引用本文： 徐銳, 陳旭, 王莉, 劉凱歌, 成碧萍. 腫瘤壞死因子-α在前列腺癌組織中的表達及臨床意義. 華西醫學, 2015, 30(3): 407-410. doi: 10.7507/1002-0179.20150121 復制
前列腺癌是威脅男性健康的常見惡性腫瘤之一，在歐美國家發病率居第1位[1]，盡管我國前列腺癌的發病率低于西方國家，但近年來呈上升趨勢，且病死率明顯高于歐美國家[2]。因此探尋前列腺癌早期診斷和治療方法成為前列腺癌研究的熱點。腫瘤壞死因子-α（TNF-α）是細胞因子網絡中的重要組成部分，研究表明TNF-α能夠促進或抑制腫瘤的發生[3-4]。CD105（endoglin）是主要表達于新生血管內皮細胞的一種糖蛋白，目前被公認為是血管生成最好的標志物[5]。本研究通過免疫組織化學法檢測前列腺增生組織和前列腺癌組織中TNF-α蛋白的表達，同時檢測CD105標記的微血管密度（MVD），初步探討兩者的相關性，為深入研究前列腺癌的發生發展機制及判斷預后提供理論基礎。
1 資料與方法
1.1 一般資料
50例前列腺癌組織標本來自2010年1月－2012年1月第四軍醫大學西京醫院和西安醫學院第一附屬醫院泌尿外科住院患者。患者年齡52～85歲，平均（68.5±6.5）歲。病理類型全部為腺癌。按Gleason分級標準（1977年）[6]進行病理分級，其中高分化（Gleason 2～4分）16例，中分化（Gleason 5～7分）14例，低分化（Gleason 8～10分）20例。臨床分期按Jeweet-Whitomore-Prout系統[7]進行，其中A+B期26例，C+D期24例。所有患者均經穿刺取活體組織和手術切除后液氮保存標本，并經病理組織學確診。另選取前列腺增生組織標本20例，患者年齡48～83歲，平均（63.5±7.5）歲，術前無泌尿生殖系統感染。
1.2 試劑和方法
兔抗人TNF-α多克隆抗體購于北京博奧森生物技術公司，鼠抗人CD105單克隆抗體購于北京中杉生物技術公司，免疫組織化學鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結（SP）試劑盒和3，3’二氨基聯苯胺四鹽酸鹽（DAB）顯色劑購于北京中杉生物技術公司。所有標本均經4%甲醛固定，常規石蠟包埋，4 μm連續切片，分別行蘇木精-伊紅染色及免疫組織化學染色。石蠟切片梯度乙醇和二甲苯脫蠟后，微波修復抗原15 min，3%過氧化氫孵育10 min消除內源性過氧化物酶活性，滴加兔抗人TNF-α多克隆抗體（滴度1︰100），鼠抗人CD105單克隆抗體（滴度1︰70），4 ℃過夜，0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗，DAB顯色，蘇木精復染，封片。以PBS代替一抗作為陰性對照。
1.3 結果判定標準
TNF-α陽性染色定位于細胞膜或者細胞質，呈棕黃色染色。采用陽性標記指數判斷染色結果，隨機選取10個高倍視野，計算每個視野內100個細胞，總共計數1 000個細胞，計算出平均陽性率，即得陽性標記指數，計算公式為：陽性標記指數=（陽性細胞數/計數細胞總數）×100%。腫瘤內MVD計數：CD105作用于新生血管內皮細胞顯色棕黃色，以每一個染成棕黃色的，可以與周圍血管、腫瘤細胞及其他結締組織相分離的內皮細胞或內皮細胞簇，認定為一個單一的可計數的微血管。MVD計數和評定采用Weidneris法[8]：低倍視野（×100）光學顯微鏡下全面觀察切片，選取腫瘤微血管數量（CD105）最豐富的區域，再于高倍視野（×400）下，計數每個區域微血管數量，每張切片記錄5個高倍視野下微血管數目，以其平均值作為每例的MVD，用MVD值來表示CD105的表達量。
1.4 統計學方法
采用SPSS 13.0軟件進行數據的統計分析。計量資料以均數±標準差表示，兩組間比較用t檢驗或t'檢驗，多組間比較用單因素方差分析；計數資料組間比較采用χ2檢驗；相關性分析采用Spearman等級相關分析。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 TNF-α和CD105在前列腺增生組織與前列腺癌中的表達
TNF-α在前列腺癌組織的腫瘤細胞膜及細胞質中表達較高（41.72±8.67），而在前列腺增生組織中表達較低（21.01±3.85）；CD105在前列腺癌中陽性染色定位于腫瘤微血管內皮細胞膜表達較高（20.15±2.67），而在前列腺增生組織中表達（4.34±1.67），兩者差異有統計學意義（P＜0.001）。見圖 1、2，表 1。
圖1
前列腺增生組織和前列腺癌中TNF-α的表達（SP×200） 1a. 前列腺增生組織 1b. 高分化前列腺癌 1c. 中分化前列腺癌 1d. 低分化前列腺癌? ?圖 2前列腺增生組織和低分化前列腺癌中CD105表達（SP×100） 2a. 前列腺增生組織 2b. 低分化前列腺癌
表1
TNF-α和CD105-MVD在前列腺癌和前列腺增生組織中的表達（2.2 前列腺癌中TNF-α表達與MVD的相關性分析
Spearman等級相關分析顯示TNF-α和CD105-MVD表達與前列腺癌臨床分期呈正相關（rs=0.847，P＜0.001；rs=0.776，P＜0.001）；與病理分級呈負相關（rs=-0.769，P＜0.001；rs=-0.842，P＜0.001），隨著前列腺癌病理分化程度的降低TNF-α和CD105-MVD表達逐漸增高；Spearman等級相關性分析還顯示TNF-α表達和CD105-MVD在前列腺癌中的表達呈正相關（rs=0.890，P=0.001）。不同病理參數前列腺癌組織中TNF-α、CD105-MVD比較見表 2。
表2
不同病理參數前列腺癌組織中TNF-α、CD105-MVD比較（3 討論
TNF-α屬Ⅱ型膜蛋白，是一種主要由活化的單核巨噬細胞分泌產生的多功能細胞因子，廣泛存在于人體各種組織中，但近年來的研究發現，TNF-α與腫瘤的發生及進展密切相關[9]。
TNF-α在胃癌及大腸癌中高表達，且與腫瘤的病理分級有關，與分化程度呈正相關[10-11]。有其他臟器轉移的腫瘤患者血清中TNF-α測定水平明顯高于無轉移患者及正常對照組[12-13]。研究發現TNF-α的表達與腫瘤轉移有明顯的正相關，可能對腫瘤轉移有一定的增殖效應[14-15]。本研究結果顯示TNF-α在前列腺癌組織中的表達較前列腺增生組織明顯升高，TNF-α在前列腺癌組織中的表達與患者年齡、腫瘤大小無關，主要與前列腺癌的病理分級、臨床分期有關。這可能和本研究樣本量小有關，還需擴大樣本進一步研究。
腫瘤的發生發展依賴于血管生成，而新生血管是腫瘤具有侵襲性的基礎。CD105是調節轉化生長因子-β受體復合物的成分之一，位于人類第9號染色體長臂34基因區域，在各種類型腫瘤的診斷和治療中逐漸成為最重要的血管定位的新型工具[16-17]。在處于增生狀態的腫瘤組織血管內皮細胞（新生的血管內皮細胞）上強烈表達，而在正常組織血管上無或者僅微弱表達[18]。本研究中CD105標記的前列腺癌微血管定量檢測顯示：CD105-MVD在前列腺癌組織中高表達，在前列腺增生組織中低表達，提示CD105可能在前列腺癌血管生成中起重要作用。張少華等[19]研究發現，高分化卵巢癌CD105-MVD明顯低于低分化卵巢癌，且隨著腫瘤惡性程度的加重CD105的表達逐漸增高，這與我們的研究結果相符合，因此CD105-MVD可以作為預測腫瘤浸潤、轉移的重要指標。
綜上所述，本研究結果表明前列腺癌組織中TNF-α表達與CD105-MVD呈正相關。故推測前列腺癌組織中TNF-α的表達可能是通過促進腫瘤微血管新生來參與腫瘤生長而導致前列腺癌侵襲、轉移的，因此進一步研究TNF-α和CD105可以幫助前列腺子的早期診斷、病情監測及判斷預后，也為腫瘤靶向治療提供新的思路。
前列腺癌是威脅男性健康的常見惡性腫瘤之一，在歐美國家發病率居第1位[1]，盡管我國前列腺癌的發病率低于西方國家，但近年來呈上升趨勢，且病死率明顯高于歐美國家[2]。因此探尋前列腺癌早期診斷和治療方法成為前列腺癌研究的熱點。腫瘤壞死因子-α（TNF-α）是細胞因子網絡中的重要組成部分，研究表明TNF-α能夠促進或抑制腫瘤的發生[3-4]。CD105（endoglin）是主要表達于新生血管內皮細胞的一種糖蛋白，目前被公認為是血管生成最好的標志物[5]。本研究通過免疫組織化學法檢測前列腺增生組織和前列腺癌組織中TNF-α蛋白的表達，同時檢測CD105標記的微血管密度（MVD），初步探討兩者的相關性，為深入研究前列腺癌的發生發展機制及判斷預后提供理論基礎。
1 資料與方法
1.1 一般資料
50例前列腺癌組織標本來自2010年1月－2012年1月第四軍醫大學西京醫院和西安醫學院第一附屬醫院泌尿外科住院患者。患者年齡52～85歲，平均（68.5±6.5）歲。病理類型全部為腺癌。按Gleason分級標準（1977年）[6]進行病理分級，其中高分化（Gleason 2～4分）16例，中分化（Gleason 5～7分）14例，低分化（Gleason 8～10分）20例。臨床分期按Jeweet-Whitomore-Prout系統[7]進行，其中A+B期26例，C+D期24例。所有患者均經穿刺取活體組織和手術切除后液氮保存標本，并經病理組織學確診。另選取前列腺增生組織標本20例，患者年齡48～83歲，平均（63.5±7.5）歲，術前無泌尿生殖系統感染。
1.2 試劑和方法
兔抗人TNF-α多克隆抗體購于北京博奧森生物技術公司，鼠抗人CD105單克隆抗體購于北京中杉生物技術公司，免疫組織化學鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結（SP）試劑盒和3，3’二氨基聯苯胺四鹽酸鹽（DAB）顯色劑購于北京中杉生物技術公司。所有標本均經4%甲醛固定，常規石蠟包埋，4 μm連續切片，分別行蘇木精-伊紅染色及免疫組織化學染色。石蠟切片梯度乙醇和二甲苯脫蠟后，微波修復抗原15 min，3%過氧化氫孵育10 min消除內源性過氧化物酶活性，滴加兔抗人TNF-α多克隆抗體（滴度1︰100），鼠抗人CD105單克隆抗體（滴度1︰70），4 ℃過夜，0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗，DAB顯色，蘇木精復染，封片。以PBS代替一抗作為陰性對照。
1.3 結果判定標準
TNF-α陽性染色定位于細胞膜或者細胞質，呈棕黃色染色。采用陽性標記指數判斷染色結果，隨機選取10個高倍視野，計算每個視野內100個細胞，總共計數1 000個細胞，計算出平均陽性率，即得陽性標記指數，計算公式為：陽性標記指數=（陽性細胞數/計數細胞總數）×100%。腫瘤內MVD計數：CD105作用于新生血管內皮細胞顯色棕黃色，以每一個染成棕黃色的，可以與周圍血管、腫瘤細胞及其他結締組織相分離的內皮細胞或內皮細胞簇，認定為一個單一的可計數的微血管。MVD計數和評定采用Weidneris法[8]：低倍視野（×100）光學顯微鏡下全面觀察切片，選取腫瘤微血管數量（CD105）最豐富的區域，再于高倍視野（×400）下，計數每個區域微血管數量，每張切片記錄5個高倍視野下微血管數目，以其平均值作為每例的MVD，用MVD值來表示CD105的表達量。
1.4 統計學方法
采用SPSS 13.0軟件進行數據的統計分析。計量資料以均數±標準差表示，兩組間比較用t檢驗或t'檢驗，多組間比較用單因素方差分析；計數資料組間比較采用χ2檢驗；相關性分析采用Spearman等級相關分析。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 TNF-α和CD105在前列腺增生組織與前列腺癌中的表達
TNF-α在前列腺癌組織的腫瘤細胞膜及細胞質中表達較高（41.72±8.67），而在前列腺增生組織中表達較低（21.01±3.85）；CD105在前列腺癌中陽性染色定位于腫瘤微血管內皮細胞膜表達較高（20.15±2.67），而在前列腺增生組織中表達（4.34±1.67），兩者差異有統計學意義（P＜0.001）。見圖 1、2，表 1。
圖1
前列腺增生組織和前列腺癌中TNF-α的表達（SP×200） 1a. 前列腺增生組織 1b. 高分化前列腺癌 1c. 中分化前列腺癌 1d. 低分化前列腺癌? ?圖 2前列腺增生組織和低分化前列腺癌中CD105表達（SP×100） 2a. 前列腺增生組織 2b. 低分化前列腺癌
表1
TNF-α和CD105-MVD在前列腺癌和前列腺增生組織中的表達（2.2 前列腺癌中TNF-α表達與MVD的相關性分析
Spearman等級相關分析顯示TNF-α和CD105-MVD表達與前列腺癌臨床分期呈正相關（rs=0.847，P＜0.001；rs=0.776，P＜0.001）；與病理分級呈負相關（rs=-0.769，P＜0.001；rs=-0.842，P＜0.001），隨著前列腺癌病理分化程度的降低TNF-α和CD105-MVD表達逐漸增高；Spearman等級相關性分析還顯示TNF-α表達和CD105-MVD在前列腺癌中的表達呈正相關（rs=0.890，P=0.001）。不同病理參數前列腺癌組織中TNF-α、CD105-MVD比較見表 2。
表2
不同病理參數前列腺癌組織中TNF-α、CD105-MVD比較（3 討論
TNF-α屬Ⅱ型膜蛋白，是一種主要由活化的單核巨噬細胞分泌產生的多功能細胞因子，廣泛存在于人體各種組織中，但近年來的研究發現，TNF-α與腫瘤的發生及進展密切相關[9]。
TNF-α在胃癌及大腸癌中高表達，且與腫瘤的病理分級有關，與分化程度呈正相關[10-11]。有其他臟器轉移的腫瘤患者血清中TNF-α測定水平明顯高于無轉移患者及正常對照組[12-13]。研究發現TNF-α的表達與腫瘤轉移有明顯的正相關，可能對腫瘤轉移有一定的增殖效應[14-15]。本研究結果顯示TNF-α在前列腺癌組織中的表達較前列腺增生組織明顯升高，TNF-α在前列腺癌組織中的表達與患者年齡、腫瘤大小無關，主要與前列腺癌的病理分級、臨床分期有關。這可能和本研究樣本量小有關，還需擴大樣本進一步研究。
腫瘤的發生發展依賴于血管生成，而新生血管是腫瘤具有侵襲性的基礎。CD105是調節轉化生長因子-β受體復合物的成分之一，位于人類第9號染色體長臂34基因區域，在各種類型腫瘤的診斷和治療中逐漸成為最重要的血管定位的新型工具[16-17]。在處于增生狀態的腫瘤組織血管內皮細胞（新生的血管內皮細胞）上強烈表達，而在正常組織血管上無或者僅微弱表達[18]。本研究中CD105標記的前列腺癌微血管定量檢測顯示：CD105-MVD在前列腺癌組織中高表達，在前列腺增生組織中低表達，提示CD105可能在前列腺癌血管生成中起重要作用。張少華等[19]研究發現，高分化卵巢癌CD105-MVD明顯低于低分化卵巢癌，且隨著腫瘤惡性程度的加重CD105的表達逐漸增高，這與我們的研究結果相符合，因此CD105-MVD可以作為預測腫瘤浸潤、轉移的重要指標。
綜上所述，本研究結果表明前列腺癌組織中TNF-α表達與CD105-MVD呈正相關。故推測前列腺癌組織中TNF-α的表達可能是通過促進腫瘤微血管新生來參與腫瘤生長而導致前列腺癌侵襲、轉移的，因此進一步研究TNF-α和CD105可以幫助前列腺子的早期診斷、病情監測及判斷預后，也為腫瘤靶向治療提供新的思路。
