引用本文： 張冬雪, 龔道銀, 代號, 俞尤嘉, 盧玫瑰, 曹永, 黃飛駿. 大鼠皮膚切創愈合過程中caspase-3、Toll樣受體4的表達與時間相關性的研究. 華西醫學, 2014, 29(10): 1874-1878. doi: 10.7507/1002-0179.20140567 復制
損傷時間的推斷一直是法醫學的重點和難點。近來皮膚創傷愈合過程分子機制的研究發現，創傷愈合各階段具有一定的時序性，且被國內外法醫學者廣泛用于皮膚創口的“年齡”推斷[1, 2]，但目前仍未找到理想的蛋白因子來推斷損傷時間。
有研究發現Toll樣受體4（TLR4）、caspase-3可能參與小鼠海馬區神經細胞的凋亡[3, 4]；已有研究發現TLR4可能參與促進增生性瘢痕的形成[5, 6]。推測TLR4和caspase-3可能在皮膚創傷愈合過程中存在某種關系，查閱文獻尚未見TLR4和caspase-3的表達在皮膚創傷愈合各個階段存在某種相關性的研究報道。因此，本研究通過建立大鼠皮膚切創模型，應用免疫組織化學染色技術及統計學方法，觀察分析caspase-3、TLR4 在皮膚創傷后的表達和損傷時間的規律及其死后穩定性，并對caspase-3與TLR4陽性表達的相關性進行分析，探究在皮膚創傷愈合各個階段caspase-3和TLR4的表達是否存在相關性，從而為法醫學損傷時間的推斷提供指標和理論依據。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 動物分組
健康清潔級Sprague-Dawley成年大鼠63只（四川大學實驗動物中心提供），雌雄不限，體質量為200～220 g，采用隨機數字隨機分為正常對照組（3只）、生前造創組（33只）、死后造創組（12只）和死后穩定性組（15只）。
1.1.2 主要試劑
TLR4 小鼠抗單克隆抗體（英國Abcam公司，貨號ab22048），caspase-3兔抗多克隆抗體（美國CST公司，貨號9662#），二步法抗兔/鼠通用型免疫組織檢測試劑盒（基因科技上海有限公司，編號GK500705）。
1.2 動物模型建立
① 生前造創組：用乙醚麻醉大鼠后，剪毛備皮大鼠背部造創區。常規消毒后用無菌手術刀在大鼠背部做一與脊柱平行的長約2 cm切口，深達肌肉筋膜；創面自然止血，不包扎、不施藥，保持傷口干燥。將大鼠置無菌室單籠飼養，給予消毒的食物和水。分別于造創后 0、0.5、1.5、3、6、12 h和1、3、5、7、10 d共11個時間點將大鼠（每次3只）斷頸處死，即刻于創口處取一2.0 cm×1.5 cm大小皮膚組織。② 死后造創組：同前麻醉、剪毛備皮，將大鼠斷頸處死，分別于死后0、10、30、90 min共4個時間點在大鼠（每次3只）背部行長約2 cm切口，深達肌肉筋膜；創面不包扎、不施藥，保持傷口干燥；均于造創后0.5 h取一2.0 cm×1.5 cm 大小創口處皮膚組織。③ 正常對照組：處理同實驗組，但不行造創手術，大鼠斷頸處死后取與造創組大鼠相同部位、相同大小皮膚組織。④ 死后穩定性組：同生前造創組作大鼠背部切創及傷后處理，造創后3 d斷頸處死，置于25℃溫度環境中；分別于死后0 h、0.5 h、12 h、2 d、4 d于創口處（每次3只）取一2.0 cm×1.5 cm大小皮膚組織。
1.3 染色方法
將所取皮膚檢材及時放入4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液中固定24 h，石蠟包埋后5 μm厚度連續切片3張。蘇木精-伊紅（HE）染色按常規方法進行；另2張貼于黏附載玻片，用于免疫組織化學染色，枸櫞酸抗原修復液（pH值6.0）95℃水浴修復，采用 ChemMateTM Envision+HRP/DAB，兔/鼠二步法染色，具體步驟同試劑盒說明。染色過程另以磷酸鹽緩沖液代替一抗作為空白對照。
1.4 陽性細胞計數
caspase-3及TLR4陽性反應物呈棕黃色細顆粒狀，主要定位于細胞膜和（或）細胞質。光學顯微鏡（×400）下隨機選擇5個視野，計數中性粒細胞、單核-吞噬細胞系統、淋巴細胞及成纖維細胞的陽性細胞數，計算每個視野中陽性細胞與此4種細胞總數的比值。
1.5 統計學方法
采用SPSS 19.0軟件進行統計分析。數據用均數±標準差表示，多組間比較采用單因素方差分析，各組間兩兩比較采用LSD檢驗；兩變量之間相關關系行Pearson相關分析。以P值＜0.05有統計學意義。
2 結果
2.1 創口皮膚組織基本病理變化
各組基本病理變化如下：① 生前造創組：傷后 0.5～1.5 h，創緣真皮毛細血管擴張充血，毛囊周圍見少量中性粒細胞；傷后3～12 h，真皮毛細血管明顯擴張充血，炎細胞逐漸增多，以中性粒細胞為主，創緣上皮均質化，細胞核消失；傷后1 d，創緣組織干燥，以滲出的炎性細胞為主的肉芽組織開始形成，并向創口長入，創緣可見大量單核細胞浸潤；傷后3 d，肉芽組織形成，成纖維細胞開始增生，炎性細胞以單核-巨噬細胞為主；傷后5～7 d，肉芽組織逐漸成熟纖維化，從深筋膜呈楔形向創口內生長，中性粒細胞進一步減少，淋巴細胞開始浸潤，成纖維細胞增加；傷后10 d，創口基本愈合，創區單核-巨噬細胞、淋巴細胞和成纖維細胞數量明顯減少，細胞間質成分開始增多，瘢痕組織逐漸形成。② 正常對照組及死后造創組無生前造創組改變。③ 死后穩定性組：受溫度及死亡時間的影響，死后30 min，創口改變同死后即刻；死后12 h，尸體僵硬，出現皮下局灶性的蜂窩狀空腔結構，創區組織細胞開始自溶；死后2 d，尸僵緩解，尸體腫脹，惡臭，創周皮膚變綠，創區組織細胞自溶加劇，邊緣結構不清；死后4 d，尸體腐敗加劇，表皮與真皮易于剝離。
2.2 切創區及其周邊caspase-3及TLR4的表達
① 正常對照組：表皮層、毛囊及皮脂腺細胞caspase-3及TLR4呈陽性表達。② 死后造創組：細胞表達結果與正常對照組相似。③ 生前造創組：傷后0.5 h，在創緣毛囊周圍中性粒細胞中可見少量caspase-3及TLR4陽性表達；傷后1.5～6.0 h，中性粒細胞及單核-巨噬細胞逐漸增多，caspase-3及TLR4陽性細胞率緩慢增加；傷后12 h，中性粒細胞增多且大部分細胞caspase-3及TLR4表達陽性；傷后1 d，創口周圍的單核-巨噬細胞增多，陽性表達增加，部分中性粒細胞呈陽性；傷后3～5 d，caspase-3及TLR4主要表達于成纖維細胞及單核-巨噬細胞；傷后7～10 d，炎細胞逐漸減少，陽性表達主要在成纖維細胞。④ 死后穩定性組：caspase-3及TLR4陽性表達與死后0 h基本相同。見圖 1。
圖1
切創區及其周邊caspase-3及TLR4的表達 a. 生前造創組1 d時caspase-3表達情況（免疫組織化學染色×400） b. 生前造創組1 d時TLR-4表達情況（免疫組織化學染色×400） c. 生前造創組5 d時caspase-3表達情況（免疫組織化學染色×400） d. 生前造創組5 d時TLR4表達情況（免疫組織化學染色×400） e. 死后穩定性組2 d時caspase-3表達情況（免疫組織化學染色×400） f. 死后穩定性組2 d時TLR4表達情況（免疫組織化學染色×400） g. 生前造創組3 d時表達情況（HE×40） h.生前造創組10 d時表達情況（HE×40）
2.3 陽性細胞計數及統計學分析
2.3.1 caspase-3陽性細胞率
生前造創組除0 h組外，各實驗組與正常對照組比較差異均有統計學意義（P＜0.05），caspase-3陽性率在3 d達到峰值。見圖 2。
圖2
caspase-3、TLR4陽性細胞率變化趨勢圖
傷后各時間點相鄰兩組之間caspase-3陽性細胞率相比差異均有統計學意義（P＜0.05) ，其中1.5、3及12 h～10 d組與其他各時間組比較差異均有統計學意義（P＜0.05）。見表 1。死后造創組與正常對照組比較差異無統計學意義（P＞0.05）。死后穩定性組caspase-3陽性細胞率呈緩慢下降趨勢，但與死后即刻比較以及各相鄰兩組間比較均無統計學意義（P＞0.05）。見表 2。
表1
生前造創組caspase-3及TLR4陽性細胞百分率（n=33，
表2
死后穩定性組caspase-3及TLR4陽性細胞百分率（n=15，%，2.3.2 TLR4陽性細胞率
生前造創組除0 h組外，各實驗組與空白對照組比較差異均有統計學意義（P＜0.05），TLR4陽性率在3 d達到峰值（圖 2）；傷后0.5 h～5 d各時間點相鄰兩組之間TLR4陽性細胞率相比差異均有統計學意義（P＜0.05) ，其中0.5、6、12 h及3 d組與其他各時間組比較差異均有統計學意義（P＜0.05），見表 1。死后造創組與正常對照組比較差異無統計學意義。死后穩定性組：TLR4陽性細胞率呈緩慢下降趨勢，但與死后即刻比較以及各相鄰兩組間比較差異均無統計學意義（P＞0.05），見表 2。
2.3.3 相關性分析
生前造創后皮膚組織caspase-3陽性細胞率與TLR4陽性細胞率呈正相關（r=0.970，P＜0.05）。
3 討論
近來發現Toll樣受體家族的某些成員，尤其是TLR4對于無菌性損傷后釋放的眾多內源性分子（如高遷移率族蛋白1、氧自由基、細胞外基質降解產物等）即損傷相關分子模式有反應，通過激活核因子-κB而誘導細胞因子的產生。有研究表明，外周組織損害所產生的危險信號能被TLR4迅速識別和反應，對創傷后炎癥反應的啟動具有重要作用[7, 8]。TLR4既表達在巨噬細胞、中性粒細胞和肥大細胞等非特異性免疫細胞上，又表達在Ｔ淋巴細胞和Ｂ淋巴細胞這類特異性免疫細胞上。
目前已經證明的細胞凋亡通路至少有線粒體途徑、死亡受體途徑和內質網途徑。作為caspase家族中最重要的凋亡執行者之一，caspase-3是細胞凋亡過程中的主要效應因子，它的活化標志著凋亡進入不可逆階段。李俊等[9]通過建立急性胰腺炎模型，發現caspase-3可能參與中性粒細胞的凋亡。在組織損傷和炎癥過程中，caspase-3對中性粒細胞及其他滯留細胞的凋亡起著重要作用[5, 10]。
佟月等[4]、Lotze等[11]通過對小鼠腦缺血再灌注損傷模型研究發現，海馬區TLR4阻斷組中caspase-3蛋白表達明顯低于缺血再灌注組，且凋亡細胞數較后者明顯減少，提示阻斷TLR4，可能會減輕小鼠腦缺血再灌注損傷中的海馬區神經細胞的凋亡。Tstung等[12]、郝誠誠等[13]研究發現，過度訓練可通過上調TLR4的表達，強化Fas死亡受體凋亡通路，進而誘導大鼠腎小管上皮細胞凋亡。由以上研究推知在細胞凋亡信號通路中，TLR4可能處于caspase-3的上游，參與誘導細胞凋亡。
本研究結果顯示，正常對照組中caspase-3、TLR4在表皮層、毛囊及皮脂腺細胞有表達，生前造創組傷后0 h組及死后損傷組中染色結果與正常對照組基本相同，說明caspase-3、TLR4在正常的皮膚組織中已有表達，提示其可能與上述細胞的凋亡和自我更新有關。
大鼠生前造創組自0.5 h開始caspase-3、TLR4即有陽性表達，而后逐漸增加，兩者的陽性細胞率均在3 d時達峰值，后逐漸降低，兩者變化趨勢呈正相關；caspase-3、TLR4陽性細胞率的變化趨勢與杜宇等[14]、樓旭鵬等[15]的研究結果大致相同。提示caspase-3、TLR4可能參與中性粒細胞、單核-巨噬細胞、淋巴細胞及成纖維細胞的凋亡。死后穩定性組結果顯示，在25℃環境中，caspase-3、TLR4的表達在各時間點與死后即刻比較均無統計學意義，且各組間比較亦無統計學意義（P＞0.05），直至死后4 d仍呈陽性表達，表明其具有較好的穩定性。以上揭示出的caspase-3、TLR4表達的時序性變化規律及穩定性使其可以作為皮膚損傷時間推斷的指標。
本研究證實了在大鼠皮膚切創愈合過程中，TLR4與caspase-3的表達有相關性，且早期炎性細胞穩定表達TLR4較caspase-3顯著，提示TLR4可能參與促進caspase-3的產生，通過兩者表達量的變化來協調炎癥與凋亡，促進創口的愈合。查閱文獻未見關于TLR4誘導caspase-3表達及參與細胞凋亡程序具體途徑的相關報道，還有待進一步研究。綜上，TLR4、caspase-3可共同作為損傷時間推斷的指標，早期皮膚損傷時間的推斷可首選TLR4。具體到法醫學實踐中的運用，基于實驗大鼠與人的種屬不同，caspase-3、TLR4在人體的表達是否存在差異也有待進一步研究。
損傷時間的推斷一直是法醫學的重點和難點。近來皮膚創傷愈合過程分子機制的研究發現，創傷愈合各階段具有一定的時序性，且被國內外法醫學者廣泛用于皮膚創口的“年齡”推斷[1, 2]，但目前仍未找到理想的蛋白因子來推斷損傷時間。
有研究發現Toll樣受體4（TLR4）、caspase-3可能參與小鼠海馬區神經細胞的凋亡[3, 4]；已有研究發現TLR4可能參與促進增生性瘢痕的形成[5, 6]。推測TLR4和caspase-3可能在皮膚創傷愈合過程中存在某種關系，查閱文獻尚未見TLR4和caspase-3的表達在皮膚創傷愈合各個階段存在某種相關性的研究報道。因此，本研究通過建立大鼠皮膚切創模型，應用免疫組織化學染色技術及統計學方法，觀察分析caspase-3、TLR4 在皮膚創傷后的表達和損傷時間的規律及其死后穩定性，并對caspase-3與TLR4陽性表達的相關性進行分析，探究在皮膚創傷愈合各個階段caspase-3和TLR4的表達是否存在相關性，從而為法醫學損傷時間的推斷提供指標和理論依據。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 動物分組
健康清潔級Sprague-Dawley成年大鼠63只（四川大學實驗動物中心提供），雌雄不限，體質量為200～220 g，采用隨機數字隨機分為正常對照組（3只）、生前造創組（33只）、死后造創組（12只）和死后穩定性組（15只）。
1.1.2 主要試劑
TLR4 小鼠抗單克隆抗體（英國Abcam公司，貨號ab22048），caspase-3兔抗多克隆抗體（美國CST公司，貨號9662#），二步法抗兔/鼠通用型免疫組織檢測試劑盒（基因科技上海有限公司，編號GK500705）。
1.2 動物模型建立
① 生前造創組：用乙醚麻醉大鼠后，剪毛備皮大鼠背部造創區。常規消毒后用無菌手術刀在大鼠背部做一與脊柱平行的長約2 cm切口，深達肌肉筋膜；創面自然止血，不包扎、不施藥，保持傷口干燥。將大鼠置無菌室單籠飼養，給予消毒的食物和水。分別于造創后 0、0.5、1.5、3、6、12 h和1、3、5、7、10 d共11個時間點將大鼠（每次3只）斷頸處死，即刻于創口處取一2.0 cm×1.5 cm大小皮膚組織。② 死后造創組：同前麻醉、剪毛備皮，將大鼠斷頸處死，分別于死后0、10、30、90 min共4個時間點在大鼠（每次3只）背部行長約2 cm切口，深達肌肉筋膜；創面不包扎、不施藥，保持傷口干燥；均于造創后0.5 h取一2.0 cm×1.5 cm 大小創口處皮膚組織。③ 正常對照組：處理同實驗組，但不行造創手術，大鼠斷頸處死后取與造創組大鼠相同部位、相同大小皮膚組織。④ 死后穩定性組：同生前造創組作大鼠背部切創及傷后處理，造創后3 d斷頸處死，置于25℃溫度環境中；分別于死后0 h、0.5 h、12 h、2 d、4 d于創口處（每次3只）取一2.0 cm×1.5 cm大小皮膚組織。
1.3 染色方法
將所取皮膚檢材及時放入4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液中固定24 h，石蠟包埋后5 μm厚度連續切片3張。蘇木精-伊紅（HE）染色按常規方法進行；另2張貼于黏附載玻片，用于免疫組織化學染色，枸櫞酸抗原修復液（pH值6.0）95℃水浴修復，采用 ChemMateTM Envision+HRP/DAB，兔/鼠二步法染色，具體步驟同試劑盒說明。染色過程另以磷酸鹽緩沖液代替一抗作為空白對照。
1.4 陽性細胞計數
caspase-3及TLR4陽性反應物呈棕黃色細顆粒狀，主要定位于細胞膜和（或）細胞質。光學顯微鏡（×400）下隨機選擇5個視野，計數中性粒細胞、單核-吞噬細胞系統、淋巴細胞及成纖維細胞的陽性細胞數，計算每個視野中陽性細胞與此4種細胞總數的比值。
1.5 統計學方法
采用SPSS 19.0軟件進行統計分析。數據用均數±標準差表示，多組間比較采用單因素方差分析，各組間兩兩比較采用LSD檢驗；兩變量之間相關關系行Pearson相關分析。以P值＜0.05有統計學意義。
2 結果
2.1 創口皮膚組織基本病理變化
各組基本病理變化如下：① 生前造創組：傷后 0.5～1.5 h，創緣真皮毛細血管擴張充血，毛囊周圍見少量中性粒細胞；傷后3～12 h，真皮毛細血管明顯擴張充血，炎細胞逐漸增多，以中性粒細胞為主，創緣上皮均質化，細胞核消失；傷后1 d，創緣組織干燥，以滲出的炎性細胞為主的肉芽組織開始形成，并向創口長入，創緣可見大量單核細胞浸潤；傷后3 d，肉芽組織形成，成纖維細胞開始增生，炎性細胞以單核-巨噬細胞為主；傷后5～7 d，肉芽組織逐漸成熟纖維化，從深筋膜呈楔形向創口內生長，中性粒細胞進一步減少，淋巴細胞開始浸潤，成纖維細胞增加；傷后10 d，創口基本愈合，創區單核-巨噬細胞、淋巴細胞和成纖維細胞數量明顯減少，細胞間質成分開始增多，瘢痕組織逐漸形成。② 正常對照組及死后造創組無生前造創組改變。③ 死后穩定性組：受溫度及死亡時間的影響，死后30 min，創口改變同死后即刻；死后12 h，尸體僵硬，出現皮下局灶性的蜂窩狀空腔結構，創區組織細胞開始自溶；死后2 d，尸僵緩解，尸體腫脹，惡臭，創周皮膚變綠，創區組織細胞自溶加劇，邊緣結構不清；死后4 d，尸體腐敗加劇，表皮與真皮易于剝離。
2.2 切創區及其周邊caspase-3及TLR4的表達
① 正常對照組：表皮層、毛囊及皮脂腺細胞caspase-3及TLR4呈陽性表達。② 死后造創組：細胞表達結果與正常對照組相似。③ 生前造創組：傷后0.5 h，在創緣毛囊周圍中性粒細胞中可見少量caspase-3及TLR4陽性表達；傷后1.5～6.0 h，中性粒細胞及單核-巨噬細胞逐漸增多，caspase-3及TLR4陽性細胞率緩慢增加；傷后12 h，中性粒細胞增多且大部分細胞caspase-3及TLR4表達陽性；傷后1 d，創口周圍的單核-巨噬細胞增多，陽性表達增加，部分中性粒細胞呈陽性；傷后3～5 d，caspase-3及TLR4主要表達于成纖維細胞及單核-巨噬細胞；傷后7～10 d，炎細胞逐漸減少，陽性表達主要在成纖維細胞。④ 死后穩定性組：caspase-3及TLR4陽性表達與死后0 h基本相同。見圖 1。
圖1
切創區及其周邊caspase-3及TLR4的表達 a. 生前造創組1 d時caspase-3表達情況（免疫組織化學染色×400） b. 生前造創組1 d時TLR-4表達情況（免疫組織化學染色×400） c. 生前造創組5 d時caspase-3表達情況（免疫組織化學染色×400） d. 生前造創組5 d時TLR4表達情況（免疫組織化學染色×400） e. 死后穩定性組2 d時caspase-3表達情況（免疫組織化學染色×400） f. 死后穩定性組2 d時TLR4表達情況（免疫組織化學染色×400） g. 生前造創組3 d時表達情況（HE×40） h.生前造創組10 d時表達情況（HE×40）
2.3 陽性細胞計數及統計學分析
2.3.1 caspase-3陽性細胞率
生前造創組除0 h組外，各實驗組與正常對照組比較差異均有統計學意義（P＜0.05），caspase-3陽性率在3 d達到峰值。見圖 2。
圖2
caspase-3、TLR4陽性細胞率變化趨勢圖
傷后各時間點相鄰兩組之間caspase-3陽性細胞率相比差異均有統計學意義（P＜0.05) ，其中1.5、3及12 h～10 d組與其他各時間組比較差異均有統計學意義（P＜0.05）。見表 1。死后造創組與正常對照組比較差異無統計學意義（P＞0.05）。死后穩定性組caspase-3陽性細胞率呈緩慢下降趨勢，但與死后即刻比較以及各相鄰兩組間比較均無統計學意義（P＞0.05）。見表 2。
表1
生前造創組caspase-3及TLR4陽性細胞百分率（n=33，
表2
死后穩定性組caspase-3及TLR4陽性細胞百分率（n=15，%，2.3.2 TLR4陽性細胞率
生前造創組除0 h組外，各實驗組與空白對照組比較差異均有統計學意義（P＜0.05），TLR4陽性率在3 d達到峰值（圖 2）；傷后0.5 h～5 d各時間點相鄰兩組之間TLR4陽性細胞率相比差異均有統計學意義（P＜0.05) ，其中0.5、6、12 h及3 d組與其他各時間組比較差異均有統計學意義（P＜0.05），見表 1。死后造創組與正常對照組比較差異無統計學意義。死后穩定性組：TLR4陽性細胞率呈緩慢下降趨勢，但與死后即刻比較以及各相鄰兩組間比較差異均無統計學意義（P＞0.05），見表 2。
2.3.3 相關性分析
生前造創后皮膚組織caspase-3陽性細胞率與TLR4陽性細胞率呈正相關（r=0.970，P＜0.05）。
3 討論
近來發現Toll樣受體家族的某些成員，尤其是TLR4對于無菌性損傷后釋放的眾多內源性分子（如高遷移率族蛋白1、氧自由基、細胞外基質降解產物等）即損傷相關分子模式有反應，通過激活核因子-κB而誘導細胞因子的產生。有研究表明，外周組織損害所產生的危險信號能被TLR4迅速識別和反應，對創傷后炎癥反應的啟動具有重要作用[7, 8]。TLR4既表達在巨噬細胞、中性粒細胞和肥大細胞等非特異性免疫細胞上，又表達在Ｔ淋巴細胞和Ｂ淋巴細胞這類特異性免疫細胞上。
目前已經證明的細胞凋亡通路至少有線粒體途徑、死亡受體途徑和內質網途徑。作為caspase家族中最重要的凋亡執行者之一，caspase-3是細胞凋亡過程中的主要效應因子，它的活化標志著凋亡進入不可逆階段。李俊等[9]通過建立急性胰腺炎模型，發現caspase-3可能參與中性粒細胞的凋亡。在組織損傷和炎癥過程中，caspase-3對中性粒細胞及其他滯留細胞的凋亡起著重要作用[5, 10]。
佟月等[4]、Lotze等[11]通過對小鼠腦缺血再灌注損傷模型研究發現，海馬區TLR4阻斷組中caspase-3蛋白表達明顯低于缺血再灌注組，且凋亡細胞數較后者明顯減少，提示阻斷TLR4，可能會減輕小鼠腦缺血再灌注損傷中的海馬區神經細胞的凋亡。Tstung等[12]、郝誠誠等[13]研究發現，過度訓練可通過上調TLR4的表達，強化Fas死亡受體凋亡通路，進而誘導大鼠腎小管上皮細胞凋亡。由以上研究推知在細胞凋亡信號通路中，TLR4可能處于caspase-3的上游，參與誘導細胞凋亡。
本研究結果顯示，正常對照組中caspase-3、TLR4在表皮層、毛囊及皮脂腺細胞有表達，生前造創組傷后0 h組及死后損傷組中染色結果與正常對照組基本相同，說明caspase-3、TLR4在正常的皮膚組織中已有表達，提示其可能與上述細胞的凋亡和自我更新有關。
大鼠生前造創組自0.5 h開始caspase-3、TLR4即有陽性表達，而后逐漸增加，兩者的陽性細胞率均在3 d時達峰值，后逐漸降低，兩者變化趨勢呈正相關；caspase-3、TLR4陽性細胞率的變化趨勢與杜宇等[14]、樓旭鵬等[15]的研究結果大致相同。提示caspase-3、TLR4可能參與中性粒細胞、單核-巨噬細胞、淋巴細胞及成纖維細胞的凋亡。死后穩定性組結果顯示，在25℃環境中，caspase-3、TLR4的表達在各時間點與死后即刻比較均無統計學意義，且各組間比較亦無統計學意義（P＞0.05），直至死后4 d仍呈陽性表達，表明其具有較好的穩定性。以上揭示出的caspase-3、TLR4表達的時序性變化規律及穩定性使其可以作為皮膚損傷時間推斷的指標。
本研究證實了在大鼠皮膚切創愈合過程中，TLR4與caspase-3的表達有相關性，且早期炎性細胞穩定表達TLR4較caspase-3顯著，提示TLR4可能參與促進caspase-3的產生，通過兩者表達量的變化來協調炎癥與凋亡，促進創口的愈合。查閱文獻未見關于TLR4誘導caspase-3表達及參與細胞凋亡程序具體途徑的相關報道，還有待進一步研究。綜上，TLR4、caspase-3可共同作為損傷時間推斷的指標，早期皮膚損傷時間的推斷可首選TLR4。具體到法醫學實踐中的運用，基于實驗大鼠與人的種屬不同，caspase-3、TLR4在人體的表達是否存在差異也有待進一步研究。
