引用本文： 鄒品嬌, 吳娟, 姜云平, 金偉華, 蔣燕, 于波濤, 范開華. 結核患者胸水中異煙肼濃度的測定. 華西醫學, 2014, 29(8): 1483-1486. doi: 10.7507/1002-0179.20140455 復制
結核病是由結核分枝桿菌引起的傳染病。當今結核病在全球及我國發生嚴重。據世界衛生組織報道，2005年全球近1/3的人已感染結核分枝桿菌，即20億人口感染了結核分枝桿菌[1]。抗結核藥物是結核病化學治療的基礎，是人類控制結核病的主要手段。結核病化學治療的出現使結核病的控制有了劃時代的改變，全球結核病疫情由此得以迅速下降[2]。目前在抗結核治療中，利福平、異煙肼、吡嗪酰胺、乙胺丁醇仍是一線用藥，并以其聯合使用為基本治療方案。其中異煙肼是各類結核病的首選治療藥物，用量較小，療效較好，口服吸收率為90% [3]。適用于肺、淋巴、骨等各種類型的結核病[4]。異煙肼早已成為結核病研究的焦點，其在人體內的最小抑菌濃度為0.02～0.05 μg/mL。提高胸水中的異煙肼濃度，可增強其抗結核作用[5]。由于從血液中進入胸膜腔的藥物可能較少[6]，因此需要一種靈敏度高、專屬性強的檢測方法。2009年2月－6月我們建立了用高效液相色譜儀測定結核患者胸水中異煙肼濃度的方法，計算精密度、樣品回收率、測定穩定性，觀察結核患者胸水中的異煙肼濃度情況，指導臨床應用藥。
1 儀器與試藥
1.1 儀器
采用美國安捷倫公司Agilent1200高效液相色譜儀（G1322A Degaster，G1311A Quat Pump；G1329A Als；G1316A Tcc；G1314B VWD）；YKH-Ⅱ型液體快速混合器（北京鴻泰順達科技有限公司）；SYZ-A型石英亞沸高純水蒸餾器（金壇市科興儀器廠）；KDC-160HR高速冷凍離心機（鄭州宏朗儀器設備有限公司）；Beckman DU-640型紫外分光光度計（美國貝克曼庫爾特公司）。
1.2 試藥
異煙肼注射液（2 mL：0.1 g，重慶太極集團，國藥準字H50021470）；甲醇（分析純，成都科龍化工試劑廠）；甲醇（色譜純，鄭州安賽生物科技有限公司）；高純水（自制）；無水磷酸氫二鈉（分析純，四川什邡川鴻化工廠）。
2 試驗準備
2.1 配制系列濃度的異煙肼水溶液
用微量進樣針分別量取0.5、1.0、2.5、5.0、2.5、5.0 μL 濃度為50 μg/mL的異煙肼注射液，分別放入100、100、100、100、250、250 mL的容量瓶中，用高純水加至刻度，得濃度分別為0.25、0.50、1.25、2.50、5.00、10.00 μg/mL的異煙肼溶液。
2.2 模擬胸水樣品的配制
2.2.1 配制系列濃度的異煙肼溶液
用微量取樣針分別量取0.5、1.0、2.5、5.0、2.5、5.0 μL濃度為50 μg/mL 的異煙肼注射液，分別放入50、50、25、10、10、10 mL的容量瓶中，用高純水水加至刻度，得濃度分別為10、20、50、100、200、400 μg/mL異煙肼溶液。
2.2.2 配制不同濃度異煙肼的模擬胸水樣品
用微量取樣針分別量取10、20、50、100、200、400 μg/mL的異煙肼溶液10 μL于離心管中，加入400 μL空白胸水，配制得到濃度分別為0.25、0.50、1.25、2.50、5.00、10.00 μg/mL的異煙肼模擬胸水樣品。
2.3 確定胸水樣品的處理方法
用三氯醋酸沉淀蛋白，效果不理想。確定取400 μL 胸水中加入600 μL甲醇（分析純）以沉淀蛋白[7]，渦旋混勻3 min后，在10 000 r/min條件下離心10 min，取上清液測定。
2.4 確定檢測波長
用上述配制的濃度為5 μg/mL的異煙肼水溶液在Beckman DU-640型紫外分光光度計下進行掃描，找出其具有紫外吸收的波長范圍。再根據所查閱的文獻確定其檢測波長為254 nm [8]。
2.5 確定流動相
配制pH=6的磷酸緩沖液：稱取0.7 g無水磷酸氫二鈉，加入250 mL蒸餾水，溶解，得濃度為0.02 mol/L 的磷酸氫二鈉溶液，加入磷酸，得pH=6的磷酸緩沖液。把此緩沖液過濾，得流動相所用的磷酸緩沖液。
用水︰甲醇（色譜純）︰磷酸緩沖液（pH=6）=85︰5︰10作為流動相[8]，此條件下異煙肼的保留時間為10.5 min，保留時間過長。
增加甲醇和磷酸緩沖液的比例，使水︰甲醇︰磷酸緩沖液（pH=6）=65︰15︰20，此條件下異煙肼的保留時間為4.7 min。在此條件下測定測定空白胸水的色譜圖，空白胸水在4.7 min左右有峰出現，不能與異煙肼分離。適當增加和減少甲醇的比例，都不能使空白胸水中的物質與異煙肼完全分離。所以此流動相不能用于測定胸水中異煙肼的濃度。
用甲醇︰水=20︰80作為流動相[9]，此條件下異煙肼的保留時間為3.7 min，在此條件下測定空白胸水的色譜圖，空白胸水中的物質與異煙肼可以基本分離。所以用此流動相作為本試驗的流動相。
3 測定方法與結果
3.1 色譜條件
色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18（5 μm，4.6 mm× 2.5 mm）；柱溫：室溫；柱壓：200×105 Pa；流動相︰甲醇（色譜純）︰高純水=20︰80；流速：1 mL/min；檢測波長：254 nm。在此色譜條件下，異煙肼的保留時間約為3.7 min。
3.2 胸水樣品的處理
精密量取胸水樣品400 μL，加入600 μL甲醇（分析純）沉淀蛋白，渦旋混勻3 min后，在10 000 r/min 條件下離心10 min。分取上清液于裝樣瓶中，在上述色譜條件下進樣20 μL分離測定。測得空白胸水、異煙肼溶液和模擬胸水樣品的色譜圖見圖 1～3，在此色譜條件下胸水中的物質基本不影響異煙肼的分離測定。
圖1
空白胸水色譜圖 ? ? 圖 2異煙肼溶液色譜圖 ? ? 圖 3模擬胸水樣品色譜圖
3.3 標準曲線的制備
3.3.1 異煙肼水溶液的標準曲線
按上述不同濃度異煙肼水溶液的配置方法配制濃度分別為0.25、0.50、1.25、2.50、5.00、10.00 μg/mL的異煙肼水溶液[10]。在上述色譜條件下進樣20 μL測定。以異煙肼濃度與峰面積進行線性回歸，得異煙肼的水溶液的回歸方程為：Y=33.38X?0.812 5，相關系數r=0.999 9。
3.3.2 不同濃度的異煙肼的模擬胸水樣品的標準曲線
按上述胸水樣品的配制方法配制濃度分別為0.25、0.50、1.25、2.50、5.00、10.00 μg/mL的異煙肼溶液的模擬胸水樣品，按上述胸水樣品處理方法處理后，在上述色譜條件下進樣20 μL測定。以異煙肼濃度與峰面積進行線性回歸，得異煙肼的模擬胸水樣品的回歸方程為：Y=12.758X+7.501 6，相關系數r=0.998 9。
3.4 精密度試驗
3.4.1 日內精密度
按上述模擬胸水樣品的配制方法配制濃度分別為0.5、5.0、10.0 μg/mL的胸水樣品，每個濃度做5份。用上述胸水樣品處理方法處理，在上述色譜條件下進樣20 μL進行測定。測得5個數據計算日內相對標準偏差（RSD）。結果得異煙肼低、中、高3種不同濃度樣品的日內RSD分別為3.49%、1.45%、2.03%。見表 1。
表1
日內精密度試驗結果
3.4.2 日間精密度
按上述模擬胸水樣品的配制方法配制濃度分別為0.5、5.0、10.0 μg/mL的胸水樣品。用上述胸水樣品處理方法處理后進樣20 μL，在上述色譜條件下連續進樣5 d，計算日間RSD。結果得異煙肼低、中、高3種不同濃度樣品的日間RSD分別為3.85%、5.68%、4.15%。見表 2。
表2
日間精密度試驗結果
3.5 回收率試驗
3.5.1 隨性標準曲線的制備
按上述胸水樣品的配制方法配制濃度分別為0.25、0.50、1.25、2.50、5.00、10.00 μg/mL的異煙肼溶液模擬胸水樣品，按上述胸水樣品處理方法處理后，在上述色譜條件下進樣20 μL測定。以藥物濃度與峰面積進行線性回歸，結果得異煙肼的回歸方程為Y=13.004X+10.6，相關系數r=0.999 2。
3.5.2 方法回收率
按上述模擬胸水樣品的配制方法配制濃度分別為0.5、5.0、10.0 μg/mL的胸水樣品3份。用上述胸水樣品處理方法處理后進樣20 μL，在上述色譜條件下測定，將所得峰面積代入上述線性方程，計算藥物濃度。將計算所得出的濃度比上樣品的實際濃度，計算方法回收率。結果得低、中、高3種濃度的異煙肼模擬胸水樣品的回收率結果。見表 3。
表3
方法回收率
3.6 穩定性試驗
按上述模擬胸水樣品的配制方法配制濃度分別為0.5、5.0、10.0 μg/mL的胸水樣品2份。其中1份按上述胸水樣品處理方法處理后，在上述色譜條件下進樣20 μL 測定峰面積。另外1份在?40℃條件下冷凍，15 d后取出解凍，解凍后按上述胸水樣品處理方法處理，在上述色譜條件下進樣20 μL測定。測得峰面積比第一份所測得的峰面積有較少的減小。所以異煙肼較穩定。
3.7 樣品的測定
取患者用藥后的胸水400 μL，加入600 μL甲醇以沉淀蛋白。渦旋混勻3 min后，在10 000 r/min條件下離心10 min。分取上清液于裝樣瓶中，在上述色譜條件下進樣20 μL以分離測定。測得患者胸水中的異煙肼濃度為4.03、7.17 μg/mL。
4 討論
結核病是一種嚴重危害人類健康的慢性傳染病，是我國重點控制的疾病之一[11]。結核病是由結核分枝桿菌感染引起的慢性傳染病，結核分枝桿菌可能侵入人體全身各種器官，但主要侵犯肺臟[12]。異煙肼作為一線抗結核藥物，應用非常廣泛，但異煙肼的肝毒性較大，并有外周神經炎的不良反應，在抗結核治療過程中，其濃度與抗結核治療效果及藥物不良反應密切相關[13]。異煙肼是一種具有殺菌作用的合成抗菌藥，主要停留在椎骨，不廣泛滲透到血液及其他器官，除了腎臟[14]。在病理情況下，異煙肼在體內存在較明顯的組織分布差異[15]。異煙肼主要對生長繁殖期的分枝桿菌有效，是全效殺菌藥。其最低抑菌濃度為0.02～0.05 μg/mL。本藥可分布于全身組織和體液中，包括胸、腹水、皮膚、肌肉和乳汁中。本藥的蛋白結合率＜10%，分布容積為0.6～0.75 L/kg ，主要在肝臟通過乙酰化代謝。此法測得患者胸水中的異煙肼濃度為4.03、7.17 μg/mL。
目前，測定異煙肼體液濃度有許多方法[16, 17]，但大都存在提取率低，操作繁瑣的問題[18]，而本法建立的對結核患者胸水中異煙肼濃度的測定準確、靈敏、重現性好；流動相為甲醇（色譜純）、高純水，此流動相簡單、易得，對色譜柱的損傷較小。本法用甲醇沉淀蛋白，渦旋混勻，離心后取上清液處理胸水樣品，方法簡便、有效。異煙肼在此色譜條件下的保留時間為3.7 min。而空白胸水在此時間內無峰出現，雖然在異煙肼出峰后，空白胸水仍有峰出現，與異煙肼的峰有很少一部分重合，但不影響積分，不影響異煙肼的分離測定。
結核病是由結核分枝桿菌引起的傳染病。當今結核病在全球及我國發生嚴重。據世界衛生組織報道，2005年全球近1/3的人已感染結核分枝桿菌，即20億人口感染了結核分枝桿菌[1]。抗結核藥物是結核病化學治療的基礎，是人類控制結核病的主要手段。結核病化學治療的出現使結核病的控制有了劃時代的改變，全球結核病疫情由此得以迅速下降[2]。目前在抗結核治療中，利福平、異煙肼、吡嗪酰胺、乙胺丁醇仍是一線用藥，并以其聯合使用為基本治療方案。其中異煙肼是各類結核病的首選治療藥物，用量較小，療效較好，口服吸收率為90% [3]。適用于肺、淋巴、骨等各種類型的結核病[4]。異煙肼早已成為結核病研究的焦點，其在人體內的最小抑菌濃度為0.02～0.05 μg/mL。提高胸水中的異煙肼濃度，可增強其抗結核作用[5]。由于從血液中進入胸膜腔的藥物可能較少[6]，因此需要一種靈敏度高、專屬性強的檢測方法。2009年2月－6月我們建立了用高效液相色譜儀測定結核患者胸水中異煙肼濃度的方法，計算精密度、樣品回收率、測定穩定性，觀察結核患者胸水中的異煙肼濃度情況，指導臨床應用藥。
1 儀器與試藥
1.1 儀器
采用美國安捷倫公司Agilent1200高效液相色譜儀（G1322A Degaster，G1311A Quat Pump；G1329A Als；G1316A Tcc；G1314B VWD）；YKH-Ⅱ型液體快速混合器（北京鴻泰順達科技有限公司）；SYZ-A型石英亞沸高純水蒸餾器（金壇市科興儀器廠）；KDC-160HR高速冷凍離心機（鄭州宏朗儀器設備有限公司）；Beckman DU-640型紫外分光光度計（美國貝克曼庫爾特公司）。
1.2 試藥
異煙肼注射液（2 mL：0.1 g，重慶太極集團，國藥準字H50021470）；甲醇（分析純，成都科龍化工試劑廠）；甲醇（色譜純，鄭州安賽生物科技有限公司）；高純水（自制）；無水磷酸氫二鈉（分析純，四川什邡川鴻化工廠）。
2 試驗準備
2.1 配制系列濃度的異煙肼水溶液
用微量進樣針分別量取0.5、1.0、2.5、5.0、2.5、5.0 μL 濃度為50 μg/mL的異煙肼注射液，分別放入100、100、100、100、250、250 mL的容量瓶中，用高純水加至刻度，得濃度分別為0.25、0.50、1.25、2.50、5.00、10.00 μg/mL的異煙肼溶液。
2.2 模擬胸水樣品的配制
2.2.1 配制系列濃度的異煙肼溶液
用微量取樣針分別量取0.5、1.0、2.5、5.0、2.5、5.0 μL濃度為50 μg/mL 的異煙肼注射液，分別放入50、50、25、10、10、10 mL的容量瓶中，用高純水水加至刻度，得濃度分別為10、20、50、100、200、400 μg/mL異煙肼溶液。
2.2.2 配制不同濃度異煙肼的模擬胸水樣品
用微量取樣針分別量取10、20、50、100、200、400 μg/mL的異煙肼溶液10 μL于離心管中，加入400 μL空白胸水，配制得到濃度分別為0.25、0.50、1.25、2.50、5.00、10.00 μg/mL的異煙肼模擬胸水樣品。
2.3 確定胸水樣品的處理方法
用三氯醋酸沉淀蛋白，效果不理想。確定取400 μL 胸水中加入600 μL甲醇（分析純）以沉淀蛋白[7]，渦旋混勻3 min后，在10 000 r/min條件下離心10 min，取上清液測定。
2.4 確定檢測波長
用上述配制的濃度為5 μg/mL的異煙肼水溶液在Beckman DU-640型紫外分光光度計下進行掃描，找出其具有紫外吸收的波長范圍。再根據所查閱的文獻確定其檢測波長為254 nm [8]。
2.5 確定流動相
配制pH=6的磷酸緩沖液：稱取0.7 g無水磷酸氫二鈉，加入250 mL蒸餾水，溶解，得濃度為0.02 mol/L 的磷酸氫二鈉溶液，加入磷酸，得pH=6的磷酸緩沖液。把此緩沖液過濾，得流動相所用的磷酸緩沖液。
用水︰甲醇（色譜純）︰磷酸緩沖液（pH=6）=85︰5︰10作為流動相[8]，此條件下異煙肼的保留時間為10.5 min，保留時間過長。
增加甲醇和磷酸緩沖液的比例，使水︰甲醇︰磷酸緩沖液（pH=6）=65︰15︰20，此條件下異煙肼的保留時間為4.7 min。在此條件下測定測定空白胸水的色譜圖，空白胸水在4.7 min左右有峰出現，不能與異煙肼分離。適當增加和減少甲醇的比例，都不能使空白胸水中的物質與異煙肼完全分離。所以此流動相不能用于測定胸水中異煙肼的濃度。
用甲醇︰水=20︰80作為流動相[9]，此條件下異煙肼的保留時間為3.7 min，在此條件下測定空白胸水的色譜圖，空白胸水中的物質與異煙肼可以基本分離。所以用此流動相作為本試驗的流動相。
3 測定方法與結果
3.1 色譜條件
色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18（5 μm，4.6 mm× 2.5 mm）；柱溫：室溫；柱壓：200×105 Pa；流動相︰甲醇（色譜純）︰高純水=20︰80；流速：1 mL/min；檢測波長：254 nm。在此色譜條件下，異煙肼的保留時間約為3.7 min。
3.2 胸水樣品的處理
精密量取胸水樣品400 μL，加入600 μL甲醇（分析純）沉淀蛋白，渦旋混勻3 min后，在10 000 r/min 條件下離心10 min。分取上清液于裝樣瓶中，在上述色譜條件下進樣20 μL分離測定。測得空白胸水、異煙肼溶液和模擬胸水樣品的色譜圖見圖 1～3，在此色譜條件下胸水中的物質基本不影響異煙肼的分離測定。
圖1
空白胸水色譜圖 ? ? 圖 2異煙肼溶液色譜圖 ? ? 圖 3模擬胸水樣品色譜圖
3.3 標準曲線的制備
3.3.1 異煙肼水溶液的標準曲線
按上述不同濃度異煙肼水溶液的配置方法配制濃度分別為0.25、0.50、1.25、2.50、5.00、10.00 μg/mL的異煙肼水溶液[10]。在上述色譜條件下進樣20 μL測定。以異煙肼濃度與峰面積進行線性回歸，得異煙肼的水溶液的回歸方程為：Y=33.38X?0.812 5，相關系數r=0.999 9。
3.3.2 不同濃度的異煙肼的模擬胸水樣品的標準曲線
按上述胸水樣品的配制方法配制濃度分別為0.25、0.50、1.25、2.50、5.00、10.00 μg/mL的異煙肼溶液的模擬胸水樣品，按上述胸水樣品處理方法處理后，在上述色譜條件下進樣20 μL測定。以異煙肼濃度與峰面積進行線性回歸，得異煙肼的模擬胸水樣品的回歸方程為：Y=12.758X+7.501 6，相關系數r=0.998 9。
3.4 精密度試驗
3.4.1 日內精密度
按上述模擬胸水樣品的配制方法配制濃度分別為0.5、5.0、10.0 μg/mL的胸水樣品，每個濃度做5份。用上述胸水樣品處理方法處理，在上述色譜條件下進樣20 μL進行測定。測得5個數據計算日內相對標準偏差（RSD）。結果得異煙肼低、中、高3種不同濃度樣品的日內RSD分別為3.49%、1.45%、2.03%。見表 1。
表1
日內精密度試驗結果
3.4.2 日間精密度
按上述模擬胸水樣品的配制方法配制濃度分別為0.5、5.0、10.0 μg/mL的胸水樣品。用上述胸水樣品處理方法處理后進樣20 μL，在上述色譜條件下連續進樣5 d，計算日間RSD。結果得異煙肼低、中、高3種不同濃度樣品的日間RSD分別為3.85%、5.68%、4.15%。見表 2。
表2
日間精密度試驗結果
3.5 回收率試驗
3.5.1 隨性標準曲線的制備
按上述胸水樣品的配制方法配制濃度分別為0.25、0.50、1.25、2.50、5.00、10.00 μg/mL的異煙肼溶液模擬胸水樣品，按上述胸水樣品處理方法處理后，在上述色譜條件下進樣20 μL測定。以藥物濃度與峰面積進行線性回歸，結果得異煙肼的回歸方程為Y=13.004X+10.6，相關系數r=0.999 2。
3.5.2 方法回收率
按上述模擬胸水樣品的配制方法配制濃度分別為0.5、5.0、10.0 μg/mL的胸水樣品3份。用上述胸水樣品處理方法處理后進樣20 μL，在上述色譜條件下測定，將所得峰面積代入上述線性方程，計算藥物濃度。將計算所得出的濃度比上樣品的實際濃度，計算方法回收率。結果得低、中、高3種濃度的異煙肼模擬胸水樣品的回收率結果。見表 3。
表3
方法回收率
3.6 穩定性試驗
按上述模擬胸水樣品的配制方法配制濃度分別為0.5、5.0、10.0 μg/mL的胸水樣品2份。其中1份按上述胸水樣品處理方法處理后，在上述色譜條件下進樣20 μL 測定峰面積。另外1份在?40℃條件下冷凍，15 d后取出解凍，解凍后按上述胸水樣品處理方法處理，在上述色譜條件下進樣20 μL測定。測得峰面積比第一份所測得的峰面積有較少的減小。所以異煙肼較穩定。
3.7 樣品的測定
取患者用藥后的胸水400 μL，加入600 μL甲醇以沉淀蛋白。渦旋混勻3 min后，在10 000 r/min條件下離心10 min。分取上清液于裝樣瓶中，在上述色譜條件下進樣20 μL以分離測定。測得患者胸水中的異煙肼濃度為4.03、7.17 μg/mL。
4 討論
結核病是一種嚴重危害人類健康的慢性傳染病，是我國重點控制的疾病之一[11]。結核病是由結核分枝桿菌感染引起的慢性傳染病，結核分枝桿菌可能侵入人體全身各種器官，但主要侵犯肺臟[12]。異煙肼作為一線抗結核藥物，應用非常廣泛，但異煙肼的肝毒性較大，并有外周神經炎的不良反應，在抗結核治療過程中，其濃度與抗結核治療效果及藥物不良反應密切相關[13]。異煙肼是一種具有殺菌作用的合成抗菌藥，主要停留在椎骨，不廣泛滲透到血液及其他器官，除了腎臟[14]。在病理情況下，異煙肼在體內存在較明顯的組織分布差異[15]。異煙肼主要對生長繁殖期的分枝桿菌有效，是全效殺菌藥。其最低抑菌濃度為0.02～0.05 μg/mL。本藥可分布于全身組織和體液中，包括胸、腹水、皮膚、肌肉和乳汁中。本藥的蛋白結合率＜10%，分布容積為0.6～0.75 L/kg ，主要在肝臟通過乙酰化代謝。此法測得患者胸水中的異煙肼濃度為4.03、7.17 μg/mL。
目前，測定異煙肼體液濃度有許多方法[16, 17]，但大都存在提取率低，操作繁瑣的問題[18]，而本法建立的對結核患者胸水中異煙肼濃度的測定準確、靈敏、重現性好；流動相為甲醇（色譜純）、高純水，此流動相簡單、易得，對色譜柱的損傷較小。本法用甲醇沉淀蛋白，渦旋混勻，離心后取上清液處理胸水樣品，方法簡便、有效。異煙肼在此色譜條件下的保留時間為3.7 min。而空白胸水在此時間內無峰出現，雖然在異煙肼出峰后，空白胸水仍有峰出現，與異煙肼的峰有很少一部分重合，但不影響積分，不影響異煙肼的分離測定。
