引用本文： 張成, 張海龍, 蘇曉慶, 羅毅, 樊琦昊, 羅琪玲, 謝麗, 李元波, 楊莉. HSP65-MUC1融合蛋白中試生產工藝的優化及生物學活性檢測方法的鑒定. 華西醫學, 2014, 29(10): 1868-1873. doi: 10.7507/1002-0179.20140566 復制
HSP65-MUC1是將卡介苗來源的熱休克蛋白65（HSP65）與人的MUC1的抗原肽基因融合，并在大腸桿菌BL21（DE3）中表達獲得的重組融合蛋白[1]。HSP65-MUC1可通過刺激樹突狀細胞（DC）成熟，使其表面的CD86表達上調，并進一步刺激產生MUC1特異性的細胞毒性T淋巴細胞，抑制MUC1陽性的腫瘤細胞的生長[2, 3]，同時也激活非特異性抗腫瘤免疫反應，發揮抗腫瘤作用[4-6]。但是在HSP65-MUC1的純化過程中遇到的效率低、重復性不好、難于放大、成本較高等問題[7, 8]，限制了其應用。為了達到國家對基因工程藥物純度的要求，滿足臨床前藥物效應動力學研究及臨床試驗等各項需求，我們對HSP65-MUC1融合蛋白中試放大工藝進行了優化，并建立了簡便的生物學活性檢測方法，獲得了高純度、有活性的HSP65-MUC1融合蛋白。
1 材料和方法
1.1 材料
大腸桿菌菌株E. coli DH5α和E. coli BL21（DE3）均為本實驗室常規保存；重組表達質粒pET28a-HSP65-MUC1由成都信立邦生物制藥有限公司提供；細菌質粒DNA提取試劑盒購自北京道普生物技術中心；DNA相對分子質量標準購自大連TaKaRa公司；蛋白相對分子質量標準購自立陶宛Fermentas公司；脂多糖購自美國Sigma公司；白細胞介素-4（IL-4）和粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子（GM-CSF）購自上海普欣生物公司；抗HSP65和抗MUC1的抗體購自英國Abcam公司；異硫氰酸熒光橙紅（FITC）標記的抗人CD86抗體及同型對照購自美國BD公司。
1.2 重組質粒pET28a-HSP65-MUC1的驗證
將重組質粒pET28a-HSP65-MUC1轉化大腸桿菌菌株E. coli DH5α，挑取單克隆并擴大培養過夜，之后利用細菌質粒抽提試劑盒提取重組質粒pET28a-HSP65-MUC1。送到Invitrogen（上海）公司進行測序，并將正確的重組質粒轉化大腸桿菌E. coli BL21（DE3）。
1.3 HSP65-MUC1融合蛋白的表達和鑒定
將含有重組質粒pET28a-HSP65-MUC1的BL21（DE3）保種菌按照1%接種到5 mL種子培養基中，37℃振蕩培養16 h后獲得一級細菌種子液。取4 mL一級細菌種子液按照1%接種量接種到400 mL種子培養基中，37℃振蕩培養16 h后獲得二級細菌種子液。將二級種子液接入5 L發酵罐中，培養至A600=30 mAU 時（溶氧量為50%） 加入異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）（終濃度為0.1 mmol/L），繼續培養3.5 h，收菌并進行聚丙烯酰氨凝膠電泳（SDS-PAGE）。同時采用蛋白質免疫印跡法對表達蛋白進行鑒定。
1.4 中試生產工藝的優化
1.4.1 HSP65-MUC1的提取
稱取10 g菌體（濕質量），按照1︰20的比例重懸于200 mL的裂解緩沖液[（50 mmol/L Tris/HCl、pH值9.0、1.5 mol/L NaCl、5 mmol/L乙二胺四乙酸（EDTA）]中，在80 MPa的條件下高壓均質破菌3次（溫度不超過8℃）。將菌體裂解物4℃，12 000×g離心30 min（Thermo，SLA-3000），之后收集富含HSP65-MUC1融合蛋白的上清液。
1.4.2 飽和硫酸銨沉淀
將收集到的富含HSP65-MUC1的上清液置于4℃，向其中加入一定體積的飽和硫酸銨溶液至終濃度為30%，攪拌3 h，之后4℃，20 000×g離心20 min（Thermo，SA-300）。收集上清液，繼續加入飽和硫酸銨溶液，使其終濃度為50%，攪拌3 h，并按照上述離心條件離心，收集蛋白沉淀，并用溶解緩沖液（20 mmol/L Tris/HCl、pH值9.0、1.5 mol/L NaCl、5 mmol/L EDTA）重懸。
1.4.3 疏水層析
將含有phenyl sepharose FF填料的蛋白純化柱連接AKTA Purify系統，并用平衡緩沖液（20 mmol/L Tris/HCl、pH值9.0、1.5 mol/L NaCl、2 mmol/L EDTA）沖洗柱子至基線。將“1.4.2”中得到的蛋白重懸液過柱，用平衡緩沖液沖洗柱子至A280＜10 mAU，之后分別用含有不同鹽濃度的洗脫緩沖液（A液：20 mmol/L Tris/HCl、pH值9.0、0.345 mol/L NaCl、2 mmol/L EDTA；B液：20 mmol/L Tris/HCl、pH值9.0、2 mmol/L EDTA）沖洗柱子，并按照A280吸收峰值的變化收集洗脫液，SDS-PAGE電泳分析。
1.4.4 離子交換層析
首先用緩沖液（20 mmol/L Tris/HCl、pH值9.0、120 mmol/L NaCl、2 mmol/L EDTA）平衡Q FF離子交換層析柱（CV=30 mL）；之后將“1.4.3”中收集到的富含HSP65-MUC1的蛋白液流經Q FF離子交換層析柱并用20 mmol/L Tris/HCl、pH 9.0值、120 mmol/L NaCl、2 mmol/L EDTA沖洗至A280＜10 mAU；最后用洗脫緩沖液C（20 mmol/L Tris/HCl、pH值9.0、0.225 mol/L NaCl、2 mmol/L EDTA）和洗脫緩沖液D（20 mmol/L Tris/HCl、pH值9.0、1.5 mol/L NaCl、2 mmol/L EDTA）洗脫柱結合蛋白，SDS-PAGE電泳分析。
將收集到的富含HSP65-MUC1蛋白液再次過Q FF離子交換層析柱，并按照上述步驟進行更進一步的純化，以期獲得高純度的重組蛋白。
1.5 重組蛋白HSP65-MUC1的生物學活性檢測
第0天時，從正常健康志愿者體內抽取50 mL外周血，并用人外周血淋巴細胞分離液進行分離獲得單個核細胞。用磷酸鹽緩沖液（PBS）/EDTA洗滌1次，并用含2%高滲鹽水（HS）的PBS/EDTA溶液洗滌3次。最后用52% PERCOLL分離獲得的單核細胞。獲得的單核細胞經含2% HS的PBS/EDTA溶液洗滌，用含200 U/mLIL-4和100 ng/mL GM-CSF的1640完全培養基重懸并在平皿中培養5 d（隔天換1次液）。
第5天，收集懸浮細胞（即DC細胞），1 500 r/min離心10 min，棄去培養上清液，用1640完全培養基洗滌之后并重懸至細胞濃度為1×105 /mL。向一6孔板中加入重懸細胞（每孔2×105個細胞），并添加100 μg重組HSP65-MUC1于相應孔中（陽性對照孔中加入1 μg脂多糖）。
第7天時，收集孔內細胞轉移至流式管內，1 500 r/min離心收取細胞，之后用PBS洗滌2次。加入100 μL PBS振蕩細胞，每管中加入1 μL FITC標記的抗人CD86抗體（FITC-anti-hCD86），同時在對照管中加入1 μL FITC標記的同型抗體，混勻，4℃避光孵育30 min。用PBS洗滌2次并用300 μL PBS重懸細胞，流式細胞儀檢測。
1.6 統計學方法
采用SPSS 17.0軟件進行統計學分析。通過方差分析進行單因素分析。以P值＜0.05為有統計學意義。
2 結果
2.1 HSP65-MUC1融合蛋白的表達和鑒定
將驗證正確的重組質粒pET28a-HSP65-MUC1轉化大腸桿菌BL21（DE3），經1 mmol/L IPTG誘導3 h后，收集菌液并離心獲得菌體沉淀。將菌體沉淀經裂解緩沖液洗滌之后進行SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍染色結果顯示（圖 1a）：與誘導前的陰性對照相比，陽性克隆在66×103處有一個明顯的目的條帶。同時蛋白質印跡法結果顯示（圖 1b），無論是抗HSP65抗體還是抗MUC1抗體進行孵育，都能在66×103處見一個特異性的曝光條帶。
圖1
不同發酵誘導時間的表達分析及驗證 a. 不同誘導時間的表達分析，M為標準蛋白Markers，1為誘導前，2為誘導1 h，3為誘導2 h，4為誘導3 h，5為誘導4 h b.蛋白樣品的蛋白質印跡法分析，1為誘導前，2為誘導3 h
2.2 HSP65-MUC1融合蛋白中試生產工藝的優化
為了獲得高純度、高質量的HSP65-MUC1以滿足臨床試驗所需，我們對HSP65-MUC1的傳統中試生產工藝進行優化。
首先我們改變種子培養基成分配比，降低IPTG誘導濃度，利用5 L發酵罐獲取富含目的蛋白的菌體，平均每次可獲得380 g濕菌（表 1）。
表1
不同發酵批次獲得菌體量
其次，我們將經高壓均質機破碎獲得的上清液進行兩步飽和硫酸銨沉淀。當30%飽和硫酸銨處理3 h之后，離心獲得上清液和沉淀，分別對其進行蛋白電泳分析，結果顯示80%的目的蛋白存在于上清液中，同時能洗脫掉大部分的雜蛋白，尤其是大腸桿菌本身的宿主蛋白（35×103附近的兩條帶）（圖 2）。上述上清液再經50%的飽和硫酸銨處理3 h之后，我們發現目的蛋白主要存在于沉淀中（圖 2）。
圖2
飽和硫酸銨沉淀 M為標準蛋白Markers，1為破菌液上清，2為破菌液沉淀，3為30%飽和硫酸銨處理后上清，4為30%飽和硫酸銨處理后沉淀，5為50%飽和硫酸銨處理后上清，6為50%飽和硫酸銨處理后沉淀
其次，我們將經飽和硫酸銨處理后獲得的蛋白沉淀進行復溶，之后將復溶液過phenyl sepharose FF層析柱，降低鹽濃度，洗脫柱結合蛋白。結果顯示在用洗脫緩沖液A洗脫約20 mL之后，就開始出現非典型駝狀洗脫峰（圖 3a），之后改變洗脫緩沖液的鹽濃度（洗脫緩沖液B），仍出現蛋白峰（圖 3a）；蛋白電泳顯示在這兩個蛋白洗脫峰中都有目的蛋白存在（圖 3b），但洗脫緩沖液B洗出來的蛋白液濃度較低，體積較少，且雜蛋白濃度較大，故我們將洗脫緩沖液A洗脫的蛋白液混合，透析至含20 mmol/L Tris/HCl、pH值9.0、120 mmol/L NaCl、2 mmol/L EDTA的溶液中。
圖3
phenyl sepharose FF柱純化 a. AKTA純化監測圖 b. SDS-PAGE圖，M為標準蛋白Markers，1為穿透液，2為上樣前樣品，3為洗脫液A洗脫1，4為洗脫液A洗脫2，5為洗脫液A洗脫3，6為洗脫液B洗脫
我們再將透析過的蛋白液過Q FF離子交換層析柱，并分別用洗脫緩沖液C和洗脫緩沖液D洗脫柱結合蛋白。結果顯示：在低鹽濃度的洗脫環境下（20 mmol/L Tris/HCl、pH值9.0、225 mmol/L NaCl、2 mmol/L EDTA），有大部分蛋白從柱上脫落（圖 4a），蛋白電泳顯示其主要成分為重組蛋白HSP65-MUC1（圖 4b），純度達到92%；當洗脫緩沖液中的鹽濃度較高時（20 mmol/L Tris/HCl、pH值9.0、1.5 mol/L NaCl、2 mmol/L EDTA），其余的蛋白也從柱上脫落，但蛋白電泳結果顯示其主要成分為雜蛋白。
圖4
Q FF柱純化 a. AKTA純化監測圖 b. SDS-PAGE圖，M為標準蛋白Markers，1為上柱前樣品，2為穿透液，3為洗脫液C洗脫1，4為洗脫液C洗脫2，5為洗脫液C洗脫3，6為洗脫液D洗脫
為了進一步提高重組蛋白的純度，我們將目的蛋白洗脫液透析至含20 mmol/L Tris/HCl、pH值9.0、120 mmol/L NaCl、2 mmol/L EDTA的溶液中，并再次過Q FF離子交換層析柱純化，洗脫條件同上。結果顯示：在兩種洗脫條件下，都有蛋白峰出現，但在低鹽的環境中蛋白峰較大（圖 5a）；同時蛋白電泳結果顯示目的蛋白主要存在于低鹽洗脫液中（圖 5b），純度高達96%。
圖5
Q FF柱再純化 a. AKTA純化監測圖 b. SDS-PAGE圖，M為標準蛋白Markers，1為上柱前樣品，2為穿透液，3為洗脫液C洗脫1，4為洗脫液C洗脫2，5為洗脫液C洗脫3，6為洗脫液D洗脫
最后，將收集到的蛋白液透析至含20 mmol/L Tris/HCl、pH值9.0、120 mmol/L NaCl、2 mmol/L EDTA的溶液中，并測定蛋白濃度，計算平均得到413.7 mg重組蛋白（表 2）。
表2
不同發酵批次純化HSP65-MUC1的產量
2.3 HSP65-MUC1融合蛋白的生物學活性檢測
為了驗證HSP65-MUC1融合蛋白的生物學活性，我們分離獲得人DC細胞，經IL-4和GM-CSF刺激5 d 后，加入HSP65-MUC1融合蛋白，2 d后，收集細胞并用流式細胞儀分析DC細胞表面CD86分子的變化。結果顯示：HSP65-MUC1融合蛋白能顯著提高人DC細胞表面CD86的表達（圖 6），其陽性率為29.98% ± 1.02%，與陰性對照相比（10.13% ± 0.89%），提高約2.96倍，略低于脂多糖對照組（32.85% ± 0.97%）。這說明HSP65-MUC1融合蛋白能刺激人DC細胞的成熟。
圖6
HSP65-MUC1對DC細胞上CD86分子的影響 a. 陰性對照 b. HSP65-MUC1處理 c. 脂多糖處理 d. 3批樣品的柱狀圖分析
3 討論
研究顯示HSP65-MUC1作為一種融合蛋白，具有誘發針對MUC1特異性和非特異性的抗腫瘤功能[9]，同時多種腫瘤的臨床前研究也顯示HSP65-MUC1是一種有效的抗MUC1陽性腫瘤藥物[10-12]。鑒于此，中國國家食品藥品監督管理局已批準HSP65-MUC1進入MUC1陽性的乳腺癌Ⅰ期臨床試驗。為了保證臨床試驗的需求，在本研究中，我們對傳統的中試生產工藝進行了優化，在小試生產中，10 g發酵濕菌即可獲得400 mg的高純度蛋白。
重組蛋白的制備過程中，其產量的提高不僅依靠于下游的純化過程，而且其表達條件也發揮著重要的作用。在本研究中首先我們對HSP65-MUC1的發酵工藝進行優化，通過調整發酵用原材料的成分和配比，并降低了IPTG誘導劑的濃度，與其他研究相比[13, 14]，不僅提高了菌體的產量（每4 L發酵菌液獲得380 g濕菌），同時還大大提高了HSP65-MUC1在上清溶液中的表達量（超過50%）。
HSP65-MUC1的傳統中試生產工藝是通過phenyl sepharose柱和Q sepharose柱兩步純化的[14]。這樣的操作不僅快捷，減少了多步純化帶來的損失，而且還能有效地去除內毒素，提高產品質量，但這也導致了純化的HSP65-MUC1純度不夠。在本研究中，我們將目的蛋白富集菌液先經飽和硫酸銨沉淀，有效地去除大腸桿菌宿主蛋白及部分雜蛋白，同時此步操作并沒有降低目的蛋白的含量，而且樣品收集液可直接過phenyl sepharose FF柱，進行下游純化。
Thole等[15]的研究顯示卡介苗來源的HSP65穩定性較差，在大腸桿菌中進行表達的時候極易導致HSP65或HSP65融合蛋白發生降解，從而為其臨床應用帶來困擾。隨后，Portaro等[16]發現HSP65-MUC1融合蛋白的Lys41和Lys42之間存在一個組織蛋白酶酶切位點，導致HSP65-MUC1發生降解，而對此酶切位點進行定點突變也不能改變降解的發生。雖然其降解原因還不清楚，但是有研究發現通過提高純化體系的pH值、提高菌體的裂解鹽濃度可減少HSP65-MUC1的降解[13, 14]，而且在本研究中，我們在原有的純化體系之中加入EDTA，可明顯抑制蛋白的降解，這與先前部分報道存在差別[7]。
研究報道，HSP65-MUC1可通過DC細胞激活特異性的細胞毒性T淋巴細胞[17]，而當DC細胞被激活后，其表面的一些協同刺激分子的表達將上調，如CD86。在本研究中，我們用純化的HSP65-MUC1作用人外周血來源的DC細胞，經檢測其表面的CD86分子表達，發現純化的HSP65-MUC1能顯著提高CD86的表達，刺激DC細胞的活化，從而為臨床抗腫瘤研究提供支持。
HSP65-MUC1是將卡介苗來源的熱休克蛋白65（HSP65）與人的MUC1的抗原肽基因融合，并在大腸桿菌BL21（DE3）中表達獲得的重組融合蛋白[1]。HSP65-MUC1可通過刺激樹突狀細胞（DC）成熟，使其表面的CD86表達上調，并進一步刺激產生MUC1特異性的細胞毒性T淋巴細胞，抑制MUC1陽性的腫瘤細胞的生長[2, 3]，同時也激活非特異性抗腫瘤免疫反應，發揮抗腫瘤作用[4-6]。但是在HSP65-MUC1的純化過程中遇到的效率低、重復性不好、難于放大、成本較高等問題[7, 8]，限制了其應用。為了達到國家對基因工程藥物純度的要求，滿足臨床前藥物效應動力學研究及臨床試驗等各項需求，我們對HSP65-MUC1融合蛋白中試放大工藝進行了優化，并建立了簡便的生物學活性檢測方法，獲得了高純度、有活性的HSP65-MUC1融合蛋白。
1 材料和方法
1.1 材料
大腸桿菌菌株E. coli DH5α和E. coli BL21（DE3）均為本實驗室常規保存；重組表達質粒pET28a-HSP65-MUC1由成都信立邦生物制藥有限公司提供；細菌質粒DNA提取試劑盒購自北京道普生物技術中心；DNA相對分子質量標準購自大連TaKaRa公司；蛋白相對分子質量標準購自立陶宛Fermentas公司；脂多糖購自美國Sigma公司；白細胞介素-4（IL-4）和粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子（GM-CSF）購自上海普欣生物公司；抗HSP65和抗MUC1的抗體購自英國Abcam公司；異硫氰酸熒光橙紅（FITC）標記的抗人CD86抗體及同型對照購自美國BD公司。
1.2 重組質粒pET28a-HSP65-MUC1的驗證
將重組質粒pET28a-HSP65-MUC1轉化大腸桿菌菌株E. coli DH5α，挑取單克隆并擴大培養過夜，之后利用細菌質粒抽提試劑盒提取重組質粒pET28a-HSP65-MUC1。送到Invitrogen（上海）公司進行測序，并將正確的重組質粒轉化大腸桿菌E. coli BL21（DE3）。
1.3 HSP65-MUC1融合蛋白的表達和鑒定
將含有重組質粒pET28a-HSP65-MUC1的BL21（DE3）保種菌按照1%接種到5 mL種子培養基中，37℃振蕩培養16 h后獲得一級細菌種子液。取4 mL一級細菌種子液按照1%接種量接種到400 mL種子培養基中，37℃振蕩培養16 h后獲得二級細菌種子液。將二級種子液接入5 L發酵罐中，培養至A600=30 mAU 時（溶氧量為50%） 加入異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）（終濃度為0.1 mmol/L），繼續培養3.5 h，收菌并進行聚丙烯酰氨凝膠電泳（SDS-PAGE）。同時采用蛋白質免疫印跡法對表達蛋白進行鑒定。
1.4 中試生產工藝的優化
1.4.1 HSP65-MUC1的提取
稱取10 g菌體（濕質量），按照1︰20的比例重懸于200 mL的裂解緩沖液[（50 mmol/L Tris/HCl、pH值9.0、1.5 mol/L NaCl、5 mmol/L乙二胺四乙酸（EDTA）]中，在80 MPa的條件下高壓均質破菌3次（溫度不超過8℃）。將菌體裂解物4℃，12 000×g離心30 min（Thermo，SLA-3000），之后收集富含HSP65-MUC1融合蛋白的上清液。
1.4.2 飽和硫酸銨沉淀
將收集到的富含HSP65-MUC1的上清液置于4℃，向其中加入一定體積的飽和硫酸銨溶液至終濃度為30%，攪拌3 h，之后4℃，20 000×g離心20 min（Thermo，SA-300）。收集上清液，繼續加入飽和硫酸銨溶液，使其終濃度為50%，攪拌3 h，并按照上述離心條件離心，收集蛋白沉淀，并用溶解緩沖液（20 mmol/L Tris/HCl、pH值9.0、1.5 mol/L NaCl、5 mmol/L EDTA）重懸。
1.4.3 疏水層析
將含有phenyl sepharose FF填料的蛋白純化柱連接AKTA Purify系統，并用平衡緩沖液（20 mmol/L Tris/HCl、pH值9.0、1.5 mol/L NaCl、2 mmol/L EDTA）沖洗柱子至基線。將“1.4.2”中得到的蛋白重懸液過柱，用平衡緩沖液沖洗柱子至A280＜10 mAU，之后分別用含有不同鹽濃度的洗脫緩沖液（A液：20 mmol/L Tris/HCl、pH值9.0、0.345 mol/L NaCl、2 mmol/L EDTA；B液：20 mmol/L Tris/HCl、pH值9.0、2 mmol/L EDTA）沖洗柱子，并按照A280吸收峰值的變化收集洗脫液，SDS-PAGE電泳分析。
1.4.4 離子交換層析
首先用緩沖液（20 mmol/L Tris/HCl、pH值9.0、120 mmol/L NaCl、2 mmol/L EDTA）平衡Q FF離子交換層析柱（CV=30 mL）；之后將“1.4.3”中收集到的富含HSP65-MUC1的蛋白液流經Q FF離子交換層析柱并用20 mmol/L Tris/HCl、pH 9.0值、120 mmol/L NaCl、2 mmol/L EDTA沖洗至A280＜10 mAU；最后用洗脫緩沖液C（20 mmol/L Tris/HCl、pH值9.0、0.225 mol/L NaCl、2 mmol/L EDTA）和洗脫緩沖液D（20 mmol/L Tris/HCl、pH值9.0、1.5 mol/L NaCl、2 mmol/L EDTA）洗脫柱結合蛋白，SDS-PAGE電泳分析。
將收集到的富含HSP65-MUC1蛋白液再次過Q FF離子交換層析柱，并按照上述步驟進行更進一步的純化，以期獲得高純度的重組蛋白。
1.5 重組蛋白HSP65-MUC1的生物學活性檢測
第0天時，從正常健康志愿者體內抽取50 mL外周血，并用人外周血淋巴細胞分離液進行分離獲得單個核細胞。用磷酸鹽緩沖液（PBS）/EDTA洗滌1次，并用含2%高滲鹽水（HS）的PBS/EDTA溶液洗滌3次。最后用52% PERCOLL分離獲得的單核細胞。獲得的單核細胞經含2% HS的PBS/EDTA溶液洗滌，用含200 U/mLIL-4和100 ng/mL GM-CSF的1640完全培養基重懸并在平皿中培養5 d（隔天換1次液）。
第5天，收集懸浮細胞（即DC細胞），1 500 r/min離心10 min，棄去培養上清液，用1640完全培養基洗滌之后并重懸至細胞濃度為1×105 /mL。向一6孔板中加入重懸細胞（每孔2×105個細胞），并添加100 μg重組HSP65-MUC1于相應孔中（陽性對照孔中加入1 μg脂多糖）。
第7天時，收集孔內細胞轉移至流式管內，1 500 r/min離心收取細胞，之后用PBS洗滌2次。加入100 μL PBS振蕩細胞，每管中加入1 μL FITC標記的抗人CD86抗體（FITC-anti-hCD86），同時在對照管中加入1 μL FITC標記的同型抗體，混勻，4℃避光孵育30 min。用PBS洗滌2次并用300 μL PBS重懸細胞，流式細胞儀檢測。
1.6 統計學方法
采用SPSS 17.0軟件進行統計學分析。通過方差分析進行單因素分析。以P值＜0.05為有統計學意義。
2 結果
2.1 HSP65-MUC1融合蛋白的表達和鑒定
將驗證正確的重組質粒pET28a-HSP65-MUC1轉化大腸桿菌BL21（DE3），經1 mmol/L IPTG誘導3 h后，收集菌液并離心獲得菌體沉淀。將菌體沉淀經裂解緩沖液洗滌之后進行SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍染色結果顯示（圖 1a）：與誘導前的陰性對照相比，陽性克隆在66×103處有一個明顯的目的條帶。同時蛋白質印跡法結果顯示（圖 1b），無論是抗HSP65抗體還是抗MUC1抗體進行孵育，都能在66×103處見一個特異性的曝光條帶。
圖1
不同發酵誘導時間的表達分析及驗證 a. 不同誘導時間的表達分析，M為標準蛋白Markers，1為誘導前，2為誘導1 h，3為誘導2 h，4為誘導3 h，5為誘導4 h b.蛋白樣品的蛋白質印跡法分析，1為誘導前，2為誘導3 h
2.2 HSP65-MUC1融合蛋白中試生產工藝的優化
為了獲得高純度、高質量的HSP65-MUC1以滿足臨床試驗所需，我們對HSP65-MUC1的傳統中試生產工藝進行優化。
首先我們改變種子培養基成分配比，降低IPTG誘導濃度，利用5 L發酵罐獲取富含目的蛋白的菌體，平均每次可獲得380 g濕菌（表 1）。
表1
不同發酵批次獲得菌體量
其次，我們將經高壓均質機破碎獲得的上清液進行兩步飽和硫酸銨沉淀。當30%飽和硫酸銨處理3 h之后，離心獲得上清液和沉淀，分別對其進行蛋白電泳分析，結果顯示80%的目的蛋白存在于上清液中，同時能洗脫掉大部分的雜蛋白，尤其是大腸桿菌本身的宿主蛋白（35×103附近的兩條帶）（圖 2）。上述上清液再經50%的飽和硫酸銨處理3 h之后，我們發現目的蛋白主要存在于沉淀中（圖 2）。
圖2
飽和硫酸銨沉淀 M為標準蛋白Markers，1為破菌液上清，2為破菌液沉淀，3為30%飽和硫酸銨處理后上清，4為30%飽和硫酸銨處理后沉淀，5為50%飽和硫酸銨處理后上清，6為50%飽和硫酸銨處理后沉淀
其次，我們將經飽和硫酸銨處理后獲得的蛋白沉淀進行復溶，之后將復溶液過phenyl sepharose FF層析柱，降低鹽濃度，洗脫柱結合蛋白。結果顯示在用洗脫緩沖液A洗脫約20 mL之后，就開始出現非典型駝狀洗脫峰（圖 3a），之后改變洗脫緩沖液的鹽濃度（洗脫緩沖液B），仍出現蛋白峰（圖 3a）；蛋白電泳顯示在這兩個蛋白洗脫峰中都有目的蛋白存在（圖 3b），但洗脫緩沖液B洗出來的蛋白液濃度較低，體積較少，且雜蛋白濃度較大，故我們將洗脫緩沖液A洗脫的蛋白液混合，透析至含20 mmol/L Tris/HCl、pH值9.0、120 mmol/L NaCl、2 mmol/L EDTA的溶液中。
圖3
phenyl sepharose FF柱純化 a. AKTA純化監測圖 b. SDS-PAGE圖，M為標準蛋白Markers，1為穿透液，2為上樣前樣品，3為洗脫液A洗脫1，4為洗脫液A洗脫2，5為洗脫液A洗脫3，6為洗脫液B洗脫
我們再將透析過的蛋白液過Q FF離子交換層析柱，并分別用洗脫緩沖液C和洗脫緩沖液D洗脫柱結合蛋白。結果顯示：在低鹽濃度的洗脫環境下（20 mmol/L Tris/HCl、pH值9.0、225 mmol/L NaCl、2 mmol/L EDTA），有大部分蛋白從柱上脫落（圖 4a），蛋白電泳顯示其主要成分為重組蛋白HSP65-MUC1（圖 4b），純度達到92%；當洗脫緩沖液中的鹽濃度較高時（20 mmol/L Tris/HCl、pH值9.0、1.5 mol/L NaCl、2 mmol/L EDTA），其余的蛋白也從柱上脫落，但蛋白電泳結果顯示其主要成分為雜蛋白。
圖4
Q FF柱純化 a. AKTA純化監測圖 b. SDS-PAGE圖，M為標準蛋白Markers，1為上柱前樣品，2為穿透液，3為洗脫液C洗脫1，4為洗脫液C洗脫2，5為洗脫液C洗脫3，6為洗脫液D洗脫
為了進一步提高重組蛋白的純度，我們將目的蛋白洗脫液透析至含20 mmol/L Tris/HCl、pH值9.0、120 mmol/L NaCl、2 mmol/L EDTA的溶液中，并再次過Q FF離子交換層析柱純化，洗脫條件同上。結果顯示：在兩種洗脫條件下，都有蛋白峰出現，但在低鹽的環境中蛋白峰較大（圖 5a）；同時蛋白電泳結果顯示目的蛋白主要存在于低鹽洗脫液中（圖 5b），純度高達96%。
圖5
Q FF柱再純化 a. AKTA純化監測圖 b. SDS-PAGE圖，M為標準蛋白Markers，1為上柱前樣品，2為穿透液，3為洗脫液C洗脫1，4為洗脫液C洗脫2，5為洗脫液C洗脫3，6為洗脫液D洗脫
最后，將收集到的蛋白液透析至含20 mmol/L Tris/HCl、pH值9.0、120 mmol/L NaCl、2 mmol/L EDTA的溶液中，并測定蛋白濃度，計算平均得到413.7 mg重組蛋白（表 2）。
表2
不同發酵批次純化HSP65-MUC1的產量
2.3 HSP65-MUC1融合蛋白的生物學活性檢測
為了驗證HSP65-MUC1融合蛋白的生物學活性，我們分離獲得人DC細胞，經IL-4和GM-CSF刺激5 d 后，加入HSP65-MUC1融合蛋白，2 d后，收集細胞并用流式細胞儀分析DC細胞表面CD86分子的變化。結果顯示：HSP65-MUC1融合蛋白能顯著提高人DC細胞表面CD86的表達（圖 6），其陽性率為29.98% ± 1.02%，與陰性對照相比（10.13% ± 0.89%），提高約2.96倍，略低于脂多糖對照組（32.85% ± 0.97%）。這說明HSP65-MUC1融合蛋白能刺激人DC細胞的成熟。
圖6
HSP65-MUC1對DC細胞上CD86分子的影響 a. 陰性對照 b. HSP65-MUC1處理 c. 脂多糖處理 d. 3批樣品的柱狀圖分析
3 討論
研究顯示HSP65-MUC1作為一種融合蛋白，具有誘發針對MUC1特異性和非特異性的抗腫瘤功能[9]，同時多種腫瘤的臨床前研究也顯示HSP65-MUC1是一種有效的抗MUC1陽性腫瘤藥物[10-12]。鑒于此，中國國家食品藥品監督管理局已批準HSP65-MUC1進入MUC1陽性的乳腺癌Ⅰ期臨床試驗。為了保證臨床試驗的需求，在本研究中，我們對傳統的中試生產工藝進行了優化，在小試生產中，10 g發酵濕菌即可獲得400 mg的高純度蛋白。
重組蛋白的制備過程中，其產量的提高不僅依靠于下游的純化過程，而且其表達條件也發揮著重要的作用。在本研究中首先我們對HSP65-MUC1的發酵工藝進行優化，通過調整發酵用原材料的成分和配比，并降低了IPTG誘導劑的濃度，與其他研究相比[13, 14]，不僅提高了菌體的產量（每4 L發酵菌液獲得380 g濕菌），同時還大大提高了HSP65-MUC1在上清溶液中的表達量（超過50%）。
HSP65-MUC1的傳統中試生產工藝是通過phenyl sepharose柱和Q sepharose柱兩步純化的[14]。這樣的操作不僅快捷，減少了多步純化帶來的損失，而且還能有效地去除內毒素，提高產品質量，但這也導致了純化的HSP65-MUC1純度不夠。在本研究中，我們將目的蛋白富集菌液先經飽和硫酸銨沉淀，有效地去除大腸桿菌宿主蛋白及部分雜蛋白，同時此步操作并沒有降低目的蛋白的含量，而且樣品收集液可直接過phenyl sepharose FF柱，進行下游純化。
Thole等[15]的研究顯示卡介苗來源的HSP65穩定性較差，在大腸桿菌中進行表達的時候極易導致HSP65或HSP65融合蛋白發生降解，從而為其臨床應用帶來困擾。隨后，Portaro等[16]發現HSP65-MUC1融合蛋白的Lys41和Lys42之間存在一個組織蛋白酶酶切位點，導致HSP65-MUC1發生降解，而對此酶切位點進行定點突變也不能改變降解的發生。雖然其降解原因還不清楚，但是有研究發現通過提高純化體系的pH值、提高菌體的裂解鹽濃度可減少HSP65-MUC1的降解[13, 14]，而且在本研究中，我們在原有的純化體系之中加入EDTA，可明顯抑制蛋白的降解，這與先前部分報道存在差別[7]。
研究報道，HSP65-MUC1可通過DC細胞激活特異性的細胞毒性T淋巴細胞[17]，而當DC細胞被激活后，其表面的一些協同刺激分子的表達將上調，如CD86。在本研究中，我們用純化的HSP65-MUC1作用人外周血來源的DC細胞，經檢測其表面的CD86分子表達，發現純化的HSP65-MUC1能顯著提高CD86的表達，刺激DC細胞的活化，從而為臨床抗腫瘤研究提供支持。
