引用本文： 聶世鴻, 臧健, 曹丹, 劉太國, 易成. 人參皂苷Rg3對小鼠大腸癌細胞的抗腫瘤活性研究. 華西醫學, 2015, 30(3): 411-416. doi: 10.7507/1002-0179.20150122 復制
大腸癌是威脅人類健康的常見惡性腫瘤，尤其在西方發達國家中的發病率較高，考慮與高脂肪飲食結構有很大關系。目前，我國大腸癌的發病率呈逐年上升趨勢，針對大腸癌的治療藥物主要有氟尿嘧啶類、奧沙利鉑、伊立替康和一些小分子靶向藥物如西妥昔單抗等，這些藥物在大腸癌術后輔助治療，晚期大腸癌的治療方面均起了積極作用[1-5]。但由于化學療法（化療）藥物長期的毒副作用、高昂的治療費用和腫瘤對化療藥物耐藥等情況的出現，晚期大腸癌患者均不可避免地走向死亡的邊緣，因此，需要有更多新的藥物來彌補目前大腸癌治療的不足。
人參皂苷Rg3是人參皂苷的一種亞型，目前的研究發現，人參皂苷Rg3可抑制肝癌、肺癌、黑色素瘤及乳腺癌等多種腫瘤的生長[6-9]。然而，人參皂苷Rg3對大腸癌的抗腫瘤活性研究相對較少，并且多數研究均為人參皂苷Rg3聯合化療藥物的抗腫瘤作用[10-14]，而對單藥人參皂苷Rg3的抗腫瘤活性研究相對缺乏。因此，本研究旨在從體內實驗到體外實驗2個層面觀察人參皂苷Rg3對大腸癌細胞的抗腫瘤效果。現報告如下。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 細胞株、動物、實驗藥物
小鼠大腸癌細胞株（CT26），由四川大學腫瘤生物治療國家重點實驗室提供。BALB/c小鼠（無特定病原體級別，雄性，6～8周，體質量20 g左右），由四川大學華西實驗動物中心提供。人參皂苷Rg3粉劑由吉林亞泰制藥股份有限公司提供，純度為96.6%。
1.1.2 實驗儀器及耗材
新生南美洲胎牛血清購自海克隆生物化學制品北京有限公司；RMPI-1640干粉購自美國Invitrogen公司Gibco培養基；四甲基偶氮唑藍（MTT）試劑購自上海Roche公司；細胞培養所用96孔板、6孔板均采用Nest品牌，倒置顯微鏡為Olympus CKX4型；MTT實驗檢測儀采用美國Bio-Rad 680酶標儀。
1.2 方法
1.2.1 細胞生長抑制率（MTT法）
用含10%胎牛血清的RMPI-1640培養基培養CT26細胞，將呈對數生長期的腫瘤細胞消化并制成細胞懸液，以每孔（3～4）×103個細胞接種于96孔板中，每孔中溶液體積100 μL，將培養板放入37℃、5%二氧化碳（CO2）、飽和濕度恒溫孵育箱孵育24 h后，換液培養，并將配有不同濃度人參皂苷Rg3的培養液溶液分別加入每個實驗孔中，濃度分別為0、5、10、15、20 μg/mL，每個濃度設5個復孔；未加藥物的為對照孔，空白孔設為調零孔，每孔中溶液終體積100 μL。再將加藥后的培養板放入37℃、5%CO2、飽和濕度恒溫孵育箱孵育24、48 h后，在每孔中加入MTT反應溶液15 μL，再在37℃、5%CO2、飽和濕度恒溫孵育箱中孵育4 h，終止培養，小心吸出每個培養孔中的上清液，再在每孔中加入二甲基亞砜 150 μL，室溫下搖床避光震蕩20 min，使培養孔中的甲臜充分溶解。將96孔板放入酶標儀中，選擇490 nm波長，檢測各孔的吸光度[A，舊稱光密度（OD）]值（A490 nm）。重復3次實驗并取平均值進行分析，計算細胞生長抑制率。細胞生長抑制率=（對照孔A值－實驗孔A值）/對照孔A值×100%。
1.2.2 動物模型的建立及分組
用含10%胎牛血清的RMPI-1640培養基培養CT26細胞，將細胞培養至對數生長期，倒掉培養液后用磷酸鹽緩沖液沖洗貼壁細胞，后用0.25%不含乙二胺四乙酸消化液的胰蛋白酶消化，將消化下來的細胞用800 r/min離心后倒掉上清液，再用不含血清的RMPI-1640培養基反復洗滌細胞2次后制備成細胞懸液，進行細胞計數，最后按每只1×107個細胞接種于BALB/c小鼠右側股背部皮下，1周左右可捫及到約3 mm大小腫塊。然后再將荷瘤小鼠隨機分為4組（每組10只），在接種后第8天開始給藥，生理鹽水組每天給予生理鹽水灌胃（100 μL/次），其余3組分別給予人參皂苷Rg3 濃度5、10、20 mg/kg灌胃處理，灌胃均為1次/d直至小鼠死亡。給藥期間重點觀測小鼠腫瘤生長大小、生存時間、生活質量及毒副反應（如小鼠飲食、體質量、精神狀態、腹瀉、脫毛及毛色改變等），每周3次用游標卡尺測量小鼠腫瘤長徑、短徑和小鼠體質量，繪制腫瘤生長曲線和體質量變化曲線。腫瘤體積（mm3）=0.5×長徑×短徑2。
1.2.3 腫瘤組織壞死觀察及壞死率的測定
另選一批小鼠，接種后隨機分為4組（每組5只），分組及給藥如前所述。給藥第10天處死小鼠，剝離腫瘤并稱重，將取出的腫瘤置于4%多聚甲醛溶液中固定，連續石蠟切片，蘇木精-伊紅（HE）染色后觀察組織壞死情況。腫瘤壞死率的計算：用固定規格的網狀方格（平行線間距為5 mm）隨機疊加于腫瘤斷面圖像上，分別計數位于壞死區及整個腫瘤斷面的交點數（2條相互垂直的平行線交點），取其平均值。由此獲得的腫瘤壞死區與整個腫瘤斷面的交點數之比即為腫瘤壞死率。
1.3 統計學方法
使用SPSS 13.0統計軟件進行統計分析。計量資料以均數±標準差表示，計數資料以百分比表示。腫瘤細胞生長抑制率的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q法；采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，生存分析采用對數秩檢驗；各組間小鼠生存質量的比較采用χ2檢驗。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 人參皂苷Rg3對腫瘤細胞生長抑制率的影響
隨著人參皂苷Rg3濃度的逐漸增高，腫瘤細胞的生長抑制率也逐漸增高，不同濃度人參皂苷Rg3（5、10、15、20 μg/mL）作用24 h的細胞生長抑制率分別為（20.30±2.48）%、（35.18±4.26）%、（37.55±2.74）%、（41.39±4.14）%，作用48 h的細胞生長抑制率分別為（3.04±0.08）%、（19.12±0.04）%、（33.21±0.03）%、（38.55±0.08）%，見表 1。Rg3作用24 h的細胞生長抑制較48 h的細胞生長抑制更明顯（圖 1、2）。
圖1
不同濃度人參皂苷Rg3作用24、48 h后細胞生長抑制率 *與作用48 h比較，P＜0.05? ?圖 2不同濃度人參皂苷Rg3作用24 h和48 h后細胞生長抑制率趨勢? ?圖 3腫瘤生長曲線? ?圖 4各組小鼠的生存曲線 4a. 4組小鼠生存時間比較 4b. Rg3濃度 5 mg/kg組與生理鹽水組比較 4c. Rg3濃度5 mg/kg組與10 mg/kg組比較 4d. Rg3濃度10 mg/kg組與20 mg/kg組比較 4e. Rg3濃度5 mg/kg組與20 mg/kg組比較? ?圖 5各組小鼠體質量趨勢圖
表1
不同濃度人參皂苷Rg3作用24、48 h后細胞生長抑制率（2.2 人參皂苷Rg3在抑制腫瘤生長中的作用
隨著人參皂苷Rg3濃度的提高，荷瘤小鼠腫瘤體積逐漸減低，每組間腫瘤體積從治療開始后13 d左右逐漸出現差別，第25天小鼠腫瘤體積差別達到最大。見圖 3。
2.3 人參皂苷Rg3對荷瘤小鼠生存期的影響
各組小鼠平均生存時間為：生理鹽水組為（40.0±3.4）d，Rg3濃度5 mg/kg組為（43.9±4.1）d，Rg3濃度10 mg/kg組為（56.2±5.5）d，Rg3濃度20 mg/kg 組為（62.7±5.8）d。生理鹽水組與Rg3濃度5 mg/kg 組平均生存時間差異無統計學意義（P＞0.05）。Rg3濃度10 mg/kg組與生理鹽水組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；與Rg3濃度5 mg/kg組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。Rg3濃度20 mg/kg組與生理鹽水組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；與Rg3濃度5 mg/kg組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。
通過生存分析發現4個治療組生存曲線比較，差異有統計學意義（P=0.002）；Rg3濃度5 mg/kg組與生理鹽水組比較，小鼠生存曲線差異無統計學意義（P=0.394）；Rg3濃度10 mg/kg組小鼠的生存率較Rg3濃度5 mg/kg組更高（P=0.047）；Rg3濃度10 mg/kg 組與Rg3濃度20 mg/kg組相比，小鼠生存曲線差異無統計學意義（P=0.217）；Rg3濃度20 mg/kg組小鼠的生存率較Rg3濃度5 mg/kg組更高（P=0.006）。見圖 4。
2.4 人參皂苷Rg3對荷瘤小鼠生活質量的影響
隨著治療時間的延長，小鼠體質量均有不同程度的下降，尤以生理鹽水組和Rg3濃度5mg/kg組體質量下降較為明顯（圖 5）。隨著腫瘤體積的不斷增加，各組小鼠的飲食、活動以及精神狀態均有不同程度的下降。生理鹽水組，Rg3濃度5、10、20 mg/kg組小鼠出現食欲下降的數量分別為7、5、2、2只，出現活動減少的數量分別為7、6、4、3只，出現精神變差的數量分別為7、7、4、4只。Rg3 濃度10、20 mg/kg 組小鼠出現飲食、活動及精神差的情況較生理鹽水組和5 mg/kg組少，其中食欲下降發生率差異有統計學意義（χ2=6.667，P=0.010），活動減少和精神變差發生率比較差異無統計學意義（P＞0.05）。在整個治療過程中并未觀察到小鼠出現腹瀉、脫毛及毛色改變等毒副作用。
2.5 人參皂苷Rg3對腫瘤組織壞死的影響
在前期動物實驗中發現，生理鹽水組與人參皂苷Rg3濃度5 mg/kg組的腫瘤大小及生存時間無明顯差異，因此在觀察腫瘤組織壞死情況時我們只選擇了生理鹽水組及Rg3濃度10、20 mg/kg組作為觀察對象。處死治療10 d的小鼠，此時各組腫瘤體積無明顯差異。取出腫瘤組織進行HE染色發現，Rg3濃度10、20 mg/kg組小鼠瘤內均有不同程度小面積壞死，并可見壞死區域內細胞核固縮改變，組織形態與周圍正常腫瘤組織存在明顯差別，而周圍腫瘤組織結構致密，可見明顯分裂相細胞；生理鹽水組腫瘤組織內壞死不明顯，表現為大片排列混亂但很致密的腫瘤細胞。見圖 6。
圖6
各組小鼠腫瘤組織染色（HE×400）
可見正常腫瘤組織（白箭），壞死腫瘤組織（黑箭） a.生理鹽水組，可見腫瘤組織中很少有壞死細胞出現 b. Rg3濃度10 mg/kg組，可見腫瘤組織中有較多壞死細胞出現 c. Rg3濃度20 mg/kg 組，可見腫瘤組織中有大量壞死細胞出現
各組間腫瘤壞死率：生理鹽水組為（6.4±1.5）%，Rg3濃度10 mg/kg組為（13.2±1.4）%，Rg3濃度20 mg/kg 組為（15.8±2.2）%，Rg3濃度10、20 mg/kg組腫瘤壞死率差異無統計學意義（P＞0.05），兩組與生理鹽水組比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）。見圖 7。
圖7
各組小鼠腫瘤組織壞死率比較
*與生理鹽水組比較，
3 討論
雖然很多研究已發現人參皂苷Rg3具有抗腫瘤作用，但其抗腫瘤作用效果卻一直未能被人認可。目前的很多研究主要觀察Rg3與其他抗腫瘤藥物的聯合應用的抗腫瘤效果，而單藥Rg3的抗腫瘤能力卻一直未能得到進一步研究，因此，人參皂苷Rg3的抗腫瘤作用值得進一步深入研究。
從體外實驗到體內實驗2個層面觀察人參皂甙Rg3對大腸癌細胞的抗腫瘤效果，在細胞水平觀察到在作用24 h后，20 μg/mL單藥人參皂苷Rg3對CT26細胞的生長抑制率可達41.39%，可見，體外研究結果提示人參皂苷Rg3具有明顯的抗腫瘤作用，并且這種腫瘤抑制作用是隨著Rg3濃度的提高而逐漸提高的，這樣的實驗結果同以往的研究結果是一致的[15]。我們在研究中發現，人參皂苷Rg3作用腫瘤細胞48 h后對細胞的生長抑制率＜24 h的細胞生長抑制率，考慮出現這種情況主要有以下2個原因：① 人參皂苷Rg3極難溶于水，即使先將其溶于二甲基亞砜，但在水中的最高濃度僅為20 μg/mL，考慮這樣的濃度與不斷增長的腫瘤細胞相比，其對腫瘤細胞的抑制作用很可能被腫瘤細胞自身的增殖作用所掩蓋。② 可能與人參皂苷Rg3本身的抗腫瘤特性有關。我們推測，人參皂苷Rg3的抗腫瘤效果在24 h 后會逐漸失去效力，而被細胞代謝。從我們的結果推測，人參皂苷Rg3可能屬于劑量依賴型抗腫瘤藥物，有關Rg3的藥理性質還需更多的研究加以闡明。
我們在體內實驗中也同樣發現，隨著Rg3劑量的提高，荷瘤小鼠腫瘤生長較慢，從腫瘤生長曲線可以觀察到，給藥組的腫瘤體積均明顯低于生理鹽水組水平。我們又進一步對小鼠治療期間的生存質量和毒副作用進行分析，并未觀察到人參皂苷Rg3治療后小鼠有明顯毒副作用，在整個治療期間，各組小鼠體質量隨著腫瘤的不斷生長均有不同程度的下降，但人參皂苷Rg3治療組的體質量下降較慢，這樣的結果與前面腫瘤生長、生存期的結果是一致的。進一步通過HE染色發現，Rg3濃度10、20 mg/kg兩個劑量治療10 d后腫瘤組織內均有小面積的凋亡壞死出現，而生理鹽水組幾乎看不到壞死組織。對腫瘤組織壞死率進行比較發現，生理鹽水組壞死率為6.4%，而人參皂甙Rg3 濃度10、20 mg/kg組的壞死率分別為13.2%和15.8%，隨著Rg3濃度的提高，腫瘤壞死率也升高，然而，取材時的腫瘤體積在3個組并無明顯差別。
綜上所述，本研究結果顯示，人參皂苷Rg3是一個有效的抗腫瘤藥物，體外實驗顯示其對腫瘤細胞的生長抑制率最高為41.39%，在動物實驗發現，其最高腫瘤抑制率為45.75%，腫瘤抑制率是隨著人參皂苷Rg3濃度的提高而逐漸升高的。當然，該藥的最高抗腫瘤劑量和最高耐受劑量仍需要進一步探索研究。此外，由于我們的研究并未將人參皂苷Rg3和傳統抗腫瘤藥物如氟尿嘧啶、鉑類藥物的抗腫瘤效果進行比較，因此，還需要更多的研究進一步觀察人參皂苷Rg3的抗腫瘤效果是否不低于其他化療藥物。
大腸癌是威脅人類健康的常見惡性腫瘤，尤其在西方發達國家中的發病率較高，考慮與高脂肪飲食結構有很大關系。目前，我國大腸癌的發病率呈逐年上升趨勢，針對大腸癌的治療藥物主要有氟尿嘧啶類、奧沙利鉑、伊立替康和一些小分子靶向藥物如西妥昔單抗等，這些藥物在大腸癌術后輔助治療，晚期大腸癌的治療方面均起了積極作用[1-5]。但由于化學療法（化療）藥物長期的毒副作用、高昂的治療費用和腫瘤對化療藥物耐藥等情況的出現，晚期大腸癌患者均不可避免地走向死亡的邊緣，因此，需要有更多新的藥物來彌補目前大腸癌治療的不足。
人參皂苷Rg3是人參皂苷的一種亞型，目前的研究發現，人參皂苷Rg3可抑制肝癌、肺癌、黑色素瘤及乳腺癌等多種腫瘤的生長[6-9]。然而，人參皂苷Rg3對大腸癌的抗腫瘤活性研究相對較少，并且多數研究均為人參皂苷Rg3聯合化療藥物的抗腫瘤作用[10-14]，而對單藥人參皂苷Rg3的抗腫瘤活性研究相對缺乏。因此，本研究旨在從體內實驗到體外實驗2個層面觀察人參皂苷Rg3對大腸癌細胞的抗腫瘤效果。現報告如下。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 細胞株、動物、實驗藥物
小鼠大腸癌細胞株（CT26），由四川大學腫瘤生物治療國家重點實驗室提供。BALB/c小鼠（無特定病原體級別，雄性，6～8周，體質量20 g左右），由四川大學華西實驗動物中心提供。人參皂苷Rg3粉劑由吉林亞泰制藥股份有限公司提供，純度為96.6%。
1.1.2 實驗儀器及耗材
新生南美洲胎牛血清購自海克隆生物化學制品北京有限公司；RMPI-1640干粉購自美國Invitrogen公司Gibco培養基；四甲基偶氮唑藍（MTT）試劑購自上海Roche公司；細胞培養所用96孔板、6孔板均采用Nest品牌，倒置顯微鏡為Olympus CKX4型；MTT實驗檢測儀采用美國Bio-Rad 680酶標儀。
1.2 方法
1.2.1 細胞生長抑制率（MTT法）
用含10%胎牛血清的RMPI-1640培養基培養CT26細胞，將呈對數生長期的腫瘤細胞消化并制成細胞懸液，以每孔（3～4）×103個細胞接種于96孔板中，每孔中溶液體積100 μL，將培養板放入37℃、5%二氧化碳（CO2）、飽和濕度恒溫孵育箱孵育24 h后，換液培養，并將配有不同濃度人參皂苷Rg3的培養液溶液分別加入每個實驗孔中，濃度分別為0、5、10、15、20 μg/mL，每個濃度設5個復孔；未加藥物的為對照孔，空白孔設為調零孔，每孔中溶液終體積100 μL。再將加藥后的培養板放入37℃、5%CO2、飽和濕度恒溫孵育箱孵育24、48 h后，在每孔中加入MTT反應溶液15 μL，再在37℃、5%CO2、飽和濕度恒溫孵育箱中孵育4 h，終止培養，小心吸出每個培養孔中的上清液，再在每孔中加入二甲基亞砜 150 μL，室溫下搖床避光震蕩20 min，使培養孔中的甲臜充分溶解。將96孔板放入酶標儀中，選擇490 nm波長，檢測各孔的吸光度[A，舊稱光密度（OD）]值（A490 nm）。重復3次實驗并取平均值進行分析，計算細胞生長抑制率。細胞生長抑制率=（對照孔A值－實驗孔A值）/對照孔A值×100%。
1.2.2 動物模型的建立及分組
用含10%胎牛血清的RMPI-1640培養基培養CT26細胞，將細胞培養至對數生長期，倒掉培養液后用磷酸鹽緩沖液沖洗貼壁細胞，后用0.25%不含乙二胺四乙酸消化液的胰蛋白酶消化，將消化下來的細胞用800 r/min離心后倒掉上清液，再用不含血清的RMPI-1640培養基反復洗滌細胞2次后制備成細胞懸液，進行細胞計數，最后按每只1×107個細胞接種于BALB/c小鼠右側股背部皮下，1周左右可捫及到約3 mm大小腫塊。然后再將荷瘤小鼠隨機分為4組（每組10只），在接種后第8天開始給藥，生理鹽水組每天給予生理鹽水灌胃（100 μL/次），其余3組分別給予人參皂苷Rg3 濃度5、10、20 mg/kg灌胃處理，灌胃均為1次/d直至小鼠死亡。給藥期間重點觀測小鼠腫瘤生長大小、生存時間、生活質量及毒副反應（如小鼠飲食、體質量、精神狀態、腹瀉、脫毛及毛色改變等），每周3次用游標卡尺測量小鼠腫瘤長徑、短徑和小鼠體質量，繪制腫瘤生長曲線和體質量變化曲線。腫瘤體積（mm3）=0.5×長徑×短徑2。
1.2.3 腫瘤組織壞死觀察及壞死率的測定
另選一批小鼠，接種后隨機分為4組（每組5只），分組及給藥如前所述。給藥第10天處死小鼠，剝離腫瘤并稱重，將取出的腫瘤置于4%多聚甲醛溶液中固定，連續石蠟切片，蘇木精-伊紅（HE）染色后觀察組織壞死情況。腫瘤壞死率的計算：用固定規格的網狀方格（平行線間距為5 mm）隨機疊加于腫瘤斷面圖像上，分別計數位于壞死區及整個腫瘤斷面的交點數（2條相互垂直的平行線交點），取其平均值。由此獲得的腫瘤壞死區與整個腫瘤斷面的交點數之比即為腫瘤壞死率。
1.3 統計學方法
使用SPSS 13.0統計軟件進行統計分析。計量資料以均數±標準差表示，計數資料以百分比表示。腫瘤細胞生長抑制率的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q法；采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，生存分析采用對數秩檢驗；各組間小鼠生存質量的比較采用χ2檢驗。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 人參皂苷Rg3對腫瘤細胞生長抑制率的影響
隨著人參皂苷Rg3濃度的逐漸增高，腫瘤細胞的生長抑制率也逐漸增高，不同濃度人參皂苷Rg3（5、10、15、20 μg/mL）作用24 h的細胞生長抑制率分別為（20.30±2.48）%、（35.18±4.26）%、（37.55±2.74）%、（41.39±4.14）%，作用48 h的細胞生長抑制率分別為（3.04±0.08）%、（19.12±0.04）%、（33.21±0.03）%、（38.55±0.08）%，見表 1。Rg3作用24 h的細胞生長抑制較48 h的細胞生長抑制更明顯（圖 1、2）。
圖1
不同濃度人參皂苷Rg3作用24、48 h后細胞生長抑制率 *與作用48 h比較，P＜0.05? ?圖 2不同濃度人參皂苷Rg3作用24 h和48 h后細胞生長抑制率趨勢? ?圖 3腫瘤生長曲線? ?圖 4各組小鼠的生存曲線 4a. 4組小鼠生存時間比較 4b. Rg3濃度 5 mg/kg組與生理鹽水組比較 4c. Rg3濃度5 mg/kg組與10 mg/kg組比較 4d. Rg3濃度10 mg/kg組與20 mg/kg組比較 4e. Rg3濃度5 mg/kg組與20 mg/kg組比較? ?圖 5各組小鼠體質量趨勢圖
表1
不同濃度人參皂苷Rg3作用24、48 h后細胞生長抑制率（2.2 人參皂苷Rg3在抑制腫瘤生長中的作用
隨著人參皂苷Rg3濃度的提高，荷瘤小鼠腫瘤體積逐漸減低，每組間腫瘤體積從治療開始后13 d左右逐漸出現差別，第25天小鼠腫瘤體積差別達到最大。見圖 3。
2.3 人參皂苷Rg3對荷瘤小鼠生存期的影響
各組小鼠平均生存時間為：生理鹽水組為（40.0±3.4）d，Rg3濃度5 mg/kg組為（43.9±4.1）d，Rg3濃度10 mg/kg組為（56.2±5.5）d，Rg3濃度20 mg/kg 組為（62.7±5.8）d。生理鹽水組與Rg3濃度5 mg/kg 組平均生存時間差異無統計學意義（P＞0.05）。Rg3濃度10 mg/kg組與生理鹽水組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；與Rg3濃度5 mg/kg組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。Rg3濃度20 mg/kg組與生理鹽水組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；與Rg3濃度5 mg/kg組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。
通過生存分析發現4個治療組生存曲線比較，差異有統計學意義（P=0.002）；Rg3濃度5 mg/kg組與生理鹽水組比較，小鼠生存曲線差異無統計學意義（P=0.394）；Rg3濃度10 mg/kg組小鼠的生存率較Rg3濃度5 mg/kg組更高（P=0.047）；Rg3濃度10 mg/kg 組與Rg3濃度20 mg/kg組相比，小鼠生存曲線差異無統計學意義（P=0.217）；Rg3濃度20 mg/kg組小鼠的生存率較Rg3濃度5 mg/kg組更高（P=0.006）。見圖 4。
2.4 人參皂苷Rg3對荷瘤小鼠生活質量的影響
隨著治療時間的延長，小鼠體質量均有不同程度的下降，尤以生理鹽水組和Rg3濃度5mg/kg組體質量下降較為明顯（圖 5）。隨著腫瘤體積的不斷增加，各組小鼠的飲食、活動以及精神狀態均有不同程度的下降。生理鹽水組，Rg3濃度5、10、20 mg/kg組小鼠出現食欲下降的數量分別為7、5、2、2只，出現活動減少的數量分別為7、6、4、3只，出現精神變差的數量分別為7、7、4、4只。Rg3 濃度10、20 mg/kg 組小鼠出現飲食、活動及精神差的情況較生理鹽水組和5 mg/kg組少，其中食欲下降發生率差異有統計學意義（χ2=6.667，P=0.010），活動減少和精神變差發生率比較差異無統計學意義（P＞0.05）。在整個治療過程中并未觀察到小鼠出現腹瀉、脫毛及毛色改變等毒副作用。
2.5 人參皂苷Rg3對腫瘤組織壞死的影響
在前期動物實驗中發現，生理鹽水組與人參皂苷Rg3濃度5 mg/kg組的腫瘤大小及生存時間無明顯差異，因此在觀察腫瘤組織壞死情況時我們只選擇了生理鹽水組及Rg3濃度10、20 mg/kg組作為觀察對象。處死治療10 d的小鼠，此時各組腫瘤體積無明顯差異。取出腫瘤組織進行HE染色發現，Rg3濃度10、20 mg/kg組小鼠瘤內均有不同程度小面積壞死，并可見壞死區域內細胞核固縮改變，組織形態與周圍正常腫瘤組織存在明顯差別，而周圍腫瘤組織結構致密，可見明顯分裂相細胞；生理鹽水組腫瘤組織內壞死不明顯，表現為大片排列混亂但很致密的腫瘤細胞。見圖 6。
圖6
各組小鼠腫瘤組織染色（HE×400）
可見正常腫瘤組織（白箭），壞死腫瘤組織（黑箭） a.生理鹽水組，可見腫瘤組織中很少有壞死細胞出現 b. Rg3濃度10 mg/kg組，可見腫瘤組織中有較多壞死細胞出現 c. Rg3濃度20 mg/kg 組，可見腫瘤組織中有大量壞死細胞出現
各組間腫瘤壞死率：生理鹽水組為（6.4±1.5）%，Rg3濃度10 mg/kg組為（13.2±1.4）%，Rg3濃度20 mg/kg 組為（15.8±2.2）%，Rg3濃度10、20 mg/kg組腫瘤壞死率差異無統計學意義（P＞0.05），兩組與生理鹽水組比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）。見圖 7。
圖7
各組小鼠腫瘤組織壞死率比較
*與生理鹽水組比較，
3 討論
雖然很多研究已發現人參皂苷Rg3具有抗腫瘤作用，但其抗腫瘤作用效果卻一直未能被人認可。目前的很多研究主要觀察Rg3與其他抗腫瘤藥物的聯合應用的抗腫瘤效果，而單藥Rg3的抗腫瘤能力卻一直未能得到進一步研究，因此，人參皂苷Rg3的抗腫瘤作用值得進一步深入研究。
從體外實驗到體內實驗2個層面觀察人參皂甙Rg3對大腸癌細胞的抗腫瘤效果，在細胞水平觀察到在作用24 h后，20 μg/mL單藥人參皂苷Rg3對CT26細胞的生長抑制率可達41.39%，可見，體外研究結果提示人參皂苷Rg3具有明顯的抗腫瘤作用，并且這種腫瘤抑制作用是隨著Rg3濃度的提高而逐漸提高的，這樣的實驗結果同以往的研究結果是一致的[15]。我們在研究中發現，人參皂苷Rg3作用腫瘤細胞48 h后對細胞的生長抑制率＜24 h的細胞生長抑制率，考慮出現這種情況主要有以下2個原因：① 人參皂苷Rg3極難溶于水，即使先將其溶于二甲基亞砜，但在水中的最高濃度僅為20 μg/mL，考慮這樣的濃度與不斷增長的腫瘤細胞相比，其對腫瘤細胞的抑制作用很可能被腫瘤細胞自身的增殖作用所掩蓋。② 可能與人參皂苷Rg3本身的抗腫瘤特性有關。我們推測，人參皂苷Rg3的抗腫瘤效果在24 h 后會逐漸失去效力，而被細胞代謝。從我們的結果推測，人參皂苷Rg3可能屬于劑量依賴型抗腫瘤藥物，有關Rg3的藥理性質還需更多的研究加以闡明。
我們在體內實驗中也同樣發現，隨著Rg3劑量的提高，荷瘤小鼠腫瘤生長較慢，從腫瘤生長曲線可以觀察到，給藥組的腫瘤體積均明顯低于生理鹽水組水平。我們又進一步對小鼠治療期間的生存質量和毒副作用進行分析，并未觀察到人參皂苷Rg3治療后小鼠有明顯毒副作用，在整個治療期間，各組小鼠體質量隨著腫瘤的不斷生長均有不同程度的下降，但人參皂苷Rg3治療組的體質量下降較慢，這樣的結果與前面腫瘤生長、生存期的結果是一致的。進一步通過HE染色發現，Rg3濃度10、20 mg/kg兩個劑量治療10 d后腫瘤組織內均有小面積的凋亡壞死出現，而生理鹽水組幾乎看不到壞死組織。對腫瘤組織壞死率進行比較發現，生理鹽水組壞死率為6.4%，而人參皂甙Rg3 濃度10、20 mg/kg組的壞死率分別為13.2%和15.8%，隨著Rg3濃度的提高，腫瘤壞死率也升高，然而，取材時的腫瘤體積在3個組并無明顯差別。
綜上所述，本研究結果顯示，人參皂苷Rg3是一個有效的抗腫瘤藥物，體外實驗顯示其對腫瘤細胞的生長抑制率最高為41.39%，在動物實驗發現，其最高腫瘤抑制率為45.75%，腫瘤抑制率是隨著人參皂苷Rg3濃度的提高而逐漸升高的。當然，該藥的最高抗腫瘤劑量和最高耐受劑量仍需要進一步探索研究。此外，由于我們的研究并未將人參皂苷Rg3和傳統抗腫瘤藥物如氟尿嘧啶、鉑類藥物的抗腫瘤效果進行比較，因此，還需要更多的研究進一步觀察人參皂苷Rg3的抗腫瘤效果是否不低于其他化療藥物。
