乳腺癌患者的一種全身輔助治療，有利于降低腫瘤分期，使手術順利進行，并且可降低微轉移的風險[2-4]。但并不是所有患者都對新輔助化療敏感[5-9]。早期乳腺癌新輔助化療可達到60%～90%的臨床應答率[10-12]，然而病理上的完全應答（pCR）率只有11%～30%[13-16]。pCR意味著體內殘余腫瘤細胞完全消失，是代表患者對化療敏感性最完美的指標。因此，能找到一種可以預測pCR率的指標就顯得至關重要。近年來，腫瘤浸潤淋巴細胞（TIL）作為一種預測乳腺癌患者對新輔助化療反應的標志越來越受到人們的關注，且其可以作為乳腺癌患者的一項重要的預后指標。
TIL的出現被認為是抗腫瘤免疫的標志，廣泛存在于卵巢癌[17-18]、子宮內膜癌[19-20]、結直腸癌[21]、肺癌[22]以及乳腺癌[23-25]中。在正常乳腺組織中，只有少量的淋巴細胞存在，然而，在一些浸潤性乳腺癌患者體內則發現有大量淋巴細胞浸潤。乳腺癌浸潤淋巴細胞是指浸潤至乳腺病灶中的淋巴細胞，包括瘤內淋巴細胞（iTu-Ly）與基質淋巴細胞（str-Ly）。其中，iTu-Ly是指腫瘤實質內的淋巴細胞，這些細胞與腫瘤實質細胞有直接的接觸；str-Ly是指腫瘤基質中存在的淋巴細胞，這些細胞與腫瘤細胞沒有直接的接觸[26]。在20世紀80年代末及90年代，TIL被認為是過繼免疫療法的潛在效應者，有研究從腫瘤組織中分離出TIL進行體外培養，并且證明他們可以對腫瘤細胞產生溶解作用從而限制腫瘤細胞的生長[27-28]。
1 乳腺癌TIL的生物學特征
研究表明，乳腺癌病灶中可以浸潤多種炎性細胞，其組成為：T淋巴細胞比例約為75%，B淋巴細胞比例＜20%，單核細胞比例＜10%，自然殺傷細胞的比例＜5%[29]。研究表明，與乳腺癌TIL相關的病理因素有：浸潤性導管癌組織學類型、高組織學分級、激素受體陰性、Ki67高表達、人類表皮生長因子受體2（HER2）陽性，以及淋巴結轉移數量[30-32]。很明顯，這些臨床病理學因素都是提示預后不良的因素，因此，可以推測淋巴細胞誘導的抗腫瘤免疫反應在改善這類患者生存中可能存在很重要的意義。與TIL呈負相關的病理因素是人白細胞抗原G，其與腫瘤逃逸有一定關聯[33]。另外，TIL計數被報告與乳腺癌干細胞及上皮-間充質轉化有密切的關系[32]。
2 乳腺癌TIL與對新輔助化療反應的關系
一個早期的小樣本隊列研究發現，乳腺癌患者經過新輔助化療后最終達到pCR的那一部分患者在治療前穿刺活體組織檢查（活檢）的病理標本中有較高數量的CD3+ TIL[26]。這一結果隨后被Denkert等[34]進行的大樣本隊列研究所證實。Denkert等[34]納入了1 058例接受新輔助化療的患者，其中218例（T2～3N0～2M0，1999年－2001年）來自GeparDuo試驗，840例（T2～4 N0～3M0，2002年－2005年）來自Gepartrio試驗，收集術前空心針活檢石蠟包埋標本以研究腫瘤內以及基質中淋巴細胞浸潤與化療的關系。GeparDuo試驗顯示，淋巴細胞浸潤為主的乳腺癌（LPBC，淋巴細胞浸潤比例＞60%），非淋巴細胞浸潤為主乳腺癌（Non-LPBC，淋巴細胞浸潤比例＜60%）及無明顯淋巴浸潤的乳腺癌pCR率分別為41.7%、10.8%和2.8%，各組間差異有統計學意義（P＜0.000 5）。在Gepartrio試驗中，分析了840例患者的活檢標本，LPBC患者的pCR率達40%，然而沒有淋巴細胞浸潤的腫瘤pCR率只有7%。并且，在達到pCR的患者中，與B細胞相比，T細胞浸潤占主導地位。可以推測抗腫瘤免疫以細胞免疫為主，T細胞在免疫監視，殺傷靶細胞及免疫調節方面占據重要地位。該試驗從2個大型的、前瞻性的、多中心的隨機試驗進行數據分析，證明了腫瘤相關淋巴細胞的出現可以預測機體對蒽環霉素/紫杉醇新輔助化療的應答，是pCR的獨立的預測參數。病理學家可以劃分出受益于這一類化療的患者。近年來，又有試驗證實了TIL在預測雌激素受體陰性或三陰乳腺癌患者對新輔助化療反應中效果更加顯著[35-37]。
那么TIL為什么可以預測化療反應呢？化療藥物作用于腫瘤細胞，細胞死亡釋放出腫瘤抗原。如果此時存在淋巴細胞浸潤，抗原被抗原呈遞細胞加工呈遞給相關T細胞，激發相應免疫反應。Apetoh等[38]指出化療藥物誘導的腫瘤細胞死亡可以促進釋放高遷移率族蛋白B1，通過Toll樣受體4來激活抗原呈遞細胞，從而激活T細胞介導的細胞免疫。顆粒酶B（gzmB）和細胞毒性相關蛋白1（TiA1）存在于CD8+T淋巴細胞中，發揮重要的細胞毒作用。在化療前這些蛋白處于低表達狀態，化療后達到pCR的患者卻可以觀察到表達gzmB和TiA1陽性細胞的大量聚集，這也進一步證明了化療可以促進pCR患者的細胞毒免疫反應[9]。
與此同時，在淋巴細胞中，CD4+CD25+調性節T淋巴細胞（Tregs細胞）起免疫抑制的作用，其大約占CD4+T淋巴細胞的10%，可以特異性表達叉頭狀轉錄因子P3（FOXP3），這些細胞是導致免疫耐受，阻止抗腫瘤免疫反應的重要因素。FOXP3+ T淋巴細胞與普通的T淋巴細胞對化療的反應性不同。化療藥物紫杉醇和多柔比星都可以通過局部降低Tregs的數量，從而降低FOXP3依賴的抗腫瘤免疫的抑制[39]。有研究指出乳腺癌新輔助化療后的pCR率與腫瘤中浸潤的FOXP3+的Tregs數量下降相關[40-41]。經過新輔助化療后，達到pCR的患者FOXP3+ T淋巴細胞的數量會下降，CD8/FOXP3的比例會上升；然而沒有達到pCR的患者FOXP3+ T淋巴細胞數量以及CD8/FOXP3的比例沒有改變。
3 乳腺癌TIL與預后的關系
在乳腺癌微環境中，不同的白細胞亞型浸潤預示著不同的預后，淋巴細胞浸潤與較好的預后相關，然而漿細胞以及其他類型的炎性細胞則預示著較差的預后[25]。大量研究表明CD8+ T淋巴細胞浸潤與乳腺癌良好的預后相關，特別是在三陰乳腺癌中，CD8+ T淋巴細胞浸潤與總生存率以及無病生存率高度相關[42-44]。CD8+ T淋巴細胞是抗腫瘤免疫的關鍵成員，它們攻擊表面結合有Ⅰ類主要組織相容性復合體并表達腫瘤相關抗原的腫瘤細胞。理論上CD8+ T淋巴細胞數量越多，提示預后越好。除此之外，也有研究表明CD3+ T淋巴細胞浸潤也與乳腺癌良好的預后相關[45]。Loi等[46]的研究顯示在淋巴結陽性、雌激素陰性、HER2陰性乳腺癌亞群里，str-Ly浸潤與iTu-Ly浸潤在單因素分析中都是強烈的預后因素。str-Ly浸潤每增加10%，復發風險下降15%，死亡風險下降17%；iTu-Ly浸潤每增加10%，復發風險下降17%，死亡風險下降27%。另外，他們也指出在HER2陽性的患者中，隨著TIL的數量增多，患者更受益于蒽環類的新輔助化療方案，而不是聯合應用蒽環類和多西他賽。Dieci等[47]研究表明三陰乳腺癌患者在新輔助化療后殘余病灶的TIL是強烈的預后因素，大量TIL的患者5年總生存率是91%，而低TIL的患者是55%。有趣的是，殘余病灶有大量淋巴細胞浸潤（60%）的患者在化療前往往淋巴細胞浸潤不是大量的，也就是說是由于化療藥物暴露刺激了更多的淋巴細胞浸潤。這一試驗結果表明盡管一部分患者在化療后沒有達到pCR，但他們仍然受益于治療，可以有較好的預后。
三陰乳腺癌和HER2陽性的乳腺癌都是具有高度增殖能力的腫瘤類型，且基因具有不穩定性。這兩種亞型淋巴細胞浸潤的水平比雌激素陽性、HER2陰性的乳腺癌要多，可能是由于基因組的不穩定性使大量腫瘤特異性抗原的暴露，促進抗腫瘤的免疫反應。雖然這種免疫反應不能使原發性腫瘤退行性變，但是產生的記憶細胞對阻止術后復發起到一定作用。我們可以作如下推斷，在腫瘤進展時，宿主免疫系統與腫瘤發展是一個相互作用的過程，在這個過程中如果同時存在較強的免疫刺激物，也就是說化療藥物和免疫作用相互協同，可以增強抗腫瘤免疫反應；對于診斷時沒有發現淋巴細胞浸潤的三陰乳腺癌患者，治療的關鍵點之一就是要促進免疫的識別；三陰乳腺癌在復發后治療方案局限，預后極差，因此免疫調節治療毫無疑問地成為值得深入研究的策略。
從上述研究可見，對于傳統T細胞的浸潤與良好預后的關系，觀點是一致的。然而，對于新輔助化療前FOXP3+ TIL與預后的關系卻是頗具爭議的。Demir等[41]指出，盡管存在FOXP3+ T淋巴細胞浸潤的部分患者有良好的pCR率，但是它們的總生存率仍然低于沒有FOXP3+ T淋巴細胞浸潤的患者的。Ma等[48]也指出γδTIL預示著較差的預后，γδTIL代表著一類調節T細胞且與腫瘤免疫耐受相關。FOXP3+ T淋巴細胞的出現與較高的腫瘤組織學分級以及淋巴結轉移相關，這可能與較差的預后有一定聯系。相反地，也有大樣本的回顧性研究指出[49-50]，用紫杉醇化療的患者，存在FOXP3+ T淋巴細胞浸潤者有更好的無病生存率與總生存率。最近也有研究指出，基質Tregs細胞數量與對化療的反應相關，而瘤內Tregs細胞數量與預后相關[51-52]。盡管FOXP3被認為是Tregs細胞的標志物，近期研究表明，FOXP3也表達于不同類型的腫瘤細胞中，包括乳腺細胞[53-54]。
4 結語
TIL可以有效地預測乳腺癌對蒽環/紫杉類新輔助化療的反應；且在三陰乳腺癌患者中，TIL可作為一項判斷預后的可靠指標。
乳腺癌是全球女性最常見的惡性腫瘤[1]，新輔助化學療法（化療）作為乳腺癌患者的一種全身輔助治療，有利于降低腫瘤分期，使手術順利進行，并且可降低微轉移的風險[2-4]。但并不是所有患者都對新輔助化療敏感[5-9]。早期乳腺癌新輔助化療可達到60%～90%的臨床應答率[10-12]，然而病理上的完全應答（pCR）率只有11%～30%[13-16]。pCR意味著體內殘余腫瘤細胞完全消失，是代表患者對化療敏感性最完美的指標。因此，能找到一種可以預測pCR率的指標就顯得至關重要。近年來，腫瘤浸潤淋巴細胞（TIL）作為一種預測乳腺癌患者對新輔助化療反應的標志越來越受到人們的關注，且其可以作為乳腺癌患者的一項重要的預后指標。
TIL的出現被認為是抗腫瘤免疫的標志，廣泛存在于卵巢癌[17-18]、子宮內膜癌[19-20]、結直腸癌[21]、肺癌[22]以及乳腺癌[23-25]中。在正常乳腺組織中，只有少量的淋巴細胞存在，然而，在一些浸潤性乳腺癌患者體內則發現有大量淋巴細胞浸潤。乳腺癌浸潤淋巴細胞是指浸潤至乳腺病灶中的淋巴細胞，包括瘤內淋巴細胞（iTu-Ly）與基質淋巴細胞（str-Ly）。其中，iTu-Ly是指腫瘤實質內的淋巴細胞，這些細胞與腫瘤實質細胞有直接的接觸；str-Ly是指腫瘤基質中存在的淋巴細胞，這些細胞與腫瘤細胞沒有直接的接觸[26]。在20世紀80年代末及90年代，TIL被認為是過繼免疫療法的潛在效應者，有研究從腫瘤組織中分離出TIL進行體外培養，并且證明他們可以對腫瘤細胞產生溶解作用從而限制腫瘤細胞的生長[27-28]。
1 乳腺癌TIL的生物學特征
研究表明，乳腺癌病灶中可以浸潤多種炎性細胞，其組成為：T淋巴細胞比例約為75%，B淋巴細胞比例＜20%，單核細胞比例＜10%，自然殺傷細胞的比例＜5%[29]。研究表明，與乳腺癌TIL相關的病理因素有：浸潤性導管癌組織學類型、高組織學分級、激素受體陰性、Ki67高表達、人類表皮生長因子受體2（HER2）陽性，以及淋巴結轉移數量[30-32]。很明顯，這些臨床病理學因素都是提示預后不良的因素，因此，可以推測淋巴細胞誘導的抗腫瘤免疫反應在改善這類患者生存中可能存在很重要的意義。與TIL呈負相關的病理因素是人白細胞抗原G，其與腫瘤逃逸有一定關聯[33]。另外，TIL計數被報告與乳腺癌干細胞及上皮-間充質轉化有密切的關系[32]。
2 乳腺癌TIL與對新輔助化療反應的關系
一個早期的小樣本隊列研究發現，乳腺癌患者經過新輔助化療后最終達到pCR的那一部分患者在治療前穿刺活體組織檢查（活檢）的病理標本中有較高數量的CD3+ TIL[26]。這一結果隨后被Denkert等[34]進行的大樣本隊列研究所證實。Denkert等[34]納入了1 058例接受新輔助化療的患者，其中218例（T2～3N0～2M0，1999年－2001年）來自GeparDuo試驗，840例（T2～4 N0～3M0，2002年－2005年）來自Gepartrio試驗，收集術前空心針活檢石蠟包埋標本以研究腫瘤內以及基質中淋巴細胞浸潤與化療的關系。GeparDuo試驗顯示，淋巴細胞浸潤為主的乳腺癌（LPBC，淋巴細胞浸潤比例＞60%），非淋巴細胞浸潤為主乳腺癌（Non-LPBC，淋巴細胞浸潤比例＜60%）及無明顯淋巴浸潤的乳腺癌pCR率分別為41.7%、10.8%和2.8%，各組間差異有統計學意義（P＜0.000 5）。在Gepartrio試驗中，分析了840例患者的活檢標本，LPBC患者的pCR率達40%，然而沒有淋巴細胞浸潤的腫瘤pCR率只有7%。并且，在達到pCR的患者中，與B細胞相比，T細胞浸潤占主導地位。可以推測抗腫瘤免疫以細胞免疫為主，T細胞在免疫監視，殺傷靶細胞及免疫調節方面占據重要地位。該試驗從2個大型的、前瞻性的、多中心的隨機試驗進行數據分析，證明了腫瘤相關淋巴細胞的出現可以預測機體對蒽環霉素/紫杉醇新輔助化療的應答，是pCR的獨立的預測參數。病理學家可以劃分出受益于這一類化療的患者。近年來，又有試驗證實了TIL在預測雌激素受體陰性或三陰乳腺癌患者對新輔助化療反應中效果更加顯著[35-37]。
那么TIL為什么可以預測化療反應呢？化療藥物作用于腫瘤細胞，細胞死亡釋放出腫瘤抗原。如果此時存在淋巴細胞浸潤，抗原被抗原呈遞細胞加工呈遞給相關T細胞，激發相應免疫反應。Apetoh等[38]指出化療藥物誘導的腫瘤細胞死亡可以促進釋放高遷移率族蛋白B1，通過Toll樣受體4來激活抗原呈遞細胞，從而激活T細胞介導的細胞免疫。顆粒酶B（gzmB）和細胞毒性相關蛋白1（TiA1）存在于CD8+T淋巴細胞中，發揮重要的細胞毒作用。在化療前這些蛋白處于低表達狀態，化療后達到pCR的患者卻可以觀察到表達gzmB和TiA1陽性細胞的大量聚集，這也進一步證明了化療可以促進pCR患者的細胞毒免疫反應[9]。
與此同時，在淋巴細胞中，CD4+CD25+調性節T淋巴細胞（Tregs細胞）起免疫抑制的作用，其大約占CD4+T淋巴細胞的10%，可以特異性表達叉頭狀轉錄因子P3（FOXP3），這些細胞是導致免疫耐受，阻止抗腫瘤免疫反應的重要因素。FOXP3+ T淋巴細胞與普通的T淋巴細胞對化療的反應性不同。化療藥物紫杉醇和多柔比星都可以通過局部降低Tregs的數量，從而降低FOXP3依賴的抗腫瘤免疫的抑制[39]。有研究指出乳腺癌新輔助化療后的pCR率與腫瘤中浸潤的FOXP3+的Tregs數量下降相關[40-41]。經過新輔助化療后，達到pCR的患者FOXP3+ T淋巴細胞的數量會下降，CD8/FOXP3的比例會上升；然而沒有達到pCR的患者FOXP3+ T淋巴細胞數量以及CD8/FOXP3的比例沒有改變。
3 乳腺癌TIL與預后的關系
在乳腺癌微環境中，不同的白細胞亞型浸潤預示著不同的預后，淋巴細胞浸潤與較好的預后相關，然而漿細胞以及其他類型的炎性細胞則預示著較差的預后[25]。大量研究表明CD8+ T淋巴細胞浸潤與乳腺癌良好的預后相關，特別是在三陰乳腺癌中，CD8+ T淋巴細胞浸潤與總生存率以及無病生存率高度相關[42-44]。CD8+ T淋巴細胞是抗腫瘤免疫的關鍵成員，它們攻擊表面結合有Ⅰ類主要組織相容性復合體并表達腫瘤相關抗原的腫瘤細胞。理論上CD8+ T淋巴細胞數量越多，提示預后越好。除此之外，也有研究表明CD3+ T淋巴細胞浸潤也與乳腺癌良好的預后相關[45]。Loi等[46]的研究顯示在淋巴結陽性、雌激素陰性、HER2陰性乳腺癌亞群里，str-Ly浸潤與iTu-Ly浸潤在單因素分析中都是強烈的預后因素。str-Ly浸潤每增加10%，復發風險下降15%，死亡風險下降17%；iTu-Ly浸潤每增加10%，復發風險下降17%，死亡風險下降27%。另外，他們也指出在HER2陽性的患者中，隨著TIL的數量增多，患者更受益于蒽環類的新輔助化療方案，而不是聯合應用蒽環類和多西他賽。Dieci等[47]研究表明三陰乳腺癌患者在新輔助化療后殘余病灶的TIL是強烈的預后因素，大量TIL的患者5年總生存率是91%，而低TIL的患者是55%。有趣的是，殘余病灶有大量淋巴細胞浸潤（60%）的患者在化療前往往淋巴細胞浸潤不是大量的，也就是說是由于化療藥物暴露刺激了更多的淋巴細胞浸潤。這一試驗結果表明盡管一部分患者在化療后沒有達到pCR，但他們仍然受益于治療，可以有較好的預后。
三陰乳腺癌和HER2陽性的乳腺癌都是具有高度增殖能力的腫瘤類型，且基因具有不穩定性。這兩種亞型淋巴細胞浸潤的水平比雌激素陽性、HER2陰性的乳腺癌要多，可能是由于基因組的不穩定性使大量腫瘤特異性抗原的暴露，促進抗腫瘤的免疫反應。雖然這種免疫反應不能使原發性腫瘤退行性變，但是產生的記憶細胞對阻止術后復發起到一定作用。我們可以作如下推斷，在腫瘤進展時，宿主免疫系統與腫瘤發展是一個相互作用的過程，在這個過程中如果同時存在較強的免疫刺激物，也就是說化療藥物和免疫作用相互協同，可以增強抗腫瘤免疫反應；對于診斷時沒有發現淋巴細胞浸潤的三陰乳腺癌患者，治療的關鍵點之一就是要促進免疫的識別；三陰乳腺癌在復發后治療方案局限，預后極差，因此免疫調節治療毫無疑問地成為值得深入研究的策略。
從上述研究可見，對于傳統T細胞的浸潤與良好預后的關系，觀點是一致的。然而，對于新輔助化療前FOXP3+ TIL與預后的關系卻是頗具爭議的。Demir等[41]指出，盡管存在FOXP3+ T淋巴細胞浸潤的部分患者有良好的pCR率，但是它們的總生存率仍然低于沒有FOXP3+ T淋巴細胞浸潤的患者的。Ma等[48]也指出γδTIL預示著較差的預后，γδTIL代表著一類調節T細胞且與腫瘤免疫耐受相關。FOXP3+ T淋巴細胞的出現與較高的腫瘤組織學分級以及淋巴結轉移相關，這可能與較差的預后有一定聯系。相反地，也有大樣本的回顧性研究指出[49-50]，用紫杉醇化療的患者，存在FOXP3+ T淋巴細胞浸潤者有更好的無病生存率與總生存率。最近也有研究指出，基質Tregs細胞數量與對化療的反應相關，而瘤內Tregs細胞數量與預后相關[51-52]。盡管FOXP3被認為是Tregs細胞的標志物，近期研究表明，FOXP3也表達于不同類型的腫瘤細胞中，包括乳腺細胞[53-54]。
4 結語
TIL可以有效地預測乳腺癌對蒽環/紫杉類新輔助化療的反應；且在三陰乳腺癌患者中，TIL可作為一項判斷預后的可靠指標。