引用本文： 楊家紅, 張浩, 王秀, 陳皋, 陳學兵, 羅萬蓉, 蔣舒明. 四川德陽地區結核分枝桿菌耐藥基因突變位點的分布特點及基因型耐藥的分析. 華西醫學, 2014, 29(8): 1487-1490. doi: 10.7507/1002-0179.20140456 復制
結核分枝桿菌是重要的致病菌，WHO報告2012年全球大約有860萬新發結核病患者，中國約有100萬結核病患者，其中耐多藥結核患者約占5.7%，而再治療的結核病患者中耐多藥結核患者約占26% [1]。結核分枝桿菌對異煙肼及利福平同時耐藥即為耐多藥結核，該病嚴重阻礙了結核病防治的進展，已成為全球嚴重的公共衛生問題[2]。結核桿菌分離培養及菌種鑒定是目前較常用的方法，該方法檢測周期長，檢出率較低，不利于及時指導臨床診療。結核分枝桿菌耐藥基因檢測是一種快速、靈敏度高、特異性強的檢測方法，有利于指導臨床的診斷和治療。目前常見的基因突變位點分別為利福平rpoB基因的511、513、516、519、522、523、526、529、531及533位點，異煙肼katG基因的315位點和inhA基因的-15位點，鏈霉素rpsL基因的43及88位點及乙胺丁醇embB基因的306位點等[3]。我院分子生物學實驗室在2010年2月－2013年3月共檢測出結核分枝桿菌DNA陽性的肺結核患者257例，對上述患者的標本進行耐藥基因突變位點檢測，探索本地區結核分枝桿菌的耐藥基因突變位點的分布特點及基因型耐藥情況，現報告如下。
1 資料與方法
1.1 一般資料
收集我院臨床分子生物學實驗室2010年2月－2013年3月所有送檢痰液標本中結核分枝桿菌DNA陽性的257例患者標本（排除重復送檢及同一患者送檢的標本），其中男198例，女59例；年齡10～86歲，平均（50.5 ± 19.6）歲。所有結核分枝桿菌DNA陽性標本均保存于?70℃冰箱凍存并統一進行耐藥基因突變位點檢測。肺結核依據原衛生部WS 288－2008肺結核的診斷標準。本研究方案通過德陽市人民醫院倫理委員會審查。
1.2 儀器和試劑
結核分枝桿菌核酸檢測試劑盒購自凱杰生物工程（深圳）有限公司，采用瑞士羅氏公司LightCycler 480進行檢測。結核分枝桿菌核酸采用美國伯樂公司PTC-200型梯度聚合酶鏈式反應（PCR）分析儀進行PCR擴增。結核耐藥突變基因檢測試劑盒購自亞能生物技術（深圳）有限公司。
1.3 檢測方法
結核耐藥突變基因檢測試劑盒采用基因芯片技術，檢測rpoB、katG、inhA、embB、rpsL等5個結核耐藥基因的13種耐藥突變位點，提示對利福平、異煙肼、鏈霉素、乙胺丁醇等4種一線抗結核藥物的耐藥性（表 1）。本研究按照結核耐藥突變基因檢測試劑盒說明書完成對結核DNA陽性標本的PCR擴增、雜交及顯色等操作，根據試劑盒說明書進行檢測結果判定。
表1
結核分枝桿菌基因突變位點所對應的耐藥信息
1.4 統計學方法
采用SPSS 17.0軟件進行統計分析，計數資料采用χ2檢驗，P值＜0.05為有統計學意義。
2 結果
2.1 結核分枝桿菌耐藥基因突變位點的檢測結果
257例肺結核患者中結核分枝桿菌耐藥基因突變位點全部為野生型者208例（80.93%）；至少1個位點突變者49例（19.07%），其中單個位點突變者27例（10.51%），2個或2個以上位點突變者22例（8.56%）。
2.2 肺結核患者結核分枝桿菌耐藥基因突變位點的分布情況
257例肺結核患者的痰液標本中檢測出49例存在耐藥基因位點突變，其中katG 315位點和inhA-15位點突變分別為30、7例；rpoB 531、526、516位點突變分別為10、1、1例，511或513位點突變4例，526或529位點突變1例；embB 306位點突變11例；rpsL 43和88位點突變分別為18、5例，而其他位點未檢測出耐藥突變位點。全部耐藥突變位點中，katG 315位點突變最多，突變率達11.67%（30/257），其次分別為rpsL 43位點突變（7.00%）和embB 306位點突變（4.28%）。見表 2。
表2
肺結核患者結核分枝桿菌耐藥基因突變位點的分布
2.3 肺結核患者的基因型耐藥的分布情況
257例肺結核患者中，初治肺結核患者234例，復治肺結核患者23例。初治肺結核患者中單耐異煙肼、利福平和鏈霉素的患者分別為11例（4.70%）、3例（1.28%）和7例（2.99%），未檢測出單耐乙胺丁醇的患者；任耐異煙肼、利福平、乙胺丁醇及鏈霉素的患者分別為23例（9.83%）、10例（4.27%）、8例（3.42%）和12例（5.13%）；耐多藥患者7例（2.99%）。復治肺結核患者中，單耐異煙肼和利福平的患者分別為3例（13.04%）和3例（13.04%），未檢測出單耐乙胺丁醇及單耐鏈霉素的患者；任耐異煙肼、利福平、乙胺丁醇及鏈霉素的分別為12例（52.17%）、6例（26.09%）、3例（13.04%）和10例（43.48%）；耐多藥3例（13.04%）。在單耐、任耐及耐多藥結核的患者中，初治患者的耐藥比例均明顯低于復治患者。初治和復治患者中，對異煙肼耐藥的患者例數最多，分別為9.83%和52.17%。在1例初治和1例復治患者中同時檢測出對異煙肼、利福平、乙胺丁醇和鏈霉素耐藥。見表 3。
表3
肺結核患者的結核分枝桿菌基因型耐藥情況
3 討論
結核分枝桿菌耐藥的主要機制是因為基因突變[4]。研究表明異煙肼耐藥與過氧化氫酶-過氧化物酶編碼基因katG中315位點和（或）烯酰基還原酶編碼基因inhA中-15位點等基因突變有關[5-7]。利福平耐藥主要是由于rpoB基因編碼區發生了點突變、微缺失或微插入等，導致編碼的RNA聚合酶β亞基構象發生變化，使其與利福平的親合力下降[8]，其主要突變形式是531、526和516位點突變。引起乙胺丁醇耐藥的變異主要是embB基因306位點的變異，引起鏈霉素耐藥的變異主要是rpsL基因43和88位點的變異。通過對上述基因突變位點的檢測，臨床上能快速確定菌株對常見抗結核藥物的基因型耐藥情況。本研究對257例肺結核分枝桿菌DNA陽性標本進行上述耐藥基因突變位點檢測，發現異煙肼、利福平、乙胺丁醇及鏈霉素均存在耐藥基因位點突變。耐藥基因突變位點較高的分別為katG 315位點（11.67%）、rpsL 43位點（7.00%）、embB 306位點（4.28%）和rpoB 531絲氨酸突變位點（S531L）（3.89%）。本研究中，katG 315突變位點在耐異煙肼中的發生頻率為85.71%（30/35），rpsL 43突變位點在耐鏈霉素中的發生頻率為81.82%（18/22），rpoB 531位點絲氨酸突變在耐利福平中的發生頻率為62.5%（10/16），耐乙胺丁醇的embB 306位點突變11例。上述突變位點均為耐藥發生的主要突變位點，與文獻報道相似[9-15]。
本研究中，257例肺結核患者中至少1種藥物的基因型耐藥率為19.07%，對各藥物的耐藥率依次為異煙肼＞鏈霉素＞利福平＞乙胺丁醇。復治肺結核患者對上述4種藥物的基因型耐藥率均明顯高于初治患者，與文獻報道相似[16]。本研究還顯示，異煙肼耐藥患者中耐多藥率為28.57%（10/35），利福平耐藥患者中耐多藥率為62.5%（10/16），乙胺丁醇耐藥患者中耐多藥率為63.64%（7/11），提示對其中1種藥物耐藥后可能增加耐多藥風險[17]。
國內文獻報道，結核分枝桿菌的耐多藥率為11.58%～38.60%，初治耐多藥率為6.33%～6.95%，復治耐多藥率為34.39%～37.50%[16, 18-20]；本研究中肺結核患者的基因型耐多藥率為3.89%，初治患者的耐多藥率為2.99%，復治患者的耐多藥率為13.04%，均明顯低于上述研究的結果。文獻報道，肺結核患者中分離的結核分枝桿菌對異煙肼、利福平、乙胺丁醇及鏈霉素的耐藥率分別為14.2%～31.9%、15.1%～33.7%、8.9%～16.5%和18.6%～25.3%，耐多藥率為23.3%～27.5%[21-23]；本研究中，肺結核分枝桿菌對上述藥物的基因型耐藥率分別為13.62%、6.23%、4.28%和8.56%，基因型耐多藥率為3.89%，均低于上述文獻報道結果。其原因可能為本研究中檢測的結核分枝桿菌均為基因型耐藥，其檢測的突變位點均為常見的耐藥位點，其他較少見的耐藥位點未進行檢測；可能由于本地區結核分枝桿菌耐藥率較其他地區低。結核分枝桿菌的基因型耐藥與表型耐藥之間的關系尚有待進一步研究證實。
結核耐藥不僅是全球面臨的公共衛生問題，也是我國亟需面對和解決的難題。準確而快速地確定結核分枝桿菌有無耐藥及耐藥情況將有助于指導臨床診療，制定有效的防治方案，提高治愈率，減少結核分枝桿菌尤其是耐藥結核分枝桿菌的傳播。
結核分枝桿菌是重要的致病菌，WHO報告2012年全球大約有860萬新發結核病患者，中國約有100萬結核病患者，其中耐多藥結核患者約占5.7%，而再治療的結核病患者中耐多藥結核患者約占26% [1]。結核分枝桿菌對異煙肼及利福平同時耐藥即為耐多藥結核，該病嚴重阻礙了結核病防治的進展，已成為全球嚴重的公共衛生問題[2]。結核桿菌分離培養及菌種鑒定是目前較常用的方法，該方法檢測周期長，檢出率較低，不利于及時指導臨床診療。結核分枝桿菌耐藥基因檢測是一種快速、靈敏度高、特異性強的檢測方法，有利于指導臨床的診斷和治療。目前常見的基因突變位點分別為利福平rpoB基因的511、513、516、519、522、523、526、529、531及533位點，異煙肼katG基因的315位點和inhA基因的-15位點，鏈霉素rpsL基因的43及88位點及乙胺丁醇embB基因的306位點等[3]。我院分子生物學實驗室在2010年2月－2013年3月共檢測出結核分枝桿菌DNA陽性的肺結核患者257例，對上述患者的標本進行耐藥基因突變位點檢測，探索本地區結核分枝桿菌的耐藥基因突變位點的分布特點及基因型耐藥情況，現報告如下。
1 資料與方法
1.1 一般資料
收集我院臨床分子生物學實驗室2010年2月－2013年3月所有送檢痰液標本中結核分枝桿菌DNA陽性的257例患者標本（排除重復送檢及同一患者送檢的標本），其中男198例，女59例；年齡10～86歲，平均（50.5 ± 19.6）歲。所有結核分枝桿菌DNA陽性標本均保存于?70℃冰箱凍存并統一進行耐藥基因突變位點檢測。肺結核依據原衛生部WS 288－2008肺結核的診斷標準。本研究方案通過德陽市人民醫院倫理委員會審查。
1.2 儀器和試劑
結核分枝桿菌核酸檢測試劑盒購自凱杰生物工程（深圳）有限公司，采用瑞士羅氏公司LightCycler 480進行檢測。結核分枝桿菌核酸采用美國伯樂公司PTC-200型梯度聚合酶鏈式反應（PCR）分析儀進行PCR擴增。結核耐藥突變基因檢測試劑盒購自亞能生物技術（深圳）有限公司。
1.3 檢測方法
結核耐藥突變基因檢測試劑盒采用基因芯片技術，檢測rpoB、katG、inhA、embB、rpsL等5個結核耐藥基因的13種耐藥突變位點，提示對利福平、異煙肼、鏈霉素、乙胺丁醇等4種一線抗結核藥物的耐藥性（表 1）。本研究按照結核耐藥突變基因檢測試劑盒說明書完成對結核DNA陽性標本的PCR擴增、雜交及顯色等操作，根據試劑盒說明書進行檢測結果判定。
表1
結核分枝桿菌基因突變位點所對應的耐藥信息
1.4 統計學方法
采用SPSS 17.0軟件進行統計分析，計數資料采用χ2檢驗，P值＜0.05為有統計學意義。
2 結果
2.1 結核分枝桿菌耐藥基因突變位點的檢測結果
257例肺結核患者中結核分枝桿菌耐藥基因突變位點全部為野生型者208例（80.93%）；至少1個位點突變者49例（19.07%），其中單個位點突變者27例（10.51%），2個或2個以上位點突變者22例（8.56%）。
2.2 肺結核患者結核分枝桿菌耐藥基因突變位點的分布情況
257例肺結核患者的痰液標本中檢測出49例存在耐藥基因位點突變，其中katG 315位點和inhA-15位點突變分別為30、7例；rpoB 531、526、516位點突變分別為10、1、1例，511或513位點突變4例，526或529位點突變1例；embB 306位點突變11例；rpsL 43和88位點突變分別為18、5例，而其他位點未檢測出耐藥突變位點。全部耐藥突變位點中，katG 315位點突變最多，突變率達11.67%（30/257），其次分別為rpsL 43位點突變（7.00%）和embB 306位點突變（4.28%）。見表 2。
表2
肺結核患者結核分枝桿菌耐藥基因突變位點的分布
2.3 肺結核患者的基因型耐藥的分布情況
257例肺結核患者中，初治肺結核患者234例，復治肺結核患者23例。初治肺結核患者中單耐異煙肼、利福平和鏈霉素的患者分別為11例（4.70%）、3例（1.28%）和7例（2.99%），未檢測出單耐乙胺丁醇的患者；任耐異煙肼、利福平、乙胺丁醇及鏈霉素的患者分別為23例（9.83%）、10例（4.27%）、8例（3.42%）和12例（5.13%）；耐多藥患者7例（2.99%）。復治肺結核患者中，單耐異煙肼和利福平的患者分別為3例（13.04%）和3例（13.04%），未檢測出單耐乙胺丁醇及單耐鏈霉素的患者；任耐異煙肼、利福平、乙胺丁醇及鏈霉素的分別為12例（52.17%）、6例（26.09%）、3例（13.04%）和10例（43.48%）；耐多藥3例（13.04%）。在單耐、任耐及耐多藥結核的患者中，初治患者的耐藥比例均明顯低于復治患者。初治和復治患者中，對異煙肼耐藥的患者例數最多，分別為9.83%和52.17%。在1例初治和1例復治患者中同時檢測出對異煙肼、利福平、乙胺丁醇和鏈霉素耐藥。見表 3。
表3
肺結核患者的結核分枝桿菌基因型耐藥情況
3 討論
結核分枝桿菌耐藥的主要機制是因為基因突變[4]。研究表明異煙肼耐藥與過氧化氫酶-過氧化物酶編碼基因katG中315位點和（或）烯酰基還原酶編碼基因inhA中-15位點等基因突變有關[5-7]。利福平耐藥主要是由于rpoB基因編碼區發生了點突變、微缺失或微插入等，導致編碼的RNA聚合酶β亞基構象發生變化，使其與利福平的親合力下降[8]，其主要突變形式是531、526和516位點突變。引起乙胺丁醇耐藥的變異主要是embB基因306位點的變異，引起鏈霉素耐藥的變異主要是rpsL基因43和88位點的變異。通過對上述基因突變位點的檢測，臨床上能快速確定菌株對常見抗結核藥物的基因型耐藥情況。本研究對257例肺結核分枝桿菌DNA陽性標本進行上述耐藥基因突變位點檢測，發現異煙肼、利福平、乙胺丁醇及鏈霉素均存在耐藥基因位點突變。耐藥基因突變位點較高的分別為katG 315位點（11.67%）、rpsL 43位點（7.00%）、embB 306位點（4.28%）和rpoB 531絲氨酸突變位點（S531L）（3.89%）。本研究中，katG 315突變位點在耐異煙肼中的發生頻率為85.71%（30/35），rpsL 43突變位點在耐鏈霉素中的發生頻率為81.82%（18/22），rpoB 531位點絲氨酸突變在耐利福平中的發生頻率為62.5%（10/16），耐乙胺丁醇的embB 306位點突變11例。上述突變位點均為耐藥發生的主要突變位點，與文獻報道相似[9-15]。
本研究中，257例肺結核患者中至少1種藥物的基因型耐藥率為19.07%，對各藥物的耐藥率依次為異煙肼＞鏈霉素＞利福平＞乙胺丁醇。復治肺結核患者對上述4種藥物的基因型耐藥率均明顯高于初治患者，與文獻報道相似[16]。本研究還顯示，異煙肼耐藥患者中耐多藥率為28.57%（10/35），利福平耐藥患者中耐多藥率為62.5%（10/16），乙胺丁醇耐藥患者中耐多藥率為63.64%（7/11），提示對其中1種藥物耐藥后可能增加耐多藥風險[17]。
國內文獻報道，結核分枝桿菌的耐多藥率為11.58%～38.60%，初治耐多藥率為6.33%～6.95%，復治耐多藥率為34.39%～37.50%[16, 18-20]；本研究中肺結核患者的基因型耐多藥率為3.89%，初治患者的耐多藥率為2.99%，復治患者的耐多藥率為13.04%，均明顯低于上述研究的結果。文獻報道，肺結核患者中分離的結核分枝桿菌對異煙肼、利福平、乙胺丁醇及鏈霉素的耐藥率分別為14.2%～31.9%、15.1%～33.7%、8.9%～16.5%和18.6%～25.3%，耐多藥率為23.3%～27.5%[21-23]；本研究中，肺結核分枝桿菌對上述藥物的基因型耐藥率分別為13.62%、6.23%、4.28%和8.56%，基因型耐多藥率為3.89%，均低于上述文獻報道結果。其原因可能為本研究中檢測的結核分枝桿菌均為基因型耐藥，其檢測的突變位點均為常見的耐藥位點，其他較少見的耐藥位點未進行檢測；可能由于本地區結核分枝桿菌耐藥率較其他地區低。結核分枝桿菌的基因型耐藥與表型耐藥之間的關系尚有待進一步研究證實。
結核耐藥不僅是全球面臨的公共衛生問題，也是我國亟需面對和解決的難題。準確而快速地確定結核分枝桿菌有無耐藥及耐藥情況將有助于指導臨床診療，制定有效的防治方案，提高治愈率，減少結核分枝桿菌尤其是耐藥結核分枝桿菌的傳播。
