引用本文： 楊陽. 情緒應激大鼠顳下頜關節誘生型一氧化氮合酶的表達. 華西醫學, 2015, 30(2): 315-317. doi: 10.7507/1002-0179.20150092 復制
顳下頜關節紊亂病（TMD）并非指單一疾病，它是一類病因尚未完全清楚而又有共同發病因素和臨床主要癥狀的一組疾病的總稱。目前對其詳細的發病機制尚未完全闡明[1]，多數學者的觀點認為是多因素發病，與心理社會因素、因素、免疫因素、關節負荷過重、關節解剖等因素有關，其中心理社會因素是其主要病因之一[2-3]。隨著醫學模式的轉變，人們越來越重視心理因素對疾病的影響，迫切需要研究情緒應激導致軀體疾病的發病機制。由于利用人體進行情緒應激與TMD關系的研究受到很大限制，建立合適的動物模型有助于研究的進行。目前對情緒應激的研究較多采用的是以不確定性空瓶飲水刺激作為應激源的情緒應激模型[4]。
本實驗通過動物模型，應用免疫組織化學方法，觀察情緒刺激不同時期誘生型一氧化氮合酶（iNOS）在顳下頜關節（TMJ）中的表達強度及其在組織中的定位，以求探討TMD可能的發病機制，期待能對臨床治療提供一些參考。現報告如下。
1 材料與方法
1.1 材料
實驗選用遼寧醫學院實驗動物中心提供的成年Sprague-Dawley （SD） 雄性大鼠40只，體質量約150 g，單籠喂養。在實驗室中經過適應期7 d，光/暗周期為12 h/12 h（光照時間08:00－20:00），室內溫度為（22.0±0.5）℃，濕度為50%左右。適應期內所有動物自由攝食和飲水，每天接受3 min撫摸。觀察大鼠無明顯全身疾患，無失牙及咬合紊亂，無關節運動異常者方納入本實驗。采用隨機數表法選取10只作為正常對照組，不作任何實驗處理；另外30只大鼠作為實驗組。
1.2 方法
實驗組：建立應激大鼠動物模型。所有大鼠經7 d適應期后，進行定時喂水訓練10 d（僅每天早08:00－08:10和晚20:00－20:10給予飲水，其余時間不給水）。具體方法為在定時喂水期間給予情緒應激組動物空瓶刺激誘發其情緒應激，刺激的給予是無規律的，1次/d（早或晚），每次10 min。正常對照組：一直定時飲水。
1.2.1 標本獲取
實驗組分別在應激后第1、3、5周等距隨機抽樣10只大鼠。2%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后立即行耳屏前角形切口，仔細分離，暴露關節囊，然后切取包括鄰接骨組織在內的雙側關節整體標本，經修整后置入甲醛溶液中固定1周，于乙二胺四乙酸脫鈣液中脫鈣1周，常規處理、切片，切片厚度5 μm。由此分為正常組、應激1周組、應激3周組、應激5周組。
1.2.2 免疫組織化學染色
抗體：iNOS多克隆抗體（NOS2）購自北京中杉金橋生物技術有限公司。大鼠TMJ組織石蠟包埋后切片。免疫組織化學檢測采用EnVision二步法，以細胞棕黃色染色為陽性染色。具體步驟如下：① 石蠟切片脫蠟至水；② 3%過氧化氫溶液處理；③ 抗原修復；④ 加入NOS2（iNOS）抗體（稀釋濃度為1︰200）；⑤ 加EnVisionTMKit；⑥ 顯色；⑦ 蘇木素復染；⑧ 脫水、透明、封片。
1.3 觀察指標
免疫組織化學染色圖像分析用CIAS-1000細胞圖像分析儀系統對各組大鼠TMJ免疫組織化學染色結果進行圖像分析，計算陽性細胞的面積。
2 結果
在正常大鼠的TMJ標本中，僅有極少量iNOS表達或不表達。在實驗大鼠的應激1周TMJ標本中，已可見iNOS表達，主要分布于髁突關節表面帶，關節滑膜；應激3周TMJ標本中iNOS表達強烈，關節凹、關節盤及髁突增殖帶，在細胞核膜及細胞質有明顯棕黃色顆粒；應激5周TMJ標本陽性細胞數顯著減少且顏色變淺，已呈弱陽性。見圖 1。
圖1
各組大鼠TMJ免疫組織化學染色像
a. 正常組，僅見極少量黃色顆粒（EnVision二步法×100） b. 應激1周組，已可見iNOS表達，主要分布于髁突關節表面帶（EnVision二步法×400） c. 應激3周組，iNOS表達強烈，關節凹、關節盤及髁突增殖帶，在細胞核膜及細胞質有明顯棕黃色顆粒（EnVision二步法×200） d. 應激5周組，陽性細胞數較前減少且顏色變淺（EnVision二步法×100）
3 討論
一氧化氮是一種生物信息傳遞體，具有第二信使和神經遞質作用，介導和調節多種病理生理反應；是生物體內重要的信使分子和效應分子，發揮生理作用時，不需要受體或轉運體介導[5]。一氧化氮的細胞毒性因子功能對細菌、真菌和腫瘤細胞產生殺傷作用的同時也對正常組織產生損傷[6]。
另外，一氧化氮可促進前炎癥細胞因子的釋放，抑制軟骨細胞分泌細胞外基質和合成Ⅲ型膠原，影響軟骨的營養交換，從而抑制軟骨細胞增殖，促進軟骨細胞凋亡，加速軟骨基質的破壞，最終導致關節軟骨的退變[7]。目前已確定的一氧化氮合酶（iNOS）有3種亞型，分別是神經元型（nNOS）、內皮細胞型（eNOS）和誘生型（iNOS），分別有不同的基因編碼。nNOS和eNOS為體內固有的NOS，其生成迅速且被精細調節，為生理活動所必需；而iNOS在生理條件下或無活性的iNOS，但在炎癥、感染和創傷時可被不表達細胞因子誘導[8]。
多數實驗研究證實一氧化氮與TMD的關節損害有關，用藥物來調節一氧化氮含量將是保護關節軟骨新的有效途徑[9]，目前多通過抑制TMD患者關節軟骨和滑液中一氧化氮的釋放量和NOS活性來調節一氧化氮的含量。研究發現皮質類激素可抑制iNOS的功能，降低一氧化氮生成[10]。
本研究結果表明，在正常軟骨組織中，iNOS基本不表達或者僅存在極其微弱的表達，而在情緒應激大鼠TMJ的軟骨組織中，iNOS表達較強或明顯。在應激早期，iNOS主要集中在髁狀突及關節結節軟骨的表層；而隨著應激的持續，出現在髁狀突及關節結節的各層；在應激后期，iNOS的表達逐漸變弱。這與以往的研究結果相符，在某種程度上印證了TMD的病程發展緩慢且具有一定自限性。
綜上所述，一氧化氮是一種介導和調節多種病理生理反應的重要信使分子和效應分子；在生理條件下無iNOS或無活性的iNOS產生，提示可以考慮通過關節腔注射藥物調節iNOS的含量，從而減少關節軟骨的退變。
顳下頜關節紊亂病（TMD）并非指單一疾病，它是一類病因尚未完全清楚而又有共同發病因素和臨床主要癥狀的一組疾病的總稱。目前對其詳細的發病機制尚未完全闡明[1]，多數學者的觀點認為是多因素發病，與心理社會因素、因素、免疫因素、關節負荷過重、關節解剖等因素有關，其中心理社會因素是其主要病因之一[2-3]。隨著醫學模式的轉變，人們越來越重視心理因素對疾病的影響，迫切需要研究情緒應激導致軀體疾病的發病機制。由于利用人體進行情緒應激與TMD關系的研究受到很大限制，建立合適的動物模型有助于研究的進行。目前對情緒應激的研究較多采用的是以不確定性空瓶飲水刺激作為應激源的情緒應激模型[4]。
本實驗通過動物模型，應用免疫組織化學方法，觀察情緒刺激不同時期誘生型一氧化氮合酶（iNOS）在顳下頜關節（TMJ）中的表達強度及其在組織中的定位，以求探討TMD可能的發病機制，期待能對臨床治療提供一些參考。現報告如下。
1 材料與方法
1.1 材料
實驗選用遼寧醫學院實驗動物中心提供的成年Sprague-Dawley （SD） 雄性大鼠40只，體質量約150 g，單籠喂養。在實驗室中經過適應期7 d，光/暗周期為12 h/12 h（光照時間08:00－20:00），室內溫度為（22.0±0.5）℃，濕度為50%左右。適應期內所有動物自由攝食和飲水，每天接受3 min撫摸。觀察大鼠無明顯全身疾患，無失牙及咬合紊亂，無關節運動異常者方納入本實驗。采用隨機數表法選取10只作為正常對照組，不作任何實驗處理；另外30只大鼠作為實驗組。
1.2 方法
實驗組：建立應激大鼠動物模型。所有大鼠經7 d適應期后，進行定時喂水訓練10 d（僅每天早08:00－08:10和晚20:00－20:10給予飲水，其余時間不給水）。具體方法為在定時喂水期間給予情緒應激組動物空瓶刺激誘發其情緒應激，刺激的給予是無規律的，1次/d（早或晚），每次10 min。正常對照組：一直定時飲水。
1.2.1 標本獲取
實驗組分別在應激后第1、3、5周等距隨機抽樣10只大鼠。2%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后立即行耳屏前角形切口，仔細分離，暴露關節囊，然后切取包括鄰接骨組織在內的雙側關節整體標本，經修整后置入甲醛溶液中固定1周，于乙二胺四乙酸脫鈣液中脫鈣1周，常規處理、切片，切片厚度5 μm。由此分為正常組、應激1周組、應激3周組、應激5周組。
1.2.2 免疫組織化學染色
抗體：iNOS多克隆抗體（NOS2）購自北京中杉金橋生物技術有限公司。大鼠TMJ組織石蠟包埋后切片。免疫組織化學檢測采用EnVision二步法，以細胞棕黃色染色為陽性染色。具體步驟如下：① 石蠟切片脫蠟至水；② 3%過氧化氫溶液處理；③ 抗原修復；④ 加入NOS2（iNOS）抗體（稀釋濃度為1︰200）；⑤ 加EnVisionTMKit；⑥ 顯色；⑦ 蘇木素復染；⑧ 脫水、透明、封片。
1.3 觀察指標
免疫組織化學染色圖像分析用CIAS-1000細胞圖像分析儀系統對各組大鼠TMJ免疫組織化學染色結果進行圖像分析，計算陽性細胞的面積。
2 結果
在正常大鼠的TMJ標本中，僅有極少量iNOS表達或不表達。在實驗大鼠的應激1周TMJ標本中，已可見iNOS表達，主要分布于髁突關節表面帶，關節滑膜；應激3周TMJ標本中iNOS表達強烈，關節凹、關節盤及髁突增殖帶，在細胞核膜及細胞質有明顯棕黃色顆粒；應激5周TMJ標本陽性細胞數顯著減少且顏色變淺，已呈弱陽性。見圖 1。
圖1
各組大鼠TMJ免疫組織化學染色像
a. 正常組，僅見極少量黃色顆粒（EnVision二步法×100） b. 應激1周組，已可見iNOS表達，主要分布于髁突關節表面帶（EnVision二步法×400） c. 應激3周組，iNOS表達強烈，關節凹、關節盤及髁突增殖帶，在細胞核膜及細胞質有明顯棕黃色顆粒（EnVision二步法×200） d. 應激5周組，陽性細胞數較前減少且顏色變淺（EnVision二步法×100）
3 討論
一氧化氮是一種生物信息傳遞體，具有第二信使和神經遞質作用，介導和調節多種病理生理反應；是生物體內重要的信使分子和效應分子，發揮生理作用時，不需要受體或轉運體介導[5]。一氧化氮的細胞毒性因子功能對細菌、真菌和腫瘤細胞產生殺傷作用的同時也對正常組織產生損傷[6]。
另外，一氧化氮可促進前炎癥細胞因子的釋放，抑制軟骨細胞分泌細胞外基質和合成Ⅲ型膠原，影響軟骨的營養交換，從而抑制軟骨細胞增殖，促進軟骨細胞凋亡，加速軟骨基質的破壞，最終導致關節軟骨的退變[7]。目前已確定的一氧化氮合酶（iNOS）有3種亞型，分別是神經元型（nNOS）、內皮細胞型（eNOS）和誘生型（iNOS），分別有不同的基因編碼。nNOS和eNOS為體內固有的NOS，其生成迅速且被精細調節，為生理活動所必需；而iNOS在生理條件下或無活性的iNOS，但在炎癥、感染和創傷時可被不表達細胞因子誘導[8]。
多數實驗研究證實一氧化氮與TMD的關節損害有關，用藥物來調節一氧化氮含量將是保護關節軟骨新的有效途徑[9]，目前多通過抑制TMD患者關節軟骨和滑液中一氧化氮的釋放量和NOS活性來調節一氧化氮的含量。研究發現皮質類激素可抑制iNOS的功能，降低一氧化氮生成[10]。
本研究結果表明，在正常軟骨組織中，iNOS基本不表達或者僅存在極其微弱的表達，而在情緒應激大鼠TMJ的軟骨組織中，iNOS表達較強或明顯。在應激早期，iNOS主要集中在髁狀突及關節結節軟骨的表層；而隨著應激的持續，出現在髁狀突及關節結節的各層；在應激后期，iNOS的表達逐漸變弱。這與以往的研究結果相符，在某種程度上印證了TMD的病程發展緩慢且具有一定自限性。
綜上所述，一氧化氮是一種介導和調節多種病理生理反應的重要信使分子和效應分子；在生理條件下無iNOS或無活性的iNOS產生，提示可以考慮通過關節腔注射藥物調節iNOS的含量，從而減少關節軟骨的退變。
