引用本文： 魏鑫, 周亮, 王坤杰, 李虹. 壓力對膀胱平滑肌細胞損傷的研究. 華西醫學, 2015, 30(6): 1079-1082. doi: 10.7507/1002-0179.20150310 復制
膀胱平滑肌細胞是組織工程構建膀胱研究中重要的種子細胞。大量研究指出，適宜范圍的壓力加載能夠促進體外培養的膀胱平滑肌細胞增殖[1-4]。但同時，壓力導致的細胞損傷也被廣泛報道[5-8]。本研究比較了體外壓力加載培養與無壓力培養細胞的α-actin表達量與細胞碘化丙啶（PI）染色陽性比例，旨在探討在可促進增殖范圍內的壓力加載與膀胱平滑肌細胞損傷的關系。現報告如下。
1 材料與方法
1.1 主要儀器和試劑
細胞機械力加載系統[3][可提供固定或變化的機械壓力及37 ℃、5%二氧化碳（CO2）及飽和濕度培養條件]；人類膀胱平滑肌細胞（美國標準生物品收藏中心）；胎牛血清（美國GIBCO公司），Dulbecco改良的Eagle培養基（DMEM）和胰蛋白酶，兔抗人α-actin單抗購自英國ABCAM公司，免疫熒光染色試劑盒抗人異硫氰酸熒光素（FITC）、4，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）購自上海碧云天生物技術公司；碘化丙啶（PI）購自美國Sigma公司，配成1 mg/mL，4℃保存；4%多聚甲醛。倒置免疫熒光顯微鏡型號為Olympus 1X71（日本奧林巴斯公司）。
1.2 實驗分組及處理
原代人膀胱平滑肌細胞生長至匯合狀態時，到80%～90%融合時就可以傳代。傳代時，吸引管吸去原有的培養液，用磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗2遍，吸盡。用0.25%胰蛋白酶浸潤細胞（約1 mL）30 s，把培養瓶放置在相差顯微鏡下進行觀察，當細胞開始回縮、稍變圓、間隙增大時，迅速加入3～5 mL的DMEM培養液（含10%胎牛血清，青霉素100 U/mL，鏈霉素100 μg/mL）終止消化，用吸管吹打制成細胞懸液，將細胞懸液裝于離心管，以1 200 r/min的轉速離心5 min，洗滌去除胰蛋白酶消化液，用培養基重新懸浮細胞。用計數板測細胞數量，以5×106/mL的細胞濃度接種，大約每5天左右傳代1次，然后把第3～7代細胞做實驗檢測。
實驗組：膀胱平滑肌細胞按每片接種1×105個細胞，制備18個細胞爬片，置于6孔板內，于37℃、5% CO2及飽和濕度的培養箱中培養培養24 h，然后進入機械壓力加載系統，于37℃、5% CO2、飽和濕度以及40 cm H2O（1 cm H2O=0.098 kPa）壓力下培養24 h后檢測。
對照組：膀胱平滑肌細胞按每片接種1×105個細胞制備細胞爬片，制備18個細胞爬片，全程置于6孔板內，于37℃、5% CO2及飽和濕度的無壓力培養箱中培養24 h。
兩組均有8個樣本既有PI染色又有α-actin染色，10個樣本單獨α-actin染色用于觀察形態和收縮蛋白表達。
1.3 細胞損傷指標檢測
1.3.1 PI染色
PI染色劑不能通過活細胞膜，但卻能穿過破損的細胞膜而對核染色，因此常用于細胞凋亡檢測。兩組各8個樣本，將實驗組與對照組細胞用PBS清洗2遍，分別加入PI染色劑，避光條件下溫水浴10 min，加用4%多聚甲醛固定10 min。PBS清洗多聚甲醛，然后夾取蓋玻片放在載玻片上，熒光顯微鏡觀察攝像。PI熒光為紅色（620 nm）。Image J軟件計數PI染色陽性細胞數，用于量化對照組與實驗組細胞的凋亡細胞的比例。
1.3.2 α-actin染色
該指標用于量化機械力對細胞收縮蛋白及骨架的影響。兩組各10個樣本，甲醛固定膀胱平滑肌細胞20 min，0.1%聚乙二醇辛基苯基醚作用5 min，PBS清洗3次，羊血清室溫封閉后加兔抗人α-actin單抗（1︰100）37℃，1 h，PBS清洗3次后加FITC標記的二抗（1︰150）37℃作用1 h，用Image J軟件對細胞熒光面積作定量分析，測量熒光面積所占百分比。
1.3.3 DAPI染色
DAPI染色劑可以透過完整的細胞膜，因此常用于鑒定活細胞。用PBS漂洗對照組與實驗組經上述染色操作后的細胞，每個爬片分別滴加適量DAPI工作液，室溫下染色5 min后用PBS漂洗。水溶性封片劑封片后置于熒光顯微鏡觀察。DAPI熒光為藍色（340 nm）。
1.4 統計學方法
用SPSS 17.0軟件對各組資料進行分析。細胞實驗檢測數據均以均數±標準差表示，組間比較行 t檢驗。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 α-actin的表達
實驗組與對照組比較，α-actin熒光檢測均呈陽性反應，細胞質內α-actin呈梭形排列，細胞核染色呈陽性反應（圖 1），Image J檢測結果顯示α-actin免疫熒光面積測量實驗組為（50.93±1.99）%，對照組為（24.70±1.61）%，實驗組明顯高于對照組，差異有統計學意義（t=32.404，P＜0.001）。
圖1
兩組細胞免疫熒光圖片（PI×100）
綠色熒光示膀胱平滑肌細胞α-actin，紅色熒光示被損傷細胞（PI陽性），藍色熒光示細胞核（DAPI陽性） a. 實驗組 b. 對照組
2.2 細胞損傷指標檢測
PI染色陽性細胞數量實驗組為（9.00±1.41）%，對照組為（3.50±2.12）%，實驗組明顯高于對照組，差異有統計學意義（t=6.110，P＜0.001）。
3 討論
在生理狀態下，膀胱處于復雜的動態機械力環境中[9]。在膀胱儲尿和排尿時，膀胱平滑肌細胞受到周期性機械力刺激，其中包括靜水壓力、牽張力和流體剪切力等多種機械力。研究表明，體外培養環境越接近體內，獲得的組織或器官的結構和功能越接近原有的組織或器官[10]。體外培養環境包括溫度、酸堿度、生物化學信號、電生理以及生物力學、機械力學性能等方面，然而力學刺激是最基本和重要的方面之一[11-12]。力學環境對細胞的形態功能、基因表達、信號傳遞、生長、增殖、凋亡等至關重要[13]。力學刺激對于人體組織器官在正常發育不可或缺，否則會直接影響細胞之間的信號傳遞，細胞生長緩慢，增殖活力下降，細胞的形態功能逐漸退化，致使組織器官慢慢萎縮，功能減退。種子細胞作為組織工程中重要部分，其生理活性與所構建的組織器官的形態及功能關系密切。因此，體外培養的種子細胞應盡可能滿足體內的力學培養環境需要，特別是骨科的肌腱和心血管的管壁研究較多[14-16]。而膀胱種子細胞的體外壓力加載培養研究較少。
有研究發現，合適的機械力環境能夠促進膀胱發育和生長[1]；另一方面，大量的病理生理學證據顯示異常的機械力是損害膀胱的重要因素，例如，脊髓損傷或膀胱出口梗阻時膀胱壓力改變，導致疾病惡化，膀胱從細胞水平進而到大體水平都發生改變，最終出現低順應性膀胱[5, 17]。細胞水平的變化包括細胞增殖旺盛、細胞外基質分泌增加等，這些變化都涉及到細胞表型的改變[18]。機械力對膀胱平滑肌細胞的促進與損傷作用間是否同時存在于機械力加載早期尚無研究報道。
本研究選取了大多數研究認可的可促進膀胱平滑肌細胞增殖的壓力加載范圍進行研究[19]，探討在這一體外培養條件下，可促進細胞增殖的壓力范圍是否同時存在著損傷細胞的情況，結果初步揭示了機械力對細胞同時存在著促進和損傷的作用。
α-actin染色可顯示膀胱平滑肌細胞形態，目前認為平滑肌α-actin是“收縮型”平滑肌細胞表型的主要標志，其表達顯著下調表明平滑肌細胞發生表型轉化[20-21]。actin在平滑肌細胞中是其細胞收縮的主要成分，含量在所有收縮相關蛋白中居于首位，其穩定的表達量和在細胞質內規則而有序的排列是平滑肌細胞行使收縮功能的必要條件。α-actin作為細胞骨架的成分，還與其他骨架蛋白共同參與細胞在外界張力刺激下的被動形變過程，即與微絲協同產生抗拉作用，這種力學特性對維持細胞外形穩定具有重要的生物學意義[22-23]。在本研究選定的壓力條件下，實驗組與對照組細胞的α-actin表達差異有統計學意義（P＜0.001），表明生理狀態下的壓力刺激對膀胱平滑肌細胞的收縮能力確實具有促進作用。
熒光染料PI是一種可對DNA染色的細胞核染色試劑。PI不能通過活細胞膜，但卻能穿過破損的細胞膜而對核染色，試驗可借此發現被損傷的平滑肌細胞。本研究經PI染色后，實驗組陽性細胞數量高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.001），表明了在實驗設定的壓力培養條件下膀胱平滑肌細胞損傷的存在。
綜上所述，對膀胱平滑肌細胞而言，壓力同時具有促進作用和細胞損傷作用，在壓力加載培養體系中，即使是經過大量研究并被一致認為是相對安全的、可促進細胞增殖的壓力加載條件，其在促進細胞收縮蛋白表達的同時也會對膀胱平滑肌細胞造成損傷。
膀胱平滑肌細胞是組織工程構建膀胱研究中重要的種子細胞。大量研究指出，適宜范圍的壓力加載能夠促進體外培養的膀胱平滑肌細胞增殖[1-4]。但同時，壓力導致的細胞損傷也被廣泛報道[5-8]。本研究比較了體外壓力加載培養與無壓力培養細胞的α-actin表達量與細胞碘化丙啶（PI）染色陽性比例，旨在探討在可促進增殖范圍內的壓力加載與膀胱平滑肌細胞損傷的關系。現報告如下。
1 材料與方法
1.1 主要儀器和試劑
細胞機械力加載系統[3][可提供固定或變化的機械壓力及37 ℃、5%二氧化碳（CO2）及飽和濕度培養條件]；人類膀胱平滑肌細胞（美國標準生物品收藏中心）；胎牛血清（美國GIBCO公司），Dulbecco改良的Eagle培養基（DMEM）和胰蛋白酶，兔抗人α-actin單抗購自英國ABCAM公司，免疫熒光染色試劑盒抗人異硫氰酸熒光素（FITC）、4，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）購自上海碧云天生物技術公司；碘化丙啶（PI）購自美國Sigma公司，配成1 mg/mL，4℃保存；4%多聚甲醛。倒置免疫熒光顯微鏡型號為Olympus 1X71（日本奧林巴斯公司）。
1.2 實驗分組及處理
原代人膀胱平滑肌細胞生長至匯合狀態時，到80%～90%融合時就可以傳代。傳代時，吸引管吸去原有的培養液，用磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗2遍，吸盡。用0.25%胰蛋白酶浸潤細胞（約1 mL）30 s，把培養瓶放置在相差顯微鏡下進行觀察，當細胞開始回縮、稍變圓、間隙增大時，迅速加入3～5 mL的DMEM培養液（含10%胎牛血清，青霉素100 U/mL，鏈霉素100 μg/mL）終止消化，用吸管吹打制成細胞懸液，將細胞懸液裝于離心管，以1 200 r/min的轉速離心5 min，洗滌去除胰蛋白酶消化液，用培養基重新懸浮細胞。用計數板測細胞數量，以5×106/mL的細胞濃度接種，大約每5天左右傳代1次，然后把第3～7代細胞做實驗檢測。
實驗組：膀胱平滑肌細胞按每片接種1×105個細胞，制備18個細胞爬片，置于6孔板內，于37℃、5% CO2及飽和濕度的培養箱中培養培養24 h，然后進入機械壓力加載系統，于37℃、5% CO2、飽和濕度以及40 cm H2O（1 cm H2O=0.098 kPa）壓力下培養24 h后檢測。
對照組：膀胱平滑肌細胞按每片接種1×105個細胞制備細胞爬片，制備18個細胞爬片，全程置于6孔板內，于37℃、5% CO2及飽和濕度的無壓力培養箱中培養24 h。
兩組均有8個樣本既有PI染色又有α-actin染色，10個樣本單獨α-actin染色用于觀察形態和收縮蛋白表達。
1.3 細胞損傷指標檢測
1.3.1 PI染色
PI染色劑不能通過活細胞膜，但卻能穿過破損的細胞膜而對核染色，因此常用于細胞凋亡檢測。兩組各8個樣本，將實驗組與對照組細胞用PBS清洗2遍，分別加入PI染色劑，避光條件下溫水浴10 min，加用4%多聚甲醛固定10 min。PBS清洗多聚甲醛，然后夾取蓋玻片放在載玻片上，熒光顯微鏡觀察攝像。PI熒光為紅色（620 nm）。Image J軟件計數PI染色陽性細胞數，用于量化對照組與實驗組細胞的凋亡細胞的比例。
1.3.2 α-actin染色
該指標用于量化機械力對細胞收縮蛋白及骨架的影響。兩組各10個樣本，甲醛固定膀胱平滑肌細胞20 min，0.1%聚乙二醇辛基苯基醚作用5 min，PBS清洗3次，羊血清室溫封閉后加兔抗人α-actin單抗（1︰100）37℃，1 h，PBS清洗3次后加FITC標記的二抗（1︰150）37℃作用1 h，用Image J軟件對細胞熒光面積作定量分析，測量熒光面積所占百分比。
1.3.3 DAPI染色
DAPI染色劑可以透過完整的細胞膜，因此常用于鑒定活細胞。用PBS漂洗對照組與實驗組經上述染色操作后的細胞，每個爬片分別滴加適量DAPI工作液，室溫下染色5 min后用PBS漂洗。水溶性封片劑封片后置于熒光顯微鏡觀察。DAPI熒光為藍色（340 nm）。
1.4 統計學方法
用SPSS 17.0軟件對各組資料進行分析。細胞實驗檢測數據均以均數±標準差表示，組間比較行 t檢驗。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 α-actin的表達
實驗組與對照組比較，α-actin熒光檢測均呈陽性反應，細胞質內α-actin呈梭形排列，細胞核染色呈陽性反應（圖 1），Image J檢測結果顯示α-actin免疫熒光面積測量實驗組為（50.93±1.99）%，對照組為（24.70±1.61）%，實驗組明顯高于對照組，差異有統計學意義（t=32.404，P＜0.001）。
圖1
兩組細胞免疫熒光圖片（PI×100）
綠色熒光示膀胱平滑肌細胞α-actin，紅色熒光示被損傷細胞（PI陽性），藍色熒光示細胞核（DAPI陽性） a. 實驗組 b. 對照組
2.2 細胞損傷指標檢測
PI染色陽性細胞數量實驗組為（9.00±1.41）%，對照組為（3.50±2.12）%，實驗組明顯高于對照組，差異有統計學意義（t=6.110，P＜0.001）。
3 討論
在生理狀態下，膀胱處于復雜的動態機械力環境中[9]。在膀胱儲尿和排尿時，膀胱平滑肌細胞受到周期性機械力刺激，其中包括靜水壓力、牽張力和流體剪切力等多種機械力。研究表明，體外培養環境越接近體內，獲得的組織或器官的結構和功能越接近原有的組織或器官[10]。體外培養環境包括溫度、酸堿度、生物化學信號、電生理以及生物力學、機械力學性能等方面，然而力學刺激是最基本和重要的方面之一[11-12]。力學環境對細胞的形態功能、基因表達、信號傳遞、生長、增殖、凋亡等至關重要[13]。力學刺激對于人體組織器官在正常發育不可或缺，否則會直接影響細胞之間的信號傳遞，細胞生長緩慢，增殖活力下降，細胞的形態功能逐漸退化，致使組織器官慢慢萎縮，功能減退。種子細胞作為組織工程中重要部分，其生理活性與所構建的組織器官的形態及功能關系密切。因此，體外培養的種子細胞應盡可能滿足體內的力學培養環境需要，特別是骨科的肌腱和心血管的管壁研究較多[14-16]。而膀胱種子細胞的體外壓力加載培養研究較少。
有研究發現，合適的機械力環境能夠促進膀胱發育和生長[1]；另一方面，大量的病理生理學證據顯示異常的機械力是損害膀胱的重要因素，例如，脊髓損傷或膀胱出口梗阻時膀胱壓力改變，導致疾病惡化，膀胱從細胞水平進而到大體水平都發生改變，最終出現低順應性膀胱[5, 17]。細胞水平的變化包括細胞增殖旺盛、細胞外基質分泌增加等，這些變化都涉及到細胞表型的改變[18]。機械力對膀胱平滑肌細胞的促進與損傷作用間是否同時存在于機械力加載早期尚無研究報道。
本研究選取了大多數研究認可的可促進膀胱平滑肌細胞增殖的壓力加載范圍進行研究[19]，探討在這一體外培養條件下，可促進細胞增殖的壓力范圍是否同時存在著損傷細胞的情況，結果初步揭示了機械力對細胞同時存在著促進和損傷的作用。
α-actin染色可顯示膀胱平滑肌細胞形態，目前認為平滑肌α-actin是“收縮型”平滑肌細胞表型的主要標志，其表達顯著下調表明平滑肌細胞發生表型轉化[20-21]。actin在平滑肌細胞中是其細胞收縮的主要成分，含量在所有收縮相關蛋白中居于首位，其穩定的表達量和在細胞質內規則而有序的排列是平滑肌細胞行使收縮功能的必要條件。α-actin作為細胞骨架的成分，還與其他骨架蛋白共同參與細胞在外界張力刺激下的被動形變過程，即與微絲協同產生抗拉作用，這種力學特性對維持細胞外形穩定具有重要的生物學意義[22-23]。在本研究選定的壓力條件下，實驗組與對照組細胞的α-actin表達差異有統計學意義（P＜0.001），表明生理狀態下的壓力刺激對膀胱平滑肌細胞的收縮能力確實具有促進作用。
熒光染料PI是一種可對DNA染色的細胞核染色試劑。PI不能通過活細胞膜，但卻能穿過破損的細胞膜而對核染色，試驗可借此發現被損傷的平滑肌細胞。本研究經PI染色后，實驗組陽性細胞數量高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.001），表明了在實驗設定的壓力培養條件下膀胱平滑肌細胞損傷的存在。
綜上所述，對膀胱平滑肌細胞而言，壓力同時具有促進作用和細胞損傷作用，在壓力加載培養體系中，即使是經過大量研究并被一致認為是相對安全的、可促進細胞增殖的壓力加載條件，其在促進細胞收縮蛋白表達的同時也會對膀胱平滑肌細胞造成損傷。
