引用本文： 辛朝雄, 王鴻武, 吳小霞, 鄭偉嬌, 陳惠芬. 結核感染T細胞試驗在兒童結核病臨床診斷中的應用研究. 華西醫學, 2014, 29(8): 1464-1468. doi: 10.7507/1002-0179.20140450 復制
兒童結核病是指年齡0～14歲期間發生的全身各器官的結核病，也是引起發展中國家兒童死亡的重要原因之一[1]。據世界衛生組織報告，全球每年新發結核病900萬例，其中兒童結核病約占10%；每年因結核病死亡200萬～300萬例，其中約有17萬兒童因患肺結核而死亡[2]。兒童結核病臨床診斷相對困難，若治療不及時，易發生血行播散而引起粟粒性肺結核和結核性腦膜炎等，致殘率和病死率高。本研究通過對112例兒童結核病患者和對照組分別進行結核感染T細胞試驗（T-SPOT.TB）、結核菌素純蛋白衍生物皮膚試驗（PPD皮試）、結核抗體檢測（TB-DOT）、痰涂片抗酸染色、痰結核分枝桿菌培養，對不同方法的檢測結果進行統計學分析，從而探討T-SPOT.TB在兒童結核病臨床診斷中的應用價值。
1 資料與方法
1.1 一般資料
選取2012年3月－12月在汕頭市結核病防治所門診和汕頭大學醫學院第二附屬醫院兒科門診確診的兒童結核病患兒112例作為病例組，隨機選取同期在門診就診并診斷為肺部其他疾病的患兒58例、結核易罹患高危兒童60例以及體檢健康兒童60例作為對照組。兒童結核病組112例，其中男63例，女49例；年齡6個月～14歲，平均（6.8 ± 4.7）歲；診斷主要依據臨床表現、影像學、細菌學、病理學等檢查，并參照中華醫學會兒科學分會呼吸學組的《兒童肺結核的臨床診斷標準和治療方案》[3]排除其他疾病后確診，包括原發性肺結核32例，淋巴結結核28例，結核性胸膜炎24例，粟粒性肺結核15例，結核性腦膜炎7例，腸結核4例，骨關節結核1例，干酪性肺炎1例；110例患兒在出生后接種過卡介苗，所有結核病患兒均未進行過抗結核治療。非結核病組58例，其中男31例，女27例；年齡3個月～14歲，平均（6.5 ± 4.3）歲；均為由病原學、臨床表現、實驗室指標診斷，臨床排除結核感染的其他肺部疾病患兒，包括肺炎15例，上呼吸道感染32例，支氣管哮喘11例；所有患兒均接種過卡介苗。結核病易罹患高危組60例，為與活動性結核病患者有密切接觸史，但影像學檢查肺部無異常發現者，其中男35例，女25例；年齡3個月～14歲，平均（7.1 ± 4.4）歲；59例患兒接種過卡介苗。健康對照組60例，為從體檢健康兒童中隨機選取，排除對本試驗不合作者及影像學、實驗室檢查或臨床表現提示活動性病變者，其中男26例，女34例；年齡2個月～13歲，平均（6.2 ± 4.3）歲；均接種過卡介苗。
1.2 研究方法
各組均分別進行T-SPOT.TB、PPD皮試、TB-DOT、痰涂片抗酸染色、痰結核分枝桿菌培養，對檢測結果進行統計學比較、分析。同時對112例兒童結核病患者按菌陰/菌陽（菌陰肺結核指痰涂片及痰培養均陰性的肺結核患者，菌陽肺結核指痰涂片或痰培養任一結果陽性者）、肺內/肺外結核、正常免疫/免疫缺陷者的不同檢測結果進行組內分析、比較。
1.3 主要試劑和儀器
Baker生物安全柜（美國Baker公司生產）、Revco CO2孵育箱（日本三洋公司生產）。T-SPOT.TB試劑盒由北京萬泰生物藥業股份有限公司提供，淋巴細胞分離液、無血清培養基AIMV、RPMI1640培養液（美國Gibco公司生產）由上海復星長征醫學科學有限公司提供。TB-PPD試劑（結核菌素純蛋白衍生物的稀釋試劑）由成都生物制品研究所提供。TB-DOT試劑盒由上海鴻泰生物工程有限公司提供。抗酸染色試劑盒由湖南天騎醫學新技術有限公司提供。分枝桿菌培養添加劑試劑盒由碧迪醫療器械（上海）有限公司提供。DNM-9602G酶標分析儀由北京普朗新技術有限公司提供。實驗操作均嚴格按照試劑說明書規范進行。
1.4 結果判定
1.4.1 T-SPOT.TB結果判定
參照中國兒童結核病防治手冊[4]進行T-SPOT.TB結果判定，T-SPOT.TB的實驗結果常用每106個外周血單個核細胞（PBMC）中斑點形成細胞（SFC）數量來描述，24個SFC/106個PBMC為陽性：① 每孔細胞數共含PBMC 2.5×105個，每批試驗陰性對照孔SFC數量＜10個且陽性質控孔SFC≥20個時為實驗有效。② 當陰性對照孔斑點數為0～5個，測試孔斑點數減去陰性對照孔斑點數≥6個時，判斷為陽性；當陰性對照孔斑點數≥6個，測試孔斑點數必須≥2倍的陰性對照孔斑點數時判斷為陽性。③ 結果必須結合臨床及其他檢查綜合分析，以判斷為潛伏性感染或活動性結核病。
1.4.2 PPD皮試結果判定
在采血后用PPD皮試液5 U（0.1 mL） 注入研究對象左前臂掌側中下1/3交界處皮內，使之形成直徑約6～10 mm皮丘，72 h后觀察反應結果，以硬結縱橫徑記錄反應范圍，以平均直徑判斷反應強度[5]：① PPD皮試硬結≥5 mm可認為是陽性：與結核病患者有密切接觸；影像學發現有活動性肺結核表現；免疫功能低下；重癥結核病者。② PPD皮試硬結≥10 mm可認為是陽性：年齡＜4歲；伴有淋巴瘤、營養不良、腎衰竭等高危因素；出生在結核病高發區。③ 無以上任何因素而PPD皮試硬結≥15 mm的患兒都認為是陽性。④ PPD皮試硬結＜5 mm為陰性，一般來說，表明沒有受過結核分枝桿菌的感染，可以排除結核。
1.5 統計學方法
采用SPSS 11.0統計軟件，組間比較采用獨立樣本χ2檢驗，組內不同檢測方法陽性率或假陽性率的比較，采用配對χ2檢驗，檢驗水準α=0.05。多組間多重比較，根據組數調整檢驗水準。
2 結果
2.1 各組測試結果
在兒童結核病組中，T-SPOT.TB陽性率分別與PPD皮試、TB-DOT、痰涂片抗酸染色、痰結核分枝桿菌培養比較，其結果顯著高于其他檢測方法，差異有統計學意義（χ2=9.33，P＜0.01；χ2=81.71，P＜0.01；χ2=142.00，P＜0.01；χ2=101.71，P＜0.01）。在非結核病組，T-SPOT.TB的假陽性率為3.4%（2/58），較痰涂片、痰培養稍高，與TB-DOT對比無明顯差異（χ2=0.61，P＞0.05），但明顯低于PPD皮試的27.6%（χ2=12.89，P＜0.01）。在結核易罹患高危組，PPD的陽性率最高（43.3%），T-SPOT.TB的檢出率為25.0%，高于TB-DOT、痰涂片及痰培養，差異有統計學意義（P＜0.05）。在健康對照組，T-SPOT.TB的陽性率為5.0%，其特異度為95.0%，高于PPD皮試的71.7%，差異有統計學意義（χ2=11.76，P＜0.01），但與TB-DOT、痰涂片及痰培養對比無明顯差異（P＞0.05），見表 1。
表1
各組不同方法檢測陽性結果比較[例（%）]
2.2 兒童結核病組中菌陰/菌陽、肺內/肺外結核檢測結果陽性率比較
T-SPOT.TB在菌陰、菌陽、肺內、肺外結核病組的陽性率均在90%以上，差異無統計學意義（χ2=0.74，P＞0.0167）。在菌陰肺結核和菌陽肺結核組，T-SPOT.TB 的陽性率分別為90.5% （19/21）、96.3% （26/27），與PPD皮試結果相比，差異無統計學意義（χ2=0.25，P＞0.05；χ2=0.50，P＞0.05）；而在菌陰肺外結核組，T-SPOT.TB的陽性率（91.8%）高于PPD皮試的陽性率（73.8%），兩者有明顯差異（χ2=6.67，P＜0.01）。同TB-DOT相比，無論菌陰或菌陽，肺結核或肺外結核，T-SPOT.TB的陽性率均明顯高于TB-DOT，差異有統計學意義（χ2=10.08，P＜0.01；χ2=9.09，P＜0.01；χ2=38.10，P＜0.01）；菌陽肺外結核組因病例數量較少，無統計學意義。見表 2。
表2
痰菌陽性組與痰菌陰性組檢測陽性結果比較[例（%）]
2.3 兒童結核病組T-SPOT.TB結果與PPD皮試結果相關性比較
T-SPOT.TB與PPD皮試的相關性，隨著PPD反應強度增加呈明顯遞增趨勢。PPD皮試結果為陰性時，T-SPOT.TB的陽性率為83.3%（20/24）；PPD皮試結果為（+++）～（++++）時，T-SPOT.TB的陽性率為96.8% （30/31）；兩者總符合率為78.6%[（54+30+4）/112]。見表 3。
表3
兒童結核病組T-SPOT.TB試驗結果與PPD試驗結果相關性[例（%）]
2.4 兒童結核病組免疫缺陷人群與正常免疫人群T-SPOT.TB試驗結果分析
在免疫缺陷組及正常免疫組兒童結核病患者中，T-SPOT.TB的陽性率均高于PPD皮試，差異有統計學意義（P＜0.05）；T-SPOT.TB在免疫缺陷組和正常免疫組兒童結核病患者中的檢出率分別為82.6%和95.5%，兩者差異無統計學意義（χ2=2.85，P＞0.05），而PPD皮試在免疫缺陷組和正常免疫組兒童結核病患者中的檢出率分別為47.8%和86.5%，差異有統計學意義（χ2=14.03，P＜0.01）。見表 4。
表4
兒童結核病組免疫缺陷人群與正常免疫人群T-SPOT.TB同PPD皮試陽性結果比較[例（%）]
3 討論
兒童結核病是一原發感染，以原發性肺結核最為常見，臨床上往往缺乏典型癥狀和體征。目前其診斷主要依靠病史資料、影像學檢查、PPD皮試、病原學檢查等，方法有限且存在諸多不足，如影像學檢查缺乏特異性，結核菌素試驗易受卡介苗接種的影響因而假陽性率高，痰涂片或培養結核菌陽性率不高等，都限制了兒童結核病的及時發現和治療。
近年來，一種新型的免疫學檢測技術γ干擾素釋放試驗（IGRA）在國內外引起了廣泛的關注，并被逐步應用于臨床。該試驗以體外T細胞為基礎采用酶聯免疫斑點法（ELISPOT）技術從單細胞水平檢測分泌抗體細胞或分泌細胞因子細胞。IGRA技術的原理即在人體遭到結核分枝桿菌攻擊的時候，通過先天免疫系統的作用如巨噬細胞吞噬結核分枝桿菌，將細菌破壞消化產生的病原特異性蛋白的片段（抗原肽）通過與細胞的主要組織相容性復合體相結合表達于巨噬細胞表面，然后提呈給T淋巴細胞。首次感染結核桿菌后產生的記憶T淋巴細胞在人體內長期存在，當再次受到結核桿菌相關抗原刺激后，這些記憶T淋巴細胞迅速增殖成為效應T淋巴細胞。這些效應T淋巴細胞分泌γ干擾素和其他一些細胞因子來刺激T淋巴細胞增殖并可以激活巨噬細胞[6, 7]。由于這個過程是針對特異結核分枝桿菌免疫原得到反應，因此可以通過測定T細胞γ干擾素釋放反應來檢查患者是否受到結核分枝桿菌感染。
由ELISPOT發展來的T-SPOT.TB就是采用體外ELISPOT技術檢測早期分泌性抗原靶蛋白6（ESAT-6）和培養濾液蛋白10（CFP-10）兩個抗原刺激γ干擾素釋放的量來診斷是否存在結核感染。ESAT-6是從結核分枝桿菌Mtb短期培養濾液（SF-CF）中純化分離出的一種低相對分子質量的可溶性早期分泌性蛋白，不僅存在于培養物濾液中，還存在于結核桿菌的細胞質和細胞壁中，但不存在于細胞膜上。ESAT-6其編碼基因Rv3875位于RD1區，而RD1是卡介苗和Mtb毒株的基因組相比較的一組缺失序列，根據Swissprot和GenBank等數據庫資料分析，ESAT-6基因僅存在于Mtb復合群和4種非結核分枝桿菌（即堪薩斯分枝桿菌、海分枝桿菌、微黃分枝桿菌和蘇加分枝桿菌）基因組中，卡介苗和其他非結核桿菌缺失[8-10]。因此，ESAT-6檢測結核分枝桿菌感染的特異性較高；但EAST-6沒有信號肽序列，表明它可能是通過一種信號肽依賴形式分泌到細胞外，這種分泌方式可能效率不高，而激活B細胞需較大量的抗原，這也許是結核病患者中抗ESAT-6抗體水平不高的原因之一，從而影響了EAST-6的敏感性。CFP-10也是卡介苗所缺失的，其基因產物存在于結核分枝桿菌早期培養濾液中，是一種編碼100個氨基酸、具有免疫原性的分泌性蛋白。CFP-10與EAST-6位于同一基因簇上，都是由Mtb Ⅶ型（ESX-1）分泌系統分泌的蛋白，這兩種蛋白形成1︰1的二聚體結構，是Mtb重要的毒力因子，兩者分布相同，都是RD1區編碼的。ESAT-6和CFP-10作為結核分枝桿菌的特異性抗原，具有較強的Th（輔助性T細胞）表位[11]，既有T細胞抗原決定簇，又有B細胞抗原決定簇，因此能同時引起細胞免疫應答和體液免疫應答，并產生大量γ干擾素，且這種免疫反應貫穿于疾病的全過程。
本研究結果顯示，在112例兒童結核病患者中T-SPOT.TB陽性者104例（8例陰性者皆存在免疫缺陷或為重癥結核病患兒），其陽性率為92.9%，與其他實驗方法比較具有較高的靈敏度（P＞0.05），且無論在菌陰或菌陽、肺內或肺外結核病中，T-SPOT.TB均保持良好的靈敏度（P＞0.05），這與Nishimura等[12]的研究結論相同。在非結核病組，T-SPOT.TB的假陽性率僅為3.4%，具有較好的鑒別診斷價值，而PPD皮試假陽性率高達27.6%，其原因可能與卡介苗接種后的免疫效應及環境分枝桿菌間的交叉反應有關。在結核易罹患高危組中，PPD皮試陽性率最高，為43.3%，其次是T-SPOT.TB陽性率25.0%，明顯高于其他3種檢驗方法，但由于PPD皮試受卡介苗接種的影響，假陽性率高，其特異性較差，因此T-SPOT.TB在潛伏性結核感染（LTBI）的篩查方面可能更具優勢，這是因為LTBI體內擁有針對EAST-6和CFP-10抗原的特異性T淋巴細胞，能識別、遞呈這些抗原，并刺激T淋巴細胞增殖、釋放細胞因子γ干擾素。多個研究顯示IGRA預測潛伏結核病感染發展為活動性結核病的價值較PPD皮試更為可靠，尤其是對兒童，且其陽性結果與接觸時間呈正相關[13, 14]。本組T-SPOT.TB篩查陽性的15例高危潛伏性結核感染兒童在半年隨訪期內有13例發展成活動性結核病，這與前述研究結論相驗證[13, 14]。在健康對照組中，T-SPOT.TB的陽性率為5.0%，其特異度為95.0%，高于傳統的結核菌素試驗（P＜0.01），與結核抗體、痰涂片、痰培養比較，其特異度無明顯差異。
在與PPD皮試的相關性比較方面，T-SPOT.TB與PPD皮試結果具有較高的一致性，本研究中兒童結核病組T-SPOT.TB與PPD皮試兩者的總符合率為78.6%，尤其在PPD皮試（+++）以上的患兒中兩者的符合率達到了96.8%；而對于PPD皮試陰性者，T-SPOT.TB也有較高的檢出率，24例PPD皮試陰性結核病患兒中，20例T-SPOT.TB檢測陽性，檢出率達到83.3%，其原因可能是PPD皮試結果易受多種因素影響，尤其是在營養不良、免疫狀態低下或重癥結核病患兒中易出現假陰性結果，而T-SPOT.TB受機體免疫功能、年齡等因素的影響較小[15]，臨床檢出率更高，有助于減少兒童結核病漏診、誤診的幾率。
而在免疫缺陷患兒的診斷方面，T-SPOT.TB比傳統的PPD皮試等更具優勢，有更高的靈敏度，其原因可能為結核病患者大多存在細胞免疫功能減弱[16]，CD4+ T淋巴細胞減少，導致PPD反應減弱甚至無反應；而T-SPOT.TB所檢測的γ干擾素除由CD4+ T淋巴細胞產生外，CD8+ T淋巴細胞及自然殺傷細胞等也能產生，而結核病患者外周血CD8+ T淋巴細胞改變不明顯，故對T-SPOT.TB檢測結果影響較小，Brock等[17]研究認為只有當CD4+ T淋巴細胞數＜100個/μL 時，其靈敏度才會有所減低。
綜上所述，T-SPOT.TB在兒童結核病的診斷中有較高的靈敏度和特異度，尤其在菌陰結核、肺外結核及免疫缺陷患兒中較其他檢驗方法更具優勢，在潛伏性結核感染早期篩查方面也有較大價值，且受其他干擾因素影響較小，結果客觀、準確，對兒童結核病的早期快速診斷有良好的應用前景，值得臨床推廣應用。
兒童結核病是指年齡0～14歲期間發生的全身各器官的結核病，也是引起發展中國家兒童死亡的重要原因之一[1]。據世界衛生組織報告，全球每年新發結核病900萬例，其中兒童結核病約占10%；每年因結核病死亡200萬～300萬例，其中約有17萬兒童因患肺結核而死亡[2]。兒童結核病臨床診斷相對困難，若治療不及時，易發生血行播散而引起粟粒性肺結核和結核性腦膜炎等，致殘率和病死率高。本研究通過對112例兒童結核病患者和對照組分別進行結核感染T細胞試驗（T-SPOT.TB）、結核菌素純蛋白衍生物皮膚試驗（PPD皮試）、結核抗體檢測（TB-DOT）、痰涂片抗酸染色、痰結核分枝桿菌培養，對不同方法的檢測結果進行統計學分析，從而探討T-SPOT.TB在兒童結核病臨床診斷中的應用價值。
1 資料與方法
1.1 一般資料
選取2012年3月－12月在汕頭市結核病防治所門診和汕頭大學醫學院第二附屬醫院兒科門診確診的兒童結核病患兒112例作為病例組，隨機選取同期在門診就診并診斷為肺部其他疾病的患兒58例、結核易罹患高危兒童60例以及體檢健康兒童60例作為對照組。兒童結核病組112例，其中男63例，女49例；年齡6個月～14歲，平均（6.8 ± 4.7）歲；診斷主要依據臨床表現、影像學、細菌學、病理學等檢查，并參照中華醫學會兒科學分會呼吸學組的《兒童肺結核的臨床診斷標準和治療方案》[3]排除其他疾病后確診，包括原發性肺結核32例，淋巴結結核28例，結核性胸膜炎24例，粟粒性肺結核15例，結核性腦膜炎7例，腸結核4例，骨關節結核1例，干酪性肺炎1例；110例患兒在出生后接種過卡介苗，所有結核病患兒均未進行過抗結核治療。非結核病組58例，其中男31例，女27例；年齡3個月～14歲，平均（6.5 ± 4.3）歲；均為由病原學、臨床表現、實驗室指標診斷，臨床排除結核感染的其他肺部疾病患兒，包括肺炎15例，上呼吸道感染32例，支氣管哮喘11例；所有患兒均接種過卡介苗。結核病易罹患高危組60例，為與活動性結核病患者有密切接觸史，但影像學檢查肺部無異常發現者，其中男35例，女25例；年齡3個月～14歲，平均（7.1 ± 4.4）歲；59例患兒接種過卡介苗。健康對照組60例，為從體檢健康兒童中隨機選取，排除對本試驗不合作者及影像學、實驗室檢查或臨床表現提示活動性病變者，其中男26例，女34例；年齡2個月～13歲，平均（6.2 ± 4.3）歲；均接種過卡介苗。
1.2 研究方法
各組均分別進行T-SPOT.TB、PPD皮試、TB-DOT、痰涂片抗酸染色、痰結核分枝桿菌培養，對檢測結果進行統計學比較、分析。同時對112例兒童結核病患者按菌陰/菌陽（菌陰肺結核指痰涂片及痰培養均陰性的肺結核患者，菌陽肺結核指痰涂片或痰培養任一結果陽性者）、肺內/肺外結核、正常免疫/免疫缺陷者的不同檢測結果進行組內分析、比較。
1.3 主要試劑和儀器
Baker生物安全柜（美國Baker公司生產）、Revco CO2孵育箱（日本三洋公司生產）。T-SPOT.TB試劑盒由北京萬泰生物藥業股份有限公司提供，淋巴細胞分離液、無血清培養基AIMV、RPMI1640培養液（美國Gibco公司生產）由上海復星長征醫學科學有限公司提供。TB-PPD試劑（結核菌素純蛋白衍生物的稀釋試劑）由成都生物制品研究所提供。TB-DOT試劑盒由上海鴻泰生物工程有限公司提供。抗酸染色試劑盒由湖南天騎醫學新技術有限公司提供。分枝桿菌培養添加劑試劑盒由碧迪醫療器械（上海）有限公司提供。DNM-9602G酶標分析儀由北京普朗新技術有限公司提供。實驗操作均嚴格按照試劑說明書規范進行。
1.4 結果判定
1.4.1 T-SPOT.TB結果判定
參照中國兒童結核病防治手冊[4]進行T-SPOT.TB結果判定，T-SPOT.TB的實驗結果常用每106個外周血單個核細胞（PBMC）中斑點形成細胞（SFC）數量來描述，24個SFC/106個PBMC為陽性：① 每孔細胞數共含PBMC 2.5×105個，每批試驗陰性對照孔SFC數量＜10個且陽性質控孔SFC≥20個時為實驗有效。② 當陰性對照孔斑點數為0～5個，測試孔斑點數減去陰性對照孔斑點數≥6個時，判斷為陽性；當陰性對照孔斑點數≥6個，測試孔斑點數必須≥2倍的陰性對照孔斑點數時判斷為陽性。③ 結果必須結合臨床及其他檢查綜合分析，以判斷為潛伏性感染或活動性結核病。
1.4.2 PPD皮試結果判定
在采血后用PPD皮試液5 U（0.1 mL） 注入研究對象左前臂掌側中下1/3交界處皮內，使之形成直徑約6～10 mm皮丘，72 h后觀察反應結果，以硬結縱橫徑記錄反應范圍，以平均直徑判斷反應強度[5]：① PPD皮試硬結≥5 mm可認為是陽性：與結核病患者有密切接觸；影像學發現有活動性肺結核表現；免疫功能低下；重癥結核病者。② PPD皮試硬結≥10 mm可認為是陽性：年齡＜4歲；伴有淋巴瘤、營養不良、腎衰竭等高危因素；出生在結核病高發區。③ 無以上任何因素而PPD皮試硬結≥15 mm的患兒都認為是陽性。④ PPD皮試硬結＜5 mm為陰性，一般來說，表明沒有受過結核分枝桿菌的感染，可以排除結核。
1.5 統計學方法
采用SPSS 11.0統計軟件，組間比較采用獨立樣本χ2檢驗，組內不同檢測方法陽性率或假陽性率的比較，采用配對χ2檢驗，檢驗水準α=0.05。多組間多重比較，根據組數調整檢驗水準。
2 結果
2.1 各組測試結果
在兒童結核病組中，T-SPOT.TB陽性率分別與PPD皮試、TB-DOT、痰涂片抗酸染色、痰結核分枝桿菌培養比較，其結果顯著高于其他檢測方法，差異有統計學意義（χ2=9.33，P＜0.01；χ2=81.71，P＜0.01；χ2=142.00，P＜0.01；χ2=101.71，P＜0.01）。在非結核病組，T-SPOT.TB的假陽性率為3.4%（2/58），較痰涂片、痰培養稍高，與TB-DOT對比無明顯差異（χ2=0.61，P＞0.05），但明顯低于PPD皮試的27.6%（χ2=12.89，P＜0.01）。在結核易罹患高危組，PPD的陽性率最高（43.3%），T-SPOT.TB的檢出率為25.0%，高于TB-DOT、痰涂片及痰培養，差異有統計學意義（P＜0.05）。在健康對照組，T-SPOT.TB的陽性率為5.0%，其特異度為95.0%，高于PPD皮試的71.7%，差異有統計學意義（χ2=11.76，P＜0.01），但與TB-DOT、痰涂片及痰培養對比無明顯差異（P＞0.05），見表 1。
表1
各組不同方法檢測陽性結果比較[例（%）]
2.2 兒童結核病組中菌陰/菌陽、肺內/肺外結核檢測結果陽性率比較
T-SPOT.TB在菌陰、菌陽、肺內、肺外結核病組的陽性率均在90%以上，差異無統計學意義（χ2=0.74，P＞0.0167）。在菌陰肺結核和菌陽肺結核組，T-SPOT.TB 的陽性率分別為90.5% （19/21）、96.3% （26/27），與PPD皮試結果相比，差異無統計學意義（χ2=0.25，P＞0.05；χ2=0.50，P＞0.05）；而在菌陰肺外結核組，T-SPOT.TB的陽性率（91.8%）高于PPD皮試的陽性率（73.8%），兩者有明顯差異（χ2=6.67，P＜0.01）。同TB-DOT相比，無論菌陰或菌陽，肺結核或肺外結核，T-SPOT.TB的陽性率均明顯高于TB-DOT，差異有統計學意義（χ2=10.08，P＜0.01；χ2=9.09，P＜0.01；χ2=38.10，P＜0.01）；菌陽肺外結核組因病例數量較少，無統計學意義。見表 2。
表2
痰菌陽性組與痰菌陰性組檢測陽性結果比較[例（%）]
2.3 兒童結核病組T-SPOT.TB結果與PPD皮試結果相關性比較
T-SPOT.TB與PPD皮試的相關性，隨著PPD反應強度增加呈明顯遞增趨勢。PPD皮試結果為陰性時，T-SPOT.TB的陽性率為83.3%（20/24）；PPD皮試結果為（+++）～（++++）時，T-SPOT.TB的陽性率為96.8% （30/31）；兩者總符合率為78.6%[（54+30+4）/112]。見表 3。
表3
兒童結核病組T-SPOT.TB試驗結果與PPD試驗結果相關性[例（%）]
2.4 兒童結核病組免疫缺陷人群與正常免疫人群T-SPOT.TB試驗結果分析
在免疫缺陷組及正常免疫組兒童結核病患者中，T-SPOT.TB的陽性率均高于PPD皮試，差異有統計學意義（P＜0.05）；T-SPOT.TB在免疫缺陷組和正常免疫組兒童結核病患者中的檢出率分別為82.6%和95.5%，兩者差異無統計學意義（χ2=2.85，P＞0.05），而PPD皮試在免疫缺陷組和正常免疫組兒童結核病患者中的檢出率分別為47.8%和86.5%，差異有統計學意義（χ2=14.03，P＜0.01）。見表 4。
表4
兒童結核病組免疫缺陷人群與正常免疫人群T-SPOT.TB同PPD皮試陽性結果比較[例（%）]
3 討論
兒童結核病是一原發感染，以原發性肺結核最為常見，臨床上往往缺乏典型癥狀和體征。目前其診斷主要依靠病史資料、影像學檢查、PPD皮試、病原學檢查等，方法有限且存在諸多不足，如影像學檢查缺乏特異性，結核菌素試驗易受卡介苗接種的影響因而假陽性率高，痰涂片或培養結核菌陽性率不高等，都限制了兒童結核病的及時發現和治療。
近年來，一種新型的免疫學檢測技術γ干擾素釋放試驗（IGRA）在國內外引起了廣泛的關注，并被逐步應用于臨床。該試驗以體外T細胞為基礎采用酶聯免疫斑點法（ELISPOT）技術從單細胞水平檢測分泌抗體細胞或分泌細胞因子細胞。IGRA技術的原理即在人體遭到結核分枝桿菌攻擊的時候，通過先天免疫系統的作用如巨噬細胞吞噬結核分枝桿菌，將細菌破壞消化產生的病原特異性蛋白的片段（抗原肽）通過與細胞的主要組織相容性復合體相結合表達于巨噬細胞表面，然后提呈給T淋巴細胞。首次感染結核桿菌后產生的記憶T淋巴細胞在人體內長期存在，當再次受到結核桿菌相關抗原刺激后，這些記憶T淋巴細胞迅速增殖成為效應T淋巴細胞。這些效應T淋巴細胞分泌γ干擾素和其他一些細胞因子來刺激T淋巴細胞增殖并可以激活巨噬細胞[6, 7]。由于這個過程是針對特異結核分枝桿菌免疫原得到反應，因此可以通過測定T細胞γ干擾素釋放反應來檢查患者是否受到結核分枝桿菌感染。
由ELISPOT發展來的T-SPOT.TB就是采用體外ELISPOT技術檢測早期分泌性抗原靶蛋白6（ESAT-6）和培養濾液蛋白10（CFP-10）兩個抗原刺激γ干擾素釋放的量來診斷是否存在結核感染。ESAT-6是從結核分枝桿菌Mtb短期培養濾液（SF-CF）中純化分離出的一種低相對分子質量的可溶性早期分泌性蛋白，不僅存在于培養物濾液中，還存在于結核桿菌的細胞質和細胞壁中，但不存在于細胞膜上。ESAT-6其編碼基因Rv3875位于RD1區，而RD1是卡介苗和Mtb毒株的基因組相比較的一組缺失序列，根據Swissprot和GenBank等數據庫資料分析，ESAT-6基因僅存在于Mtb復合群和4種非結核分枝桿菌（即堪薩斯分枝桿菌、海分枝桿菌、微黃分枝桿菌和蘇加分枝桿菌）基因組中，卡介苗和其他非結核桿菌缺失[8-10]。因此，ESAT-6檢測結核分枝桿菌感染的特異性較高；但EAST-6沒有信號肽序列，表明它可能是通過一種信號肽依賴形式分泌到細胞外，這種分泌方式可能效率不高，而激活B細胞需較大量的抗原，這也許是結核病患者中抗ESAT-6抗體水平不高的原因之一，從而影響了EAST-6的敏感性。CFP-10也是卡介苗所缺失的，其基因產物存在于結核分枝桿菌早期培養濾液中，是一種編碼100個氨基酸、具有免疫原性的分泌性蛋白。CFP-10與EAST-6位于同一基因簇上，都是由Mtb Ⅶ型（ESX-1）分泌系統分泌的蛋白，這兩種蛋白形成1︰1的二聚體結構，是Mtb重要的毒力因子，兩者分布相同，都是RD1區編碼的。ESAT-6和CFP-10作為結核分枝桿菌的特異性抗原，具有較強的Th（輔助性T細胞）表位[11]，既有T細胞抗原決定簇，又有B細胞抗原決定簇，因此能同時引起細胞免疫應答和體液免疫應答，并產生大量γ干擾素，且這種免疫反應貫穿于疾病的全過程。
本研究結果顯示，在112例兒童結核病患者中T-SPOT.TB陽性者104例（8例陰性者皆存在免疫缺陷或為重癥結核病患兒），其陽性率為92.9%，與其他實驗方法比較具有較高的靈敏度（P＞0.05），且無論在菌陰或菌陽、肺內或肺外結核病中，T-SPOT.TB均保持良好的靈敏度（P＞0.05），這與Nishimura等[12]的研究結論相同。在非結核病組，T-SPOT.TB的假陽性率僅為3.4%，具有較好的鑒別診斷價值，而PPD皮試假陽性率高達27.6%，其原因可能與卡介苗接種后的免疫效應及環境分枝桿菌間的交叉反應有關。在結核易罹患高危組中，PPD皮試陽性率最高，為43.3%，其次是T-SPOT.TB陽性率25.0%，明顯高于其他3種檢驗方法，但由于PPD皮試受卡介苗接種的影響，假陽性率高，其特異性較差，因此T-SPOT.TB在潛伏性結核感染（LTBI）的篩查方面可能更具優勢，這是因為LTBI體內擁有針對EAST-6和CFP-10抗原的特異性T淋巴細胞，能識別、遞呈這些抗原，并刺激T淋巴細胞增殖、釋放細胞因子γ干擾素。多個研究顯示IGRA預測潛伏結核病感染發展為活動性結核病的價值較PPD皮試更為可靠，尤其是對兒童，且其陽性結果與接觸時間呈正相關[13, 14]。本組T-SPOT.TB篩查陽性的15例高危潛伏性結核感染兒童在半年隨訪期內有13例發展成活動性結核病，這與前述研究結論相驗證[13, 14]。在健康對照組中，T-SPOT.TB的陽性率為5.0%，其特異度為95.0%，高于傳統的結核菌素試驗（P＜0.01），與結核抗體、痰涂片、痰培養比較，其特異度無明顯差異。
在與PPD皮試的相關性比較方面，T-SPOT.TB與PPD皮試結果具有較高的一致性，本研究中兒童結核病組T-SPOT.TB與PPD皮試兩者的總符合率為78.6%，尤其在PPD皮試（+++）以上的患兒中兩者的符合率達到了96.8%；而對于PPD皮試陰性者，T-SPOT.TB也有較高的檢出率，24例PPD皮試陰性結核病患兒中，20例T-SPOT.TB檢測陽性，檢出率達到83.3%，其原因可能是PPD皮試結果易受多種因素影響，尤其是在營養不良、免疫狀態低下或重癥結核病患兒中易出現假陰性結果，而T-SPOT.TB受機體免疫功能、年齡等因素的影響較小[15]，臨床檢出率更高，有助于減少兒童結核病漏診、誤診的幾率。
而在免疫缺陷患兒的診斷方面，T-SPOT.TB比傳統的PPD皮試等更具優勢，有更高的靈敏度，其原因可能為結核病患者大多存在細胞免疫功能減弱[16]，CD4+ T淋巴細胞減少，導致PPD反應減弱甚至無反應；而T-SPOT.TB所檢測的γ干擾素除由CD4+ T淋巴細胞產生外，CD8+ T淋巴細胞及自然殺傷細胞等也能產生，而結核病患者外周血CD8+ T淋巴細胞改變不明顯，故對T-SPOT.TB檢測結果影響較小，Brock等[17]研究認為只有當CD4+ T淋巴細胞數＜100個/μL 時，其靈敏度才會有所減低。
綜上所述，T-SPOT.TB在兒童結核病的診斷中有較高的靈敏度和特異度，尤其在菌陰結核、肺外結核及免疫缺陷患兒中較其他檢驗方法更具優勢，在潛伏性結核感染早期篩查方面也有較大價值，且受其他干擾因素影響較小，結果客觀、準確，對兒童結核病的早期快速診斷有良好的應用前景，值得臨床推廣應用。
